高压脉冲电场对酿酒酵母细胞膜流动性及脂肪酸组成的影响

高压脉冲电场对酿酒酵母细胞膜流动性及脂肪酸组成的影响 论文 高压脉冲电场对酿酒酵母细胞膜流动性及 脂肪酸组成的影响 5 摘要:本文主要从高压脉冲电场作用下酿酒酵母细胞膜流动性及脂质组成的变化探究高压脉 冲电场作用对酿酒酵母细胞膜的损伤机制。通过荧光偏振法对酿酒酵母细胞膜流动性的检测 发现，在 30 kV/cm 的电场强度下，随着 PEF 处理时间的延长，酿酒酵母细胞膜流动性逐渐 10 降低，且二者呈线性关系。采用气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术对 30kV/cm、200μs PEF 处理的酿酒酵母细胞脂肪酸成分分析结果明:经 PEF 处理过的酵母细胞膜总脂肪酸相对 含量由 94.74%减少到 90.83%，其中不饱和脂肪酸相对含量由原来的 71.14%减少为 60.56%。 PEF 处理过程中氢自由基的产生可能是脂质过氧化以及细胞膜流动性降低的主要诱导因素。 关键词:食品科学技术;高压脉冲电场(PEF);细胞膜流动性;脂肪酸 15 Effect of Pulsed Electric Fields on lipid composition and membrane fluidity of Saccharomyces cerevisiae GU Yanjie1, YANG Ruijin2, ZHAO Wei2 (1. School of Food Science and Technology,Jiangnan university, JiangSu WuXi 214122; 20 2. State Key Laboratory of Food Science & Technology and School of Food Science and Technology, Jiangnan University, JiangSu WuXi 214122) Abstract: The effect of PEF on lipid composition and membrane fluidity of Saccharomyces cerevisiae were examined in the present work in order to explore the membrane damage mechanism of the S.cerevisiae cells induced by pulse electric fields (PEF). Fluorescence 25 polarization was used as the method of detection of membrane fluidity, which was found to be gradually reduced with the PEF processing time prolonged at the electric field of 30kV/cm. The fatty acid component of S. cerevisiae cells was obtained by Gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) analysis before and after PEF treatment (30kV/cm, 200μs). After PEF treatment, the relative content of the total fatty acids of the yeast cells decreased from 94.74% to 30 90.83%, wherein the relative content of unsaturated fatty acid reduced from 71.14% to 60.56%. The generation of hydrogen radicals in PEF process was the main factor of lipid peroxidation and reduced membrane fluidity. Keywords: Food Science and Technology; Pulsed Electric Field; membrane fluidity; fatty acid 35 0 引言 高压脉冲电场杀菌(PEF)作为一种非热杀菌技术，以其能够很好地保持食品营养成分、 色泽、风味等特点备受关注，具有良好的工业化前景。