猪口蹄疫O型合成肽疫苗抗原多肽的串联表达及活性鉴定

猪口蹄疫O型合成肽疫苗抗原多肽的串联表达及活性鉴定 猪口蹄疫O型合成肽疫苗抗原多肽的串联 表达及活性鉴定 河南农业科学,2011,40(10):126—130 JournalofHenanAgriculturalSciences 猪口蹄疫.型合成肽疫苗抗原多肽的 串联表达及活性鉴定 卢清侠,郭军庆,郝慧芳,杨苏珍,邢广旭,杨继飞,王世红,张改平 (河南省农业科学院农业部动物免疫学重点实验室/河南省动物免疫学重点实验室,河南郑州450002) 摘要:为获得含合成肽疫苗抗原多肽的重组表达蛋白,根据猪口蹄疫O型合成肽疫苗中抗原多肽 的氨基酸序列,使用大肠杆菌偏好性密码子人工合成该抗原多肽的双拷贝基因序列,并克隆至表达 载体pET32a中,构建原核表达质粒pET32a—P2.将重组质粒转化BI21(DE3),经IPTG诱导表 达,收集诱导的茵液进行sDS—PAGE电泳和Western—blot.结果显示,在分子量27kD处 有1条明显的蛋白表达条带,且能被O型FMDV阳性血清识别.对表达产物进行可溶性分析,结 果显示,表达蛋白几乎全部以可溶形式存在.表达蛋白经Ni—NTA树脂亲和纯化,SDS—PAGE 显示纯化的目的蛋白在27kD处有单一目的条带,具有较高的纯度.EIISA检测结果显示,纯化 的重组蛋白具有较高的活性.结果表明,该抗原多肽的双拷贝串联重复序列在大肠杆菌中得到了 可溶性高效表达,为开发诊断试剂和基因疫苗奠定了基础. 关键词:猪口蹄疫;合成肽疫苗;抗原多肽;串联表达;蛋白纯化;活性鉴定 中图分类号:$852.65文献标识码:A文章编号:1004—3268(2011)10—0126—05 TandemExpressionandActivityAnalysisofAntigenPeptideof outhDisease(TypeO)SyntheticPeptideVaccine LUQing—xia,GUOJun—qing,HAOHui—fang,YANGSu—zhen, XINGGuang—XU,YANGJi—fei,WANGShi—hong,ZHANGGaiping (KeyLaboratoryofAnimalImmunologyoftheMinistryofAgriculture/HenanProvincialKeyLaborato ryof AnimalImmunology,HenanAcademyofAgriculturalSciences,Zhengzhou450002,China) Abstract:Inordertogettherecombinationproteinwhichcontainedantigenpeptideofsynthetic peptidevaccine,two—copygenewassynthesizedusingE.colioptimalcodonsaccordingtotheami— noacidsequenceofantigenpeptide.TherecombinantexpressionvectorpET32a—P2wasconstruc— tedbycloningtwo—copygeneofantigenpeptideintotheprokaryoticexpressionplasmidpET32a. TheBI2l(DE3)wastransformedwithpET32a—P2.andtheproteincorrespondingtoP2genewas expressedafterinductionwithIPTG.SDS—PAGEandWestern—blotwiththeproductofbacterial cultureinductionwithIPTGshowedthatthemolecularmassoftheproteinwasapproximately 