【doc】散发型甲状腺髓样癌RET基因突变的研究

【doc】散发型甲状腺髓样癌RET基因突变的研究 散发型甲状腺髓样癌RET基因突变的研究 第28卷第6期吉林大学(医学版)Vo1.28No.6 2002年JournalofJilinUniversity(MedicineEdition)2002 [文章编号]167卜587x(2002)06—0618—03 散发型甲状腺髓样癌RET基因突变的研究 盖宝东,金仲田,森隆弘,张德恒,滕盛启成,里见进,郑泽霖 (1.吉林大学中日联谊医院基本外科,吉林长春130031;2.日本东北大学先进外科) [摘要]目的:研究散发型甲状腺髓样癌酪氨酸激酶受体基因(RET)的突变情况.:提取 17例中国人散发型甲状腺髓样癌基因组DNA,PCR扩增该基因第13外显子全部序列,纯化目的 基因DNA后直接序列测定.结果:分析测序图发现所有散发型甲状腺髓样癌在该基因的第18973 和18974位点之间均有一个乌嘌呤插入突变,插入突变位于该基因的第13外显子和内含子之间. 结论:此位点突变对酪氨酸激酶受体蛋白达的影响和在散发型甲状腺髓样癌的发生,发展过程中 所起的作用有待进一步研究. [关键词]甲状腺髓样癌;酪氨酸激酶受体基因;基因突变 [中图分类号]R736.202[文献标识码]A 甲状腺髓样癌(Medullarythyroidcarcinoma, MTC)起源于甲状腺分泌降钙索的滤泡旁细胞,占 甲状腺恶性肿瘤的,15,可呈家族型(fMTC) 或散发型(sMTC)起病.近年来国外的研究表明其 发病与酪氨酸激酶受体(Receptortyrosinekinases, RE7')基因突变关系密切.为研究中国人sMTC发 病与RE7'基因突变的关系,本文作者选定其 第13外显子为研究对象,发现在该基因的第18973 和18974位点之问均有一个鸟嘌呤插入突变,报道 如下. 1与方法 1.1材料 sMTC手术切除之标本17例,其中男6例,女 1l例,年龄15,75岁,平均42.12岁,所有病例均 无家族史.17例标本中石蜡包埋组织16例,新鲜肿 瘤组织1例.全部标本均经降钙素抗体免疫组织化 学染色及HE染色明确诊断. 1.2仪器与试剂 PCR仪(GENE人MPPCRSYSTEM9700), 自动序列分析仪(人BIPRISM3100GENETICAN— AIYZER),测序用荧光标记试剂盒(ABIPRISM BigDyeTerminatorCycleSequencingReadyReac— tionKitV2.0)均为美国AppliedBiosystems公司 产品;DUSerise600型分光光度计为美国BECK MAN公司产品;PCR反应试剂盒(TaKaRaEx Taq)为日本宝酒造株式会社产品;DNA纯化试剂 盒(QIAquickGelExtractionKit)为德国QIAGEN 公司产品;X174/Hinc?digestMarker及提取 DNA所需试剂为日本和光纯药工业株式会社产品; PCR反应引物由日本遗传子研究所合成,其碱基序 列如下:13F5一GTGCTGCATTTCAGAGAACGC一 3,13R5一AGAACAGGGCTGTATGGAGC一3. 1.3方法 1.3.1基因组DNA提取?石蜡包埋 sMTC组织DNA提取:石蜡包埋组织连续切片2张 (2.5p.m×1,10p.m×1),2.5p.m切片HE染色后显 微镜下观察肿瘤细胞区与非肿瘤细胞区界线,以细 针分开10p.m切片的肿瘤细胞区与非肿瘤细胞区, 将肿瘤细胞区切片置人1.5mlEppendorf管 (A管).加1ml二甲苯,置40?恒温水浴中以 80次/min振荡脱蜡2次,时问分别为2h和12h, 再以1ml无水乙醇漂洗切片2次,置75?水浴中 2Omin后离心去上清,真空干燥5rain至组织切片 完全干燥.加入细胞裂解液300~1(500g?ml-1蛋 白酶K,10mmo|?L_.Tris—HC1,140mmo|?IH1 NaC1,2mmo|?I-1EDTA,0.5SDS),置50?恒 [收稿日期]2001—11—2l [基金项目中日甲状腺疾病基础研究合作项目 [作者简介]盖宝东(1968一).男.吉林省长春市人.主治医师.医学博士.主要从事内 分泌外科研究. 盖宝东等散发型甲状腺髓样癌RE'I'基因突变的研究 温水浴中以40次/rain振荡12h.置95水浴中 10rain.加人300『』l苯酚/氯仿/异戊醇(体积比 25:24:1)混合液轻轻翻转10rain后13000r/rain 离心5rain,水相移至另外一个Eppendorf管 (B管).A管中加入300lTE缓冲液轻轻翻转 3rain后13000r/rain离心5rain,水相移至B管.B 管中加入等体积的氯仿/异戊醇(体积比24:1)混 合液轻轻翻转10rain后13000r/rain离心5rain. 