目前人们就 PEF 对微生物的杀菌效 果方面已有了较深入的研究，并证实 PEF 对微生物的营养体细胞均有较好的杀灭作用，但 40 对芽孢的杀灭效果不十分理想[1][2]。进一步研究显示，PEF 处理会产生一定数量的亚致死微 生物[3]。PEF 对于微生物的杀灭效果与其对微生物细胞膜的影响密切相关。细胞膜是 PEF 作 用的首要目标，当微生物被置于高压脉冲电场中时，细胞膜会被破坏，从而导致细胞内容物 渗出，引起细胞死亡[4][5]。 细胞膜是分隔细胞与外界环境的一道屏障，也是细胞与外界进行物质运输和信息交流的 -1- zl 论文 重要通道。膜脂流动性是其重要的动力学特征，适宜的流动性才能使细胞保持正常的生理功 45 能。细胞可以通过脂肪酸组成的变化来改变膜的一些特性以适应外界环境的变化，如不饱和 脂肪酸和饱和脂肪酸的比率可以间接反映细胞膜的流动性。目前对于生物膜流动性的研究主 要采用差示扫描量热法(DSC)[6]、电子自旋共振(ESR)[7]、核磁共振(NMR)[8]及荧光 偏振(FP)[9]等方法。它们可以从不同角度对膜流动性进行分析，其中荧光偏振法简单实用， 所得参数能够定量地描述细胞膜脂分子的运动情况，应用较为广泛。 50 本文采用荧光偏振法[9] 和气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术分别研究 PEF 处理后酿酒 酵母细胞膜流动性和脂质组成的变化，并进一步探究 PEF 对细胞膜的损伤机制。 1 材料与方法 1.1 材料 菌种 55 1.1.1 酿酒酵母菌 BY4742 (MATalpha, leu2D0, ura3D0, his3D1, lys2D0) 由江南大学食品酶学 实验室提供，购于 Open Biosystem。 主要试剂和仪器 1.1.2 OSU-4L 型实验室规模 PEF 连续处理设备 (俄亥俄州州立大学，美国) 。 60 XSW-CJ-2A 型净化工作台(吴江市绿叶空调净化有限公司) CT14D 型台式高速离心机(上海天美生化仪器设备工程有限公司) LDZX-50KBS 型立式压力蒸汽灭菌锅(上海申安医疗器械厂) QYC2102-C 型恒温培养摇床(上海新苗医疗器械有限公司) F-7000 型荧光分光光度计 (HITACHI 公司，日本) Trace 气相色谱/ 质谱/ 计算机联用仪(Finnigan 公司，美国) 65 1.2 实验方法 微生物培养与接种 1.2.1 酿酒酵母菌由酵母浸出粉胨葡萄糖(YPD)琼脂斜面培养基移至 YPD 液体培养基，30? 摇床 200 r/min 培养 16h 至对数生长期，菌体浓度达到 108,109cfu/mL。将上述培养液在 4? 70 条件下 8000r/min 离心 6min，然后用电导率约为 2000μs /cm，pH7.2 的磷酸盐缓冲液(PBS) 重悬，使菌体浓度达到 106,107 cfu/mL。 高压脉冲电场杀菌设备 1.2.2 采用 OSU-4L 型实验室规模连续 PEF 处理设备进行实验，脉冲电场为双极方形波脉冲 电场，管路清洗采用 4%NaOH、10%市售次氯酸消毒液和无菌水进行。 高压脉冲电场杀菌参数的选择 75 1.2.3 实验选择 6 个连续处理腔，选择电场强度为 30 kV/cm，总处理时间为 100、200、300、 400、500μs(处理时间采用循环方式)，脉冲宽度 2μs，脉冲频率 200 Hz;循环式冷却水浴 的温度设定为 15?。 电场强度 E 和总处理时间 t 计算方法如下: zl 论文 80 E=U/d -2- zl 论文 t = Np ×Nc ×Wp Np = Tr ×f Tr = V / F 式中 U——电压，kV;d——电极间距，0.29 cm;Np——单个处理腔内接收的脉冲数; 85 Nc——处理腔个数，6;Wp ——脉冲宽度，s;Tr ——停留时间，s; f ——脉冲频率，Hz;V——单个腔体积，0.012 cm3;F——物料流速，mL/s。 PEF 处理对酿酒酵母菌细胞膜流动性的影响 1.2.4 细胞膜的流动性对细胞膜功能的发挥有重要影响，细胞膜流动性的测定可以客观反应细 胞的生理机能。DPH(1,6-苯基-1，3，5-己三烯)被认为是用于研究膜脂流动性的一种比较 90 敏感的荧光探剂，当 DPH 掺入到细胞膜脂的烃链区后，介质粘度变大，顺反异构化受到抑 [10]。 