27kD,whichwasidentifiedbypositiveseraofFMDVserotypeO.Thesolubleanalysisshowed thattherecombinationproteinwasalmostsolublyexpressed.TheproteinwaspurifiedbyNi— NTAresinsandassayedbyELISA,andtheresultsshowedthatitdemonstratedhighpurityand activity.Sotherecombinationproteinwhichcontainedantigenpeptideofsyntheticpeptidevaccine 收稿日期:2011—06—12 基金项目:国家”863”计划(2007AA100606);中国博士后科学基金面上资助项目 (20110491000) 作者简介:卢清侠(1982一),女,山西侯马人,助理研究员,博士,主要从事动物病毒学与免疫学 研究. E—mail:luqingxia82@163.eom *通讯作者:张改平(1960一),男,河南内黄人,中国工程院院士,研究员,博士,博士生导师,主要 从事动物免疫学与动物疫病 快速诊断研究.E—mail:zhanggaiping2OO3@yahoo.corn.en 第10期卢清侠等:猪口蹄疫O型合成肽疫苗抗原多肽的串联表达及活性鉴定127 wasexpressedsolublyandefficientlyinE.coli,andthepurifiedproteincouldbedevelopedas diagnosisantigenorvaccine. Keywords:Swinefootandmouthdisease;Syntheticpeptidevaccine;Antigenpeptide;Tandem expression;Proteinpurification;Activityanalysis 口蹄疫(footandmouthdisease,FMD)是由口 蹄疫病毒(footandmouthdiseasevirus,FMDV)引 起的一种急性,热性和高度接触性的烈性传染病,主 要侵害偶蹄兽,偶见于人和其他动物,传播迅速,感 染率高.一旦发病,极易形成暴发大流行,发病率几 乎达100,不易控制和消灭[1_3l.该病在世界上许 多国家和地区都有流行与发生,严重威胁全球畜牧 业的发展,造成了巨大的经济损失_2],因此,国际兽 疫局(OIE)将其列为A类传染病之首.FMDV属 于小RNA病毒科口蹄疫病毒属,病毒粒子包含单 股正链RNA和衣壳蛋白两部分,无囊膜r4].衣壳 含有4种结构蛋白,分别为VP1,VP2,VP3和 VP4,其中VPI蛋白上存在主要的抗原表位,能诱 导感染动物产生中和抗体,它暴露于病毒颗粒的表 面,易发生变异,在分子流行病学调查,疫源追踪,毒 株分型,基因工程疫苗研制,诊断方法建立等方面具 有较重要的学术价值和现实意义?5]. 目前已知口蹄疫病毒在全世界分为7个血清 型,即O,A,C,SAT1,SAT2,SAT3(南非1,2,3型) 以及AsiaI(亚洲工型),彼此间均无交叉免疫保 护,其中我国以O型为主.许多国家特别是发展中 国家目前采取以疫苗免疫为主的综合性防控措施来 预防和控制口蹄疫_7].猪口蹄疫O型合成肽疫苗 相对于传统疫苗具有免疫谱广,免疫持续期长,生物 安全性好,免疫副作用小等优点,能够很好地预防猪 O型口蹄疫的发生,得到了较好的推广应用l8. 该疫苗使用固相多肽合成技术在体外人工合成含有 FMDV主要抗原位点的多肽(VP1中129—169位 氨基酸序列),并连接可激活辅助性T细胞的短肽, 以此作为免疫原与进口佐剂混合乳化制成.