上层水相移至另外一个Eppendor[管(C管).必要 时此步骤可重复1,2次.C管中加入3倍体积予冷 的无水乙醇及1/10体积的醋酸钠混均.20放置 15min后13000r/rain离心5rain,弃上清.加入预 冷的8O乙醇1ml轻轻翻转3rain后13000r/rain 离心5rain.弃上清,真空干燥后加入1O0lTE缓 冲液.分光光度计测量(,管中基因组DNA含量. ?新鲜sMTC组织DNA提取:常规酚抽提法提取 基因组DN八. 1.3.2PCR反应扩增目的基因25l反应 体系含:TaKaRaExTactDNA聚合酶0.1U,10× ExTaqBuffer(Mgfree)2.5l,2.0mmol?I0 MgC1:,dNTP各2.5mmol?I,,模板DNA 0.2g,引物各0.1/xmol?I.反应条件为94C变 性5rain后.以94(,3OS,6260S,72C30S循环 . t0次,最后72C延伸7min.以扩增正常甲状腺组 织DNA为阳性对照,双蒸水代替模板DNA为阴性 对照.之后以2.0的琼脂糖凝胶电泳检验PCR产 物中目的基因的扩增情况. 1.3.3回收目的基因DNA与Marker比 较,从琼脂糖凝胶中切取目的基因DN八条带处的 琼脂糖凝胶,按DNA纯化试剂盒(QIAquickGel ExtractionKit)操作手册提取琼脂糖凝胶中目的基 困.分光光度计检测纯化后目的基因DNA含量. 1.3.4目的基因DNA序列分析?PCR反 应荧光标记目的基因DNA:10l反应体系含目的 基因DNA2ng,BigDyeReadyReactionMix2肛l, 5×SequencingBuffer1l,正链引物1.6pmol. PCR反应条件:96变性10S后,以96C10S, oC5S,60C4rain循环2次.?荧光标记后PCR 产物的纯化:10lPCR产物中加入3tool?I醋 酸钠1l及95乙醇25l,混均后置室温下 15rain,15000r/rain离心20rain.彻底去除上清后 加入7O乙醇125l混均2rain,15000r/rain离 心5rain.彻底去除上清后真空干燥20rain,置20C 冰箱中备用.?碱基序列测定:按ABIPRISM3100 GENETICANAIYZER自动序列分析仪操作手册 操作,测定纯化后的荧光标记的目的基因DNA碱 基序列.为避免误差,以上实验均重复操作一次. 2结果 PCR扩增目的基因的长度为191bp,所有患者 的基因组DNA经PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳后, 与Marker比较均在约191bp处显示一条带,少数 病例电泳后在目的基因条带前出现引物二聚体条 带.分析DNA测序结果,发现所有病例在第13外 显子与内含子之间即该基因的第18973和18974位 点之间均有一个鸟嘌呤插入突变.其余位点未发现 突变,见图1. 3讨论 RET原癌基因位于常染色体1lql1.2上,长约 60000bp,至少含20个外显子,编码酪氨酸激酶受 体?.RE7'蛋白的信号肽由28个氨基酸组成,成熟 蛋白N端的疏水序列结合受体分子,细胞外区含 608个氨基酸,第636,657位的22个氨基酸组成 跨膜结构,此区富含Cys.第713位氨基酸的编码位 点是基因重排位点,胞内第726~999位氨基酸组成 酪氨酸激酶结构,为典型的TK结构.现已经发现 3种RE7同型蛋白,它们的N端1063个氨基酸均 相同,C末端各有9个,43个,51个氨基酸,分别命 名为RE7'9,E7143和RET51L2].目前RE'/"基因 的配体及其结构与功能还不十分清楚,但已知其与 配体结合后2个RET蛋白的跨膜区相结合才可以 使细胞外的信号传递到细胞内,继而完成其生理功 能.尺E丁蛋白的信号传递途径与其他膜蛋白受体的 信号传递途径相比亦较特殊,现在还不完全清 楚[3].研究表明RET基因突变与fMTC,sMTC, 多发内分泌肿瘤2A及2B型,先天性巨结肠等疾病 的发生关系密切C~-9].sMTCRET基因突变的研究 主要集中在该基因的第11,16外显子.对第13外显 子突变情况的研究较少,因此本文作者选择了该基 因的第13外显子为研究对象,以明确sMTC 第13外显子是否有基因突变. 本文作者采用PCR技术扩增了刚71基因第 18852至19042位点之问191bp的目的基因,其中 包含第13外显子的全部序列和部分第13内含子. 经序列测定发现与Genbank中正常碱基序列比较, 17例标本在该基因的第18973和18974位点之间 均有一个"G"插人突变,该位点位于第13外显子和 一 62O一吉林大学(医学版)2002年第28卷第6期 八脚? 唧腿八似 Fig.1ThemapofRETExonl3sequencing 第13内含子之间.