阴沟肠杆菌高产AmpC酶基因检测及分子流行病学研究

阴沟肠杆菌高产AmpC酶基因检测及分子流行病学研究 阴沟肠杆菌高产AmpC酶基因检测及分子流行病学研究 作者: 杨绍敏 胡大春 邵剑春 李超 苏平 “【摘要】 目的 研究医院阴沟肠杆菌高产AmpC酶及分子流行病学特征。方法 采用KB法药敏试验，双纸片增效试验和酶提取物 三维试验检测阴沟肠杆菌高产AmpC酶，聚合酶链反应检测AmpC酶基因、ERIC重复序列rep PCR，研究昆明市第一人民医院2017年7月,2017年12月临床分 离的84株阴沟肠杆菌的耐药性、AmpC酶基因型和克隆传播状况。结果 型初筛试验和ESBLs确认试验，高产AmpC酶检出率为27.38%(23/84)，ESBLs检出率16.67%(14/84)，同时高产AmpC酶和ESBLs检出率44.05%(37/84)。AmpC酶基因 检出率43.75%(28/64)。三维试验高产AmpC酶检出率为47.62%(40/84)。克隆传播分析，结果发现菌株编号EC2和EC 11、EC13和EC 14、EC19和EC20分别具有相同的DNA指纹图，其余菌株间未见DNA指纹图。结论 阴沟肠杆菌的耐药性较为复杂。表现出去阻遏高产AmpC酶、产ESBLs、同时产AmpC酶和ESBLs和质粒AmpC酶多种耐药表型。分子流行病学结果显示，虽然阴沟肠杆菌的传播与抗生素的诱导和选择作用、患者机体抵抗力下降及肠道内寄居菌的内源性感染等因素有关，但仍然要警惕医院感染的发生。 【关键词】 阴沟肠杆菌 AmpC β 内酰胺酶酶 提取物三维试验 重序序列引物聚合酶链反应(ERIC rep PCR) Gene detection and the molecular epidemiology of Enterobacter cloacae with hyperproduction of AmpC β lactamase ABSTRACT Objective To investigate the molecular epidemiology of Enterobacter cloacae with hyperproduction of AmpC β lactamase. Methods Using the Kirby Bauer (KB) antibiotic susceptibility test, cloxacillin synergistic disc diffusion and the modified three dimensional extraction test, E.cloacae hyperproducing AmpC β lactamase were examined. The differential genotypes of AmpC β lactamase were investigated using the Enterobacter repetitive intergenic consensus (ERIC) for repetitive extragenic palindromic element based PCR (rep PCR). The study was carried on in the First People′s Hospital of Kunming from July, 2017 to December, 2017 in 84 clinically separate cases of E.cloacae. We determined the drug resistance profile, genotype and molecular epidemiology of each strain. Results Using phenotypic screening and extended spectrum β lactamases (ESBLs) confirmatory test, twenty three strains (23/84, 27.38%) of E.cloacae were found to have hyperproduction of AmpC β lactamase. The rate of ESBLs positive samples was 16.67% (14/84) and 44.05% had elevated AmpC β lactamase and ESBLs (37/84). The rate of AmpC β lactamase gene detection was 43.75% (28/64). Using the three dimensional extract test, we observed AmpC β lactamase detection rate of 47.62% (40/84). Through molecular epidemiology analysis, the results showed that the strains EC2 and EC11, EC13 and EC14, EC19 and EC20, had the same genotypic trees respectively. The rest of the strains did not exhibit this trait. Conclusion The drug resistance profile of E.cloacae is quite plex. The strains that expressed hyperproduction of AmpC β lactamase only, ESBLs only, or both at the same time, demonstratedvariable drug resistance between them. The results of the molecular epidemiological research demonstrated that even the transmission of E.cloacae resistance