制，从而使其成为唯一能发荧光的全反构型 各向异性值 r 可以反映膜脂的平均流动性，当烃链活动性大时，DPH 分子从吸收到发 射这段时间内随类脂分子的活动而有不同程度的倾斜，而使发射的荧光偏振度减小，各向异 性减小，膜脂流动性增大。 1.2.4.1 荧光探针标记酿酒酵母细胞 95 取 23.2mg 1,6-苯基-1，3，5-己三烯(DPH，Sigma 公司)溶于 50mL 四氢呋喃中，配成 2mmol?L-1 母液，避光 4?保存，使用时用 pH7.0 的 PBS 稀释成 2μ moL?L-1 的工作液。 取经脉冲电场处理前后的酿酒酵母样品，以 4000r/min 离心 10min，取沉淀以 4mL 的 PBS 缓冲液洗涤，4000r/min 离心 10min，弃上清，加入 4 mL 的 2μmol?L-1 DPH 工作液在 30?温浴 60min 后。重复离心分离操作，将收集到的菌体悬浮在 4 mL PBS 溶液中。 100 1.2.4.2 荧光各向异性的测定 选用 HITACHI F-7000 型荧光分光光度计，采用氙灯光源，激发波长为 358nm，发射波 长为 429 nm，激发狭缝与发射狭缝均为 5.0nm，利用荧光偏振法，以非标记的酿酒酵母样品 为空白对照进行测定。荧光偏振度 P、荧光各向异性 r 和细胞平均微粘度 η 的计算公式如下: (1) 105 (2) (3) 式中 IVV 和 IVH 是激发光为垂直方向的偏振光，而发射光分别为垂直和水平方向的偏振 光时测得的荧光强度，G 为光栅矫正因子，G=IHV/IHH，IHV 和 IHH 是激发光为水平方向的偏 振光，而发射光分别为垂直和水平方向的偏振光时测得的荧光强度。 110 酿酒酵母膜脂总脂肪酸的提取 1.2.5 脂肪酸的提取参考 Bligh & Dyer 脂肪酸提取步骤 [11]，分别取原始菌株，PEF 处理 (30kV/cm，200μs)菌株对细胞膜脂肪酸组成进行提取分析。 分别称取 2.5g(湿重)菌体于 250ml 锥形瓶中，加入 80ml 甲醇、40ml 氯仿和 20ml 蒸 115 馏水，电磁搅拌 90min 后，加入 40ml 氯仿和 40ml 蒸馏水，过滤后分液取下层有机相，旋 zl 论文 转蒸发回收溶剂，得 酵母膜脂总脂肪。甲 酯化待 G C - M S 分析备用。 -3- zl 论文 酿酒酵母脂肪酸成分分析 1.2.6 使用 Trace GC/MS 联用仪对甲酯化后的样品进行分析，色谱柱采用 PEG20M( 30 m ×0.25mm × 0.25 μm)，N2 作为柱中的载气。质谱仪中离子化方式为 EI+，发射电流 200μA， 120 oC。柱温采用程序升温:初温 180oC，保持 2 min;以 3oC 电子能量为 70 eV，气化室温度 260 /min 升到 240oC，保持 10 min。测定完后，经计算机化学工作站分析检索其中的脂肪酸组 分，并经数据处理系统按峰面积归一化法计算各脂肪酸组分的相对百分含量。 2 结果与讨论 2.1 PEF 处理对酿酒酵母细胞膜流动性的影响 经场强为 30 kV/cm 的 PEF 处理不同时间(100~500μs)的酿酒酵母细胞荧光各向异性 r 125 和细胞膜微粘度 η 分别见图 1 和图 2。通过荧光偏振法，根据公式(2)计算得到酵母细胞膜的 荧光各向异性值 r 值。细胞膜所处环境中的平均微粘度 η 由公式(1)和(3)计算得到。图 1-1 -2 显示，经过 PEF 处理后酿酒酵母细胞膜的微粘度与各向异性值具有大致相同的变化 和图 1 趋势，随着处理时间延长，细胞膜的荧光各项异性值 r 和微粘度 η 随之增大。荧光各向异性 r 和细胞膜微粘度 η 与膜的流动性成反比关系，r 值与 η 值越大，膜的流动性越低，反之越 130 高[12]，即随着处理时间延长，细胞膜的流动性越来越小。 0.60 0.58 0.56 0.54 0.52 0.50 0 100 200 300 400 500 处理时间(μs) 图 1 不同处理时间对酿酒酵母细胞膜荧光各向异性的影响 Fig.1 Effect of different treated time on the fluorescence anisotropy of S.cerevisiae cells 135 图 2 不同处理时间对酿酒酵母细胞膜平均微粘度的影响 Fig. 2 Influence of different treated time on the microviscosity of S.cerevisiae cells zl 论文 -4- 各向异性r值 zl 论文 2.2 PEF 处理对酿酒酵母细胞膜脂肪酸组成的影响 140 脂肪酸是细胞膜中含量丰富的物质。