【word】 贾第虫病分子生物学诊断方法及其应用

【word】 贾第虫病分子生物学诊断方法及其应用 贾第虫病分子生物学诊断方法及其应用 660 中国人兽共患病 ChineseJournalofZoonoses 文章编号:1002—2694(2011)07—0660—03 贾第虫病分子生物学诊断方法及其应用 商立民,金洪涛,刘全 中图分类号:$8559文献标识码:A 蓝氏贾第鞭毛虫病(giardiasis),简称贾第虫病, 是由蓝氏贾第鞭毛虫(Giardialamblia)引起的一 种以腹泻为主要症状的肠道疾病,也有人称蓝氏鞭 毛虫病(1ambliasis).因贾第虫病曾在国际旅游者 中流行,故又称为”旅游者腹泻”. 自20世纪70年代以来,在世界各地相继发生 了本病的流行或暴发流行,相关的研究也确认贾第 鞭毛虫是导致人类腹泻的最主要寄生性原虫,估计 每年导致约2.8亿人感染一.近年来,在艾滋病患 者中常发现有贾第虫的合并感染,在同性恋人群中 本病亦可互相传播,贾第虫已被认为是一种机会致 病性原虫,其重要性已引起各国重视.由于贾第虫 可感染人和多种野生动物及家养动物,故目前国际 上已将贾第虫病列人人兽共患寄生虫病. 贾第虫病呈全球性分布,据WHO估计,全世 界人群感染率约为1,20,其临床现复杂多 样,从急慢性腹泻,腹痛,恶心,呕吐,胃肠胀气到无 明显临床症状l2],极易与其他疾病相混淆,从而忽视 或延误了本病的治疗,因此快速,准确诊断对本病的 治疗和监控起着十分重要的作用,本文就贾第虫病 的分子生物学诊断方法及其应用加以综述. 1多聚酶链反应(PCR) 对贾第虫进行鉴定和基因分型的靶基因主要 有:小亚单位rRNA基因(SSU—rRNA),B贾第素基 因(J3一giardin),谷氨酸脱氢酶基因(gdh),一延伸因 子1基因(ef一1),磷酸丙糖异构酶基因(tpi)等. Rebecca等应用PCR方法检测贾第虫小亚单位rD— NA基因和传统的检测方法对曼谷204份人粪便和 229份犬粪便进行检测比较,结果显示PCR方法具 有较高的特异性和敏感性.通过对上述贾第虫特 定基因的扩增和序列分析,比较其基因片段的特异 性,对贾第虫进行分型,将其分为了7个有效聚集 体,即聚集体(A—G).Erica等对从灰海豹粪便中提 取贾第虫基因组,用谷氨酸脱氢酶基因(gdh)进行 分型鉴定,在原有的七种聚集体之外发现了第八种 通讯作者:刘全,Email:liuquan1973@hotmail.COFll 作者单位:军事医学科学院军事兽医研究所,吉林省人兽共患病预 防与控制重点实验室,长春l30122 聚集体,即集聚体H,这种新聚集体的发现说明贾 第虫具有更为丰富的遗传多样性和更为广泛的宿主 范围. 2实时荧光定量PCR(Real—timePCR) Real—timePCR方法能够对特异核酸扩增的全 过程进行连续的实时监测,能够测定样品起始 的核酸含量,从而对样品中含有的虫体数量进行定 量检测.此外,相对于传统的PCR方法Real—time PCR具有更高的敏感性,而且能够在闭合管内进行 高通量分析,无需对扩增产物进行电泳分析,避免了 样品污染的可能一. Adriana等用Real—timePCR法与传统的镜检 和抗原检测方法对意大利疑似肠道寄生虫感染的 771份患者粪便样品进行检测,与传统方法相比较 Real—timePCR具有100的特异性和敏感性[7]. Verweij等用Real—timePCR方法对贾第虫小亚单 位rRNA基因进行扩增检测,对104份已知含有贾 第虫包囊的粪便标本检测,102份阳性,特异性达到 98.1;对贾第虫抗原阳性的粪便标本进行检测亦 呈阳性].Binz等应用探针法荧光定量PCR技术 能够检测出0.8个贾第虫滋养体,具有较高的特异 性和敏感性. 3反转录PCR(RT.PCR) 尽管常规PCR方法对样本中存在的贾第虫检 测具有高度的特异性和敏感性,但不能区分包囊是 否具有活性和感染力,因此在对环境样品检测时,需 要建立一种特异的方法来检测环境中样本是否含有 有活性的包囊,由于RT—PCR依赖于mRNA的完 整性,而mRNA的半衰期通常较短,因此完整的 mRNA即可证实活性包囊的存在.应用RT—PCR 方法检测贾第虫mRNA即可检出样品中是否含有 活性包囊.