was often induced by the improper therapeutic option of drug, but also related to the decrease of the autoimmune condition of the patients and the enteric endogenous infections, whereas vigilant attention to the incidence of munity/hospital acquired infections couldn′t be ignored. KEY WORDS Enterobacter cloacae; AmpC β lactamase; Modified three dimensional extract test; ERIC rep PCR 近年来头孢菌素在我国的广泛使用和其对阴沟肠杆菌的选择作用， 1,和AmpC酶,2,已成为临床关注的焦点。马越等报道阴沟肠杆菌产ESBLs, ,3,，阴沟肠杆菌对临床常用抗生素的耐药率，除亚胺培南和美罗培南外，8年间都有不同程度的增加。头孢曲松、头孢噻肟、头孢他啶、环丙沙星、庆大霉素和阿米卡星等抗生素的耐药率都增加了20%以上。本研究采用表型初筛试验、双纸片增效试验和酶提取物三维试验，检测从临床感染标本中分离的84株阴沟肠杆菌高产AmpC酶和ESBLs，同时用聚合酶链反应检测AmpC酶基因，用肠杆菌间的重复序列(Enterobacter repetitive intergenic consensus，ERIC)对引物进行扩增，研究其克隆传播状况，结果报告如下。 1 材料与方法 1.1 菌株来源及鉴定 收集2017年7月,2017年12月昆明市第一人民医院住院及门诊感染患者送检的各类标本中分离的阴沟肠杆菌84株，排除同一患者同一部位重复分离的菌株。其中来自痰液标本68株(80.95%)，咽拭3株(3.57%)，尿液标本4株(4.76%)、脓性分泌物5株(5.95%)、脑脊液1株( 1.19%)院内感染监测标本3株(3.57%)。标本主要来自医院ICU(40%)、神经外科(22%)和老干科(16%)。按照《全国临床检验操作规程》第二版常规培养分离，菌株采用BD BBL Crystal ENF鉴定系统鉴定到种。 1.2 AmpC酶表型筛选法 采用CLSI/NCCLS(1999年)推荐的Kirby Bauer纸片扩散法，广东乐通泰公司提供法国Bio Merieux公司Mueller Hinton琼脂、英国Oxoid生产的药敏纸片，亚胺培南(IMP)、头孢吡肟(CPE)、头孢曲松(CRO)、头孢噻肟(CTX)、头孢他啶(CAZ)、头孢西丁(CFX)、头孢噻肟/克拉维酸(CD03，30μg/10μg)、头孢他啶/克拉维酸(CD02，30μg/10μg)。CFX和AMPC耐药作为初筛指标,4,。再用IMP、CPE、CD0 2、CD0 3、CRO 5种纸片进一步判别,5,。结果显示，CPE、IMP表现敏感，而CRO、CD02和CD03耐药或其抑菌环内存在少数菌落，为去阻遏持续高产AmpC酶，提示IMP敏感其余均耐药，判断为高产AmpC酶和ESBLs同时存在。 1.3 头孢西丁三维试验 采用改良酶提取物三维试验,6,。 (1)制备β 内酰胺酶粗提取物 将35?培养过夜的测试菌制成 1.5×108CFU/ml菌液，取50μl加入12ml胰蛋白胨肉汤。置35?恒温摇床上(200r/min)孵育4,6h，3000r/min离心25min，弃上清液。取沉淀加入0.01mol/L的PBS(pH7.4) 1.0m1，旋涡混匀，置-170?液氮及37?反复冻融5次，4? 12017r/min离心1h，上清即为酶提取物。取制备好的酶提取物接种于普通琼脂平板，35?孵育18,24h，确认无细菌生长，-25?保存。 (2)三维试验(间接法) 将大肠埃希菌ATCC25922按KB法涂布MH琼脂平皿，在其中央贴CFX(30μg)纸片，用无菌刀片在离纸片边缘5mm处放射状切1条狭缝，取25,40μl酶提取物加入狭缝内，待稍干后置35? 18,24h。若在狭缝与抑菌环的交界处出现扩大的长菌区域，判为AmpC酶阳性，说明受试菌为高产AmpC酶菌株，阴沟肠杆菌029为阴性对照，阴沟肠杆菌029M(解放军301医院微生物科赠送)为阳性对照。 1.4 ESBLs的检测 ESBLs初筛和确认试验按CLSI/NCCLS(1999年)推荐方法，CTX?27mm、CAZ?25mm、CRO?25mm、ATM?27mm四个纸片有两个或以上小于上述标准为初筛阳性可疑菌株，需进行确认试验。CD02与CAZ、CD03与CTX抑菌环直径之差?5mm，确认为ESBLs阳性。 1.5 阴沟肠杆菌产AmpC酶基因型研究 (1)细菌DNA提取 采用碱裂解法，试剂盒(ACT 1、MIR 1和DHA 1、DHA 2)由无锡遗传技术研究所提供。取菌落置入内含100μl生理盐水的 0.5ml离心管内，离心(15000r/min)5min，弃上清液，加裂解液A 50μl，裂解液B 2μl，混匀后置入55?保温1h，再置入95?保温5min，离心(10000r/min)30s，上清液即为扩增的模板液。 (2)PCR扩增反应体系 按照试剂盒说明进行，取5μl模板液加入15μl耐热热管中加盖石蜡油二滴即可。 (3)PCR扩增条件 93?预变性2min，然后按93? 30s?55? 20s?72? 60s共循环35个周期，最后一个72?延长到2min。取扩增产物10μl与2μl溴酚兰指示剂混匀，点样于2%琼脂糖凝胶中，以100V电压电泳20,30min，出现与阳性模板分子相同的条带(302bp)为ACT 1、MIR 1阳性。DHA 1DHA 2条带为405bp。 1.6 重复序列引物聚合酶链反应(rep PCR) (1)菌株来源 细菌DNA的提取、主要仪器均同上。 (2)寡核苷酸引物 肠杆菌属基因重复序列(ERIC),7,为: ERIC1 5′ ATGTAAGCTCCTGGGG ATTCAC 3′，ERIC2 5′ AAGTAAGTGACTGGGG TGAGCG，由上海博亚生 3′物技术有限公司合成。