疫苗设 计的抗原序列覆盖了众多O型毒株的抗原位点序 列,谱性更广,具备覆盖其他O型口蹄疫病毒流行 毒株抗原的能力E12].本研究运用基因工程方法对 口蹄疫O型合成肽疫苗中抗原多肽序列进行串联 表达,并纯化表达产物对其活性进行鉴定,为进一步 研制安全,高效,广谱的口蹄疫新型基因工程疫苗和 诊断试剂盒奠定基础. 1和方法 1.1试剂 表达载体pET32a和BL21(DE3)菌种由河南省 动物免疫学重点实验室保存.ExTaqDNA聚合酶, 限制性内切酶,T4DNA连接酶购自TaKaRa公司, 口蹄疫阴,阳性豚鼠血清购自兰州兽医研究所,辣根 过氧化物酶(HRP)标记的兔抗豚鼠IgG抗体购自 Sigma公司,其他试剂均为分析纯.DNA凝胶回收试 剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司(上海 生工),质粒小量抽提试剂盒购自TIANGEN有限公 司,Ni—NTAHis?Bind~Resins购自Novagen公司. 1.2抗原多肽双拷贝基因的合成及质粒构建 根据猪口蹄疫O型合成肽疫苗中主要抗原位 点的氨基酸序列(VP1中129,169位氨基酸序 列),该抗原多肽的双拷贝串联重复序列(P2), 以增强其抗原性.使用大肠杆菌偏好性密码子设计 并优化P2的核酸序列,在序列两端分别加酶切位 点BamH工和HindIll,并委托上海生工合成该目 标基因序列,共276bp.使用BamHI和Hind?双 酶切消化目标基因片段,并克隆到pUC57载体上, 构建含合成肽疫苗肽段(VP1中129—169位氨基 酸序列)双拷贝基因片段的质粒pUC57一P2.经酶 切鉴定筛选阳性质粒,由上海生工测序. 1.3原核表达质粒的构建与鉴定 使用BamHI和Hind?将基因片段从 pUC57一P2质粒上切下,并克隆到pET32a表达载 体中构建重组质粒,将其命名为pET32a—P2,经 PCR,酶切分析和测序验证. 1.4重组蛋白的诱导表达 原核表达质粒pET32a—P2经酶切鉴定及测序 正确后,转化BL21(DE3)感受态菌.挑取阳性重组菌 落,在含有氨苄青霉素的LB培养基中培养至OD6.. 达到0.5时,加入终浓度为1mmol/L的IPTG,37? 下进行诱导表达.收集IPTG诱导前和诱导后6h的 菌液各1mL,用于SDS—PAGE电泳鉴定. 1.5表达产物的检测 1.5.1SDS—PAGE检测将收集的菌液离心,收 获细菌沉淀.在沉淀中加人1×SDS加样缓冲液, 煮沸处理10min,室温10000r/min离心10min. 取10”L上清进行电泳,电泳浓缩胶为5,分离胶 为12.电泳结束后使用考马斯亮蓝R250染色液 染色,并脱色观察结果. 1.5.2可溶性分析将诱导表达的菌体收集后,于 128河南农业科学第4O卷 冰浴上进行超声破碎,超声时间5S,间隔时间10S, 功率200W,超声次数60次,4?12000r/min离心 20min,取上清和沉淀用于SDS—PAGE分析. 1.5.3Western—blot检测IPTG诱导的 pET32a—P2全菌和未诱导全菌进行SDS—PAGE 后,将电泳分离的蛋白带电转到PVDF膜上,使用 5的脱脂奶粉封闭过夜,以PBST充分洗涤,加 100倍稀释的豚鼠O型FMDV阳性血清,37?孵育 1h,PBST洗涤6次,3min/次,再加1:2000稀释 的HRP标记的兔抗豚鼠IgG,37?孵育1h,PBST 洗涤6次,3min/次,以DAB显色,用水冲洗终止显 色反应,观察特异性条带. 1.6表达蛋白的纯化 按照Novagen公司的Ni—NTAHis?Bind@ Resins书进行操作.将Ni—NTA树脂装入合 适的层析柱,用10倍柱体积的Ni—NTABind Buffer(300mmol/LNaC1,50mmol/Lsodiumphos— phatebuffer,10mmol/L咪唑,pH8.0)平衡亲和 柱.