本文作者认为此插入突变发生在 第13内含子的起始点处,其对RET蛋白表达的影 响及与sMTC发生,发展的关系有待进一步研究. [参考文献] [1]KwokJBJ,GardnerE,WarnerjP,eta1.Structuralanalysisof thehumanretproto—oncogenousingexontrapping[J]. Oncogene,1993.8:2575-2582. [2]PasiniB.CeccheriniI.RomeoG,eta1.RETmutationinhu— mandisease[J].TrendsGenet.1996.12:138—144. [3]TakahashiM.AsaiN.1washitaT.eta1.Characterizationof theretproto—oncogeneproductsexpressedinmouseLcells[J]. Oncogene.1993.8:2925—2929. [4jFantlWJ?JohnsonDE.WilliamsLT.eta1.Signallingbyrecep— tortyrosinekinases[J].AnnRevBiochem,1993,62:453—481. [53SantoroM,WongWT.ArocaP,eta1.Anepidermalgrowth StudyOnmutationof [6] [7] [8] [9] factorreceptor/retchimerageneratesmitogenicandtransform— ingsignals:evidenceforaret—specificsignalingpathway[J]. M0lCellBiol,l994,14:663—675. RaffaellaC,FabienneL,MinervaMA.eta1.RETrearrange— mentinfamilialpapillarythyroidcarcinomas[J].Cancer Letters,2001,17O:191—198. ChiefariE,RussoD,GiuffridaD,eta1.AnalysisofRETpro— to—oncogeneabnormalitiesinpatientswithMEN2A,MEN2B, familialorsporadicmedullarythyroidcarcinoma[J]. JEndocrinollnvest.1998,21:358—364. AttieT.PeletA,EderyP.eta1.DiversityofRETproto-onco— genemutationinfamilialandsporadicHirschsprungdisease [J].HumMolGenet,1995,4:1381—1386. 盖宝东,张德恒.甲状腺髓样癌基因研究进展[J].肿瘤学杂 志,2001,1:48—50. RETgeneinsporadic medullarythyroidcarcinoma GAIBao—dong,JINZhong—tian,TakahiroMori,ZHANGDe—heng, KeiseiFujimori.,SatomiSisumu.,ZHENGZe—lin (1.Dept.ofGeneralSurgery,China—JapanUnionHospital,ChangchunChina130031; 2.Dept.ofDivisionofAdvancedSurgicalandTechnology,TohokuUniversityJapan) [Abstract]Objective:Toexplorethemutationofreceptortyrosinekinase(RET)geneinsporadic medullarythyroidcarcinoma.Methods:GenomicDNAwasextractedfrom17sporadicmedullarythyroid carcinomasamples.Exon13ofretgenewasamplifiedbyPCR,analyzedbyautomaticDNAsequenceraf— terpurificationandcomparedwithnormalsequence.Results:AG— insertmutationwasfoundbetweenthe positionof18973and18974ineverytumorcase.Conclusion:Theroleofthepointgenemutationbetween exonandintron13needstobeinvestigatedfurthermore. [Keywords]sporadicmedullarythyroidcarcinoma;receptortyrosinekinase(RET);genemutation