细胞膜中脂肪酸组成的变化是细胞适应外部环境的 内在调节机制[13]。细胞膜中脂肪酸成分发生变化，直接影响着细胞膜的结构、流动性和通 透性。饱和脂肪酸紧密有序地排列，使细胞膜的流动性减小;不饱和脂肪酸由于不饱和键的 存在，使分子键排列疏松而无序，从而会使膜的流动性增加。酿酒酵母细胞的膜脂总脂肪酸 中大约 70%~80%是不饱和脂肪酸，主要为棕榈油酸(16:1)和油酸(18:1)。其余的脂肪酸 145 是饱和脂肪酸，主要为棕榈酸(16:0)以及少量的硬脂酸(18:0)和豆蔻酸(14:0)[14]。 RT: 0.00 - 18.45 SM : 7G NL: 8.77 100 2.19E7 TIC M S 6.37 90 2012-151 80 70 60 50 40 30 9.40 20 10 2.90 4.15 11.23 15.16 16.27 12.55 13.94 17.91 7.86 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Time (min) 图 3 未处理组酵母脂肪酸 GC-MS 图谱 Fig.3 GC-MS spectrum of the fatty acid from untreated S.cerevisiae cells. 150 RT: 0.00 - 18.46 SM : 7G 6.37 NL: 100 1.00E7 TIC M S 90 2012-152 8.76 80 70 60 50 40 30 20 2.89 4.16 10 15.87 9.40 10.55 11.60 13.95 17.39 7.86 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Time (min) 图 4 PEF 处理组酵母脂肪酸 GC-MS 图谱 Fig.4 GC-MS spectrum of the fatty acid from PEF treated S.cerevisiae cells. 155 采用 GC-MS 对未处理酿酒酵母及 30kV/cm、200μs PEF 处理酿酒酵母的脂质成分分析， 总离子流图见图 3 和图 4。采用 Bligh-Dyer 提取方法从酵母膜脂肪中提取到脂肪酸共 7 种， 其中饱和脂肪酸 4 种，单不饱和脂肪酸有 2 种，多不饱和脂肪酸有 1 种。将图 3 和图 4 得到 的结果经计算机化学工作站分析检索其中的脂肪酸成分，得到酿酒酵母细胞脂肪酸主要含有 160 月桂酸(C12:0)、肉豆蔻酸(C14:0)、棕榈酸(C16:0)、棕榈油酸(C16:1)、硬脂酸(C18:0)、 zl 论文 油酸(C18:1)和亚 油酸(C18:2)。总 离子图经数据处理 系统按峰面积归一 化法计算出各脂 -5- Relative Abundance Relative Abundance zl 论文 肪酸的相对百分含量，结果见表 1。未处理酿酒酵母菌细胞膜不饱和脂肪酸为 71.14%，饱 和脂肪酸含量为 23.6% ，经 30kV/cm、200μs 的 PEF 处理后细胞膜不饱和脂肪酸为 60.56%， 饱和脂肪酸含量为 30.27%，不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比例由原来的 3.01 减少到 2.00。 165 PEF 处理后酿酒酵母膜脂总脂肪酸含量(94.74%)略低于未处理组(90.83%)，这一点与 [15]的研究中 PEF 处理会使得葡萄汁中脂肪酸含量略微下降的结果 Teresa Garde-Cerdán 等人 相一致。 表1 酿酒酵母膜脂总脂肪酸的组成及相对含量 Table1 The composition and relative content of fatty acid from S.cerevisiae membrane lipid. 170 相对百分含量(%) 序号 化合物 保留时间(min) Control PEF 1 2.89 C12:0 7.55 16.56 2 4.16 C14:0 0.83 1.05 3 6.04 C16:0 11.40 9.35 4 6.37 C16:1 27.86 31.54 5 8.46 C18:0 3.82 3.31 6 8.76 C18:1 34.17 26.65 7 8.86 C18:1 1.09 1.59 8 9.40 C18:2 8.02 0.78 细胞膜主要由脂质、蛋白质和糖类等物质组成;其中以蛋白质和脂质为主。