将表达菌超声破碎,离心后取上清组分加到层 析柱中,用1O倍柱体积的Ni—NTABindBuffer洗 去层析柱中未结合蛋白,再用1O倍柱体积的Ni— NTAWashBuffer(300mmol/LNaC1,50mmol/L sodiumphosphatebuffer,20mmol/L咪唑,pH8.O) 洗去层析柱中非特异性结合的杂蛋白,最后用5倍 柱体积含250mmol/L咪唑的Ni—NTAElute Buffer(300mmol/LNaC1,5Ommol/Lsodiumphos— phatebuffer,250mmol/L咪唑,pH8.0)洗脱蛋白, 收集洗脱液.全程流速控制在0.5,1mL/min.将 洗脱的蛋白装入透析袋中,使用PBS透析去除咪 唑,一20?冻存备用.取10L纯化的蛋白加入等 体积的2×SDS加样缓冲液,煮沸处理10min,室温 10000r/min离心10min后取上清进行电泳,并观 察蛋白纯化效果. 1.7重组蛋白活性的鉴定 以2ffg/mL的P2重组蛋白包被酶标板,用5 脱脂奶粉封闭.加入倍比稀释(1:50,1:128OO) 的豚鼠抗O型FMDV血清,同时设阴性血清对照, 37?孵育30rain,PBST洗涤6次,再加入1:1000 稀释的HRP标记的兔抗豚鼠IgG,37?孵育 15min,PBST洗涤6次,显色后测OD.值,分析纯 化蛋白的活性. 2结果与分析 2.1含双拷贝基因的质粒构建与鉴定结果 将合成的P2基因片段酶切回收后,克隆到 pUC57载体上,获得重组质粒pUC57一P2,并进行 酶切鉴定.酶切产物经1琼脂糖凝胶电泳检测可 见276bp左右的目的片段(图1),与预期大小一致. 测序结果与设计的目标基因序列完全一致. 19329 6223 4254 2690 l489 925 421 M.—EeoT14IdigestDNAMarker;1.pUC57一P2酶切鉴定结果 图1重组质粒pUC57一P2的酶切鉴定结果 2.2原核表达质粒的构建与鉴定结果 将P2基因片段酶切回收后,与原核表达载体 pET32a进行连接,获得原核表达质粒pET32a— P2.连接产物转化BL21(DE3)感受态细胞后,挑取 单菌落培养,提取质粒,进行PCR鉴定和酶切鉴定. 电泳结果显示,以重组质粒为模板扩增得到276bp 左右的目的片段(图2);重组质粒酶切后得到预期 的276bp左右的目的片段和5900bp左右的载体片 段(图3),初步鉴定为阳性克隆.将鉴定的阳性克 隆送至上海生工测序,得到了读码框序列正确的原 核表达质粒pET32a—P2. 2000 l000 750 500 250 1OO M.DNAMarkerDL2000;1,2.P2基因PCR扩增产物 图2重组质粒pET32a—P2的PCR鉴定结果 2.3重组蛋白的诱导表达及可溶性分析结果 含pET32a—P2质粒的阳性克隆菌以1mmol/L IPTG诱导表达6h后进行SDS—PAGE电泳,结果 如图4所示.经考马斯亮蓝染色后,可观察到在相 对分子质量约27kD处有明显的蛋白表达条带,与 预计的目的蛋白大小相符(图4).超声波裂解诱导 第1O期卢清侠等:猪口蹄疫O型合成肽疫苗抗原多肽的串联表达及活性鉴定129 表达菌体,对表达蛋白进行可溶性分析,结果显示, 表达蛋白几乎全部以可溶形式存在(图4). MllM2 2000 1000 750 500 250 100 M.DNAMarkerDL2000;1.pET32a—P2酶切产物 图3重组质粒pET32a—P2的酶切鉴定结果 66.2 43.0 31.0 20.1 14.4 M.蛋白质Marker;l_IPTG未诱导;2.IPTG 诱导表达6h;3.超声后上清;4.