由于包囊在热应激条件下可大量合成热 休克蛋白(hsp)70,因此RT—PCR通常将热休克蛋 白(hsp)70作为目的基因进行检测,能够增加检测 活性包囊的敏感性.. Gyu—Cheol等针对贾第虫的热休克蛋白(hsp) 7O基因设计特异的引物对水生系统中有活性的包 囊进行检测,检测的敏感性可达到1个包囊 7期商立民等:贾第虫病分子生物学诊断方法及其应用661 lOOpI,在热应激的条件下检测的敏感性可以增加 1000倍,这种检测的高敏感性在检测环境样品中是 否含有活性的包囊具有重要意义ll. 4多重PCR(multiplexPCR) 多重PCR是通过在同一PCR反应体系里加上 二对以上引物,同时扩增出多个核酸片段的PCR反 应,可以对多种致病因子进行鉴定和检测,具有高效 性,经济性和简便性等特点[1. StarkD等应用多重PCR技术与real—time PCR(RT—PCR)相比较用来检测包括贾第虫在内的 4种常见的致病原虫,发现多重PCR与RT—PCR的 符合率达到100,而且多重PCR具有很高的特异 性和敏感性,没有交叉反应发生[=1.TaniuchiM等 应用多重PCR技术对肠道寄生虫检测的敏感性和 特异性分别为83和1()0,故可用此方法对肠道 寄生虫进行筛选_l. 5基因芯片技术(microarray) 基因芯片技术(microarray)是指将成千上万 DNA克隆片段或寡核苷酸片段固定在固体表面(玻 璃片或尼龙膜)上,用荧光或其他标记的mRNA, cDNA或基因组DNA探针进行杂交,从而同时快 速检测多个基因表达状况,进行DNA分析等的一 种技术,其基本原理是基于Southern杂交或斑点杂 交技术.基因芯片技术应用于基因表达水平检测的 最大优越性是可自动,快速检测目的材料中成千上 万个基因的表达情况. Dae—Young等研制了针对小亚基rRNA基因 检测包括贾第虫在内的三种原虫基因芯片技术,其 检测的敏感性可达到5O个包囊/次,该技术能够避 免环境样品中存在的PCR抑制剂对PCR检测的影 响,具有很好的特异性,不与非靶基因发生交叉反应 也无假阴性反应_l.Wang等研制的寡核苷酸徽阵 列技术不仅能够对贾第虫进行检测,而且还能对其 进行基因分型,其高度的敏感性和特异性为大量临 床和环境样品的检测和基因分型提供了一种行之有 效的方法[. 6荧光原位杂交(FISH) 荧光原位杂交技术的基本原理是应用荧光标记 的核酸探针与同源互补的靶DNA经变性一退火一复 性,形成靶DNA与核酸探针的杂交体,经荧光检测 体系在镜下对待测DNA进行定性,定量或相对定 位分析. I.emos等用FISH方法与贾第虫18SrRNA进 行杂交对贾第虫进行检测,Dorsch等针对贾第虫 16SrRNA设计的荧光标记的寡核苷酸探针,利用 rRNA只在有活性的包囊中高效表达的特性,对贾 第虫有活性的包囊进行检测…j,Graczyk等将荧光 原位杂交技术与针对贾第虫细胞壁抗原簇的 FITC标记的单克隆抗体技术相结合,能够对贾第 虫有活性的单个包囊进行检测l】. 7环介导等温扩增(LAMP) 环介导等温扩增技术是针对靶基因的6个区域 设计4条特异引物,在具有链置换活性功能的DNA 聚合酶的作用下实现等温条件下DNA分子的核酸 扩增技术,该方法具有特异性高,操作方便等 特点[2. NagoTT等应用I.AMP技术对贾第虫病患者 的粪便样本进行检测,结果显示检测敏感性为84 (16/19),能够检出的最少虫体数可达到3.12×1o. 个,相对于传统的镜检方法敏感性提高了400倍以 上,从而为临床样本的检测提供了一种高敏感性和 准确性的方法_2. 8展望 分子生物学技术为贾第虫的快速诊断提供了一 个平台,各种检测方法的应用使我们对贾第虫的生 物学有了更进一步的认识.视检测目的不同,采用 不同的检测方法,PCR方法可以对贾第虫进行检 测,基因分型和流行病学调查,Real—timePCR可对 环境样品贾第虫含量进行定量分析,RT—PCR主要 是对环境样品中含有的包囊进行活性和感染力的检 测,多重PCR可同时检测多种寄生虫,基因芯片技 术可同时对多个不同的目的基因进行检测等.随着 分子生物学的迅速发展以及其在贾第虫方面的广泛 应用,将有助于对贾第虫的宿主特异性,传播途径和 流行趋势等方面有更好的了解. 参考文献: [1]Geurden,Jozef,Edwin.IsGiardiaasignificantpathogeninpro ductionanimals[J].ExpParasitol,2O10,l24:98106. 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