影响细胞膜 流动性的因素主要有脂肪酸链的长度及饱和程度，胆固醇含量，温度，酸碱度及离子强度等。 PEF 处理之后酵母细胞不饱和脂肪酸含量从原来的 71.14%下降到 60.56%，酵母细胞膜的流 195 175 180 185 190 zl 论文 动性随之下降。由于特征是细胞膜的侵蚀和破坏，细胞膜表面上电穿孔的形 酿酒酵母膜脂肪中成以及内容物的释放。酿酒酵母细胞膜在 PEF 作用下的损伤机制可以从以下方面推测解释。 不饱和脂肪酸的含其一:PEF 作用下细胞膜产生电穿孔，导致膜通透性增强，内容物质流出;其二:在脉冲电 量较高，使膜磷脂的场的刺激下细胞内有氢自由基产生，促使细胞内的不饱和脂肪酸发生氧化反应，脂质的过氧 不饱和度增加， 化导致了细胞体内脂质/蛋白质比例失常，从而使膜的液态性与流动性发生改变。自由基的 很容易发生过氧化。产生以及脂质过氧化反应的发生为 PEF 处理后酵母细胞膜不饱和脂肪酸含量的减少以及细 资智洪[16]通过对花胞膜微粘度的下降提供了有力的依据。 生油脂肪酸成分的 3 结论 研究发现，强脉冲处 通过荧光偏振法以及气象色谱-质谱联用技术对 PEF 处理前后酿酒酵母菌株细胞膜流动 理会使花生 性以及脂肪酸成分的差异研究，得出以下结论: 油中不饱和脂肪酸 (1)经 30kV/cm PEF 处理不同时间后酿酒酵母细胞膜流动性发生改变，随着处理时间 的含量下降。本实验 的增加细胞膜流动性逐渐降低。30kV/cm、200μs 的 PEF 处理后，细胞膜脂肪酸含量发生改 PEF 处理后酵母中 变，不饱和脂肪酸含量由 71.14%下降到 60.56%，饱和脂肪酸含量由 23.6%增加到 30.27%， 菌悬液的温度不超 总脂肪酸相对含量比未处理组减少 3.91%。 过 30 度，因此 可以确定实验过程-6-中不饱和脂肪酸的 氧化反应不是由温 升引起的。 张莎[17]通过 PEF 对磷酸盐 缓冲液以及油 酸乳状液处理 后的电子自旋 共振(ESR)研 究 发现，PEF 处理会引 起食品体系中氢自 由基的产生。氢自由 基具有一定的反应 活性，可能攻 击不饱和脂肪酸上 与双键相邻的 α-亚 甲基氢原子，使不饱 和脂肪酸按照自动 氧化的链反应 机制发生氧化反应， 引起脂质过氧化反 应，造成细胞膜结构 和功能的种种损伤。 Gretchen Marx 等人[5]指出 PEF 造 成细胞死亡的主要 zl 论文 (2)PEF 作用于酿酒酵母细胞产生的氢自由基可能是导致不饱和脂肪酸含量减少、脂 质过氧化以及细胞膜流动性降低的主要原因。除了电穿孔导致细胞内容物流出外，氢自由基 造成的脂质过氧化及膜流动性下降也是 PEF 作用下微生物致死的不可忽视因素。 200 [参考文献] (References) [1] KNORR D. Novel approaches in food-processing technology: new technologies for preserving foods and modifying function [J].Current Opinion in Biotechnology, 1992,10(5):485-491. [2] AHVENAINEN R. New approaches in improving the shelf life of Minimally processed fruit and vegetables [J].Trends in Food Science and Technology, 1996,7(6):179-187. 205 [3] GARCÍA D, MAÖAS P, GÓMEZ N, et al. Biosynthetic requirements for the repair of sublethal membrane damage in Escherichia coli Cells after pulsed electric fields[J].Journal of Applied Microbiology, 2006,100(3): 428-435. [4] EVRENDILEK GA. Inactivation kinetics of pathogenic microorganisms by pulsed electric fields [D]. The Ohio state University, 2001 210 [5] GRETCHEN M, ABIGAIL M, DANIELA B A. A comparative study on the structure of Saccharomyces