超声后沉淀 图4IPTG诱导重组蛋白表达及可溶性分析结果 2.4重组蛋白表达产物的Western—blot鉴定 以豚鼠O型FMDV阳性血清对表达产物进行 Western—blot鉴定,结果在表达蛋白的位置出现明 显的颜色反应条带,表明重组表达产物可被特异性 抗体所识别,为预期的目的蛋白(图5). 3?5 3 2?5 2 0 1?5 1 0?5 0 M.蛋白质Marker;1.IPTG未诱导西液;2.IPTG诱导菌}便 图5P2表达产物的Western—blot鉴定结果 2.5纯化蛋白的SDS—PAGE鉴定 对纯化的P2重组蛋白进行SDS—PAGE电泳 鉴定,如图6所示,在:27kD处出现单一蛋白条带, 无明显杂蛋白,表明使用Ni—NTA树脂纯化可以 得到纯度较好的P2重组蛋白. kD 97.4 66.2 43.0 M.蛋白质Marker;1—4.纯化的P2重组蛋白 图6纯化后P2重组蛋白的SDS—PAGE电泳鉴定 2.6ELISA检测P2重组蛋白的活性 以2”g/mL的P2重组蛋白包被酶标板,当血 清1:l600稀释时,阳性血清OD值在1.5左右,阴 性血清0D值在O.1以下.随着稀释度的增加,OD 值呈下降的趋势(图7). 1:501:l00l:200l:400l:800l:l6001:32001:64001:2800l:25600 』血清稀释度 图7P2纯化蛋白的ELISA检测结果 加H H94 13O河南农业科学第40卷 3讨论参考文献 口蹄疫流行给全球畜牧业带来严重危害,目前发 达国家实行”扑杀为主,经济补偿”的综合防控措施, 发展中国家由于受经济社会条件的限制,主要采取以 免疫为主的综合防控措施_7].FMDV抗原变异频繁, 亚型之间的抗原差异性也很大,因此往往造成诊断困 难与免疫失败.国内外对FMDV的分子流行病学研 究广泛关注,可为合理选择疫苗毒株,制备诊断抗原 以及新型疫苗的研制提供理论和实践基础. 我国以O型口蹄疫为主,近年来口蹄疫O型合 成肽疫苗凭借其高效广谱的免疫力,稳定的产品质 量等独特优势,已逐步占据主要市场,推广应用效果 显着.该疫苗含有覆盖众多O型毒株的FMDV主 要抗原位点,即VP1中129—169位氨基酸序列. 现有研究表明,VP1是诱导产生中和抗体的主要成 分,在免疫反应中发挥着重要作用,其中140—160 位(G—H环)肽段是主要的抗原位点口..使用 FMDVO1VP1141—160区域合成肽的KLH连接 物,以小免疫剂量免疫豚鼠可激发豚鼠免疫系统的 特异性血清中和抗体反应.当141—160肽与无免 疫原性载体连接时也可诱发中和抗体反应_1引.此 外,146—156位氨基酸序列对于诱导病毒中和抗体 极为重要,拓展序列137—160区段可进一步促进该 反应_1.值得注意的是,135—144区域短肽以串联 二聚体或三聚体形式存在时,不需与载体连接即可 引起小鼠强烈的中和抗体反应及坚实的抗病毒攻击 保护性. 大肠杆菌表达系统是目前最常用的外源蛋白表 达系统,具有遗传背景清晰,生长周期短,培养经济, 表达水平高,待选载体和宿主广泛,操作简便等优 点_】..蛋白质可溶性表达的优点在于纯化方便, 避免蛋白酶降解,保持蛋白N端氨基酸序列和蛋白 结构的正确性.本研究根据猪口蹄疫O型合成肽 疫苗中主要抗原位点的氨基酸序列(VP1129,169 位),使用大肠杆菌偏好性密码子人工合成该抗原多 肽的双拷贝基因序列,运用原核表达载体pET32a 对该抗原多肽进行串联表达.经SDS—PAGE和 Western—blot检测,结果表明,该抗原多肽的双拷 贝序列在大肠杆菌中得到了可溶性高效表达.经过 纯化的重组蛋白活性较好,能够被O型FMDV阳 性血清识别,具有良好的反应性,因此可将该蛋白作 为包被抗原,开发O型FMDV抗体ELISA检测试 剂盒,为进一步研制安全,高效,广谱的口蹄疫新型 基因工程疫苗和诊断试剂盒奠定了基础. 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