cerevisiae under nonthermal technologies: High hydrostatic pressure, pulsed electric fields and thermo-sonication[J]. International Journal of Food Microbiology, 2011,151: 327-337. [6] XIE W, KANIA K I, BUMMER P M, et al. Effect of potassium perfluorooctanesulfonate, perfluorooctanoate and octanesulfonate on the phase transition of dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) bilayers[J]. Biochimica et 215 Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes, 2007, 1768(5): 1299-1308. [7] LIANG X J, YIN J J, ZHOU J W, et al. Changes in biophysical parameters of plasma membranes influence cisplatin resistance of sensitive and resistant epidermal carcinoma cells[J]. Experimental Cell Research, 2004, 293(2): 283-291 [8] MAHALAKSHMI R, FRANZIN C M, CHOI J, et al. NMR structural studies of the bacterial outer membrane 220 protein OmpX in oriented lipid bilayer membranes[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes, 2007, 1768(12): 3216-3224. [9] 许金钩, 王尊本, 荧光分析法[M]. 北京: 科学出版社, 2006. [10] SHINITZKY M , et al. Fluidity parameters of lipid regions determined by fluorescence polarization[J]. Biochim Biophys Acta . 1978, 515?367. 225 [11] TOMLINS R I, WATKINS T R and GRAY R J. Membrane lipid alterations and thermal stress in Salmonella typhimurium 7136[J]. Applied and Environmental Microbiology. 1982, p. 1110-1117. [12] 张鹰，曾新安，温其标等. 荧光偏振法研究脉冲电场对酿酒酵母细胞膜流动性影响[J]. 光谱学与光谱 分析，2008，28(1): 156-160. [13] 童钰，陆海霞，励建荣. 超高压处理对副溶血性弧菌细胞膜组成成分的影响[J]. 微生物学报，2012， 230 52(10): 1244-1250. [14] Albert G.Moat, John W.Foster, Michael P.Spector. 微生物生理学[M]. 李颖，文莹，关国华等. 北京:高 等教育出版社，2009. [15] TERESA G C, MARGALUZ A G, A. Robert Marsellés-Fontanet.et al. Effects of thermal and non-thermal processing treatments on fatty acids and free amino acids of grape juice[J]. Food Control,18 (2007) 473-479 235 [16] 资智洪，曾新安，杨连生. 强脉冲电场处理对脂质性质及组分的影响[J]. 食品科技，2009，34(1): 126-130. [17] 张莎. 高压脉冲电场在消毒奶加工中的应用及其对脂质的影响研究[D]. 无锡:江南大学，2010. zl 论文 -7- zl