大白菜不同三体n1雄配子传递率差异的研究

大白菜不同三体n1雄配子传递率差异的研究 河北农业大学硕士学位论文大白菜不同三体n1雄配子传递率差异的研究姓名耿霄申请学位级别硕士专业蔬菜学指导教师申书兴马德伟2003.5.1摘要本文以大白菜同源四倍体小孢子培养产生的且已鉴定为三体的号、号、号、号非整倍体植株为试材针对各类三体问雄配子传递率差异问题对三体大白菜花粉母细胞的减数分裂行为、花粉发育的组织切片观察、花粉特征特性及生理生化等方面进行观察研究。同时就不同三体的额外染色体附加效应对减数分裂过程中染色体的行为、花粉活力、结子率、雄配子传递率的影响进行分析。研究结果如下以号、号、号、号三体为父本倍体为母本进行杂交后的结子率分别为】雄配子传递率分别为。三体在减数分裂过程中出现异常现象。三体在终变期和中期个刮源染色体联会成三价体或个联会成二价体和个单价体或个都为单价体后期出现落后染色体或单价体提前分离导致除。式分离外还有等不均衡分离方式历期有??—??——等分离方式个三体中的小孢予频率不同。这些现象均会不同程度的降低各个三体的传递率。组织切片表明号、号三体的花粉发育过程与二倍体相似基本正常号、号三体在减数分裂时期绒毡层出现过异常现象但号兰体在以后的时期绒毡层则表现正常。而号三体的绒毡层虽在四分体时期表现正常但在小孢子时期又表现了异常并且花粉全部败育。因此影响号三体雄配子传递率的主要原因就是花粉的致育。号三体的花粉整齐度与二倍体无显著性差异号、号三体的花粉整齐度均极显著低于二倍体号三体的花粉整齐度最低号三体不散粉。花粉整齐度与结子率有极显著的正相关关系因此花粉整齐度可作为预测结子率的一个指标。号三体的花粉活力显著低于二倍体号、号三体的花粉活力极显著低于二倍体号三体的花粉活力最低。三体的花粉活力与传递率里显著的正相关关系。号、号、号三体雄配子传递率与减数分裂过程中染色体的行为和花粉生活力的降低有关同时雄配子受精能力、胚发育能力可能也会影响雄配予的传递率。由于每个三体的额外染色体所携带的遗传信息基因不同导致这些因素发生不同程度的变化最终导致不同三体雄配子的传递率产生差异。个三体的可溶性糖、淀粉及氨基酸含量均极显著低于二倍体。关键词大白菜三体雄配子传递率减数分裂花粉发育独创性声明本人声明所里交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知除了文中特别加以标注和致谢的地方外论文中不包含其他入已经发表域撰弓过的研究成果也不包含为获得疆捌錾坐或其他教育机构的学位或证而使过的材料。与我一同作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的并表示谢意。学位论文作者签名耻智签字日期如哆铝月可日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了麓壹垄窭塞坚有关保留、使用学位论文的规定有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘允许论文被查阅和借阅。本人授权爱垄塑蚴以将学位论文的全都或部分内容犏入有关数据库进行检索可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文保密的学位论文在解密后适用本授权书学位论文作者签名取留签字日期哆“月工日导师签名、《汐膨荔导师签名、《扩膨荔签字日期弘哆年月叫日查皂墨至塑三堡苎墼王生望茎墨塑堡鉴————文献综述植物三体额外染色体的传递率是利用三体进行遗传分析的重要参数在利用三体进行遗传分析时一个重要的问题就是应了解被测定植物配予的传递率否则作为测定依据的测交或自交子代表现型的比例就没有意义了。从理论上讲一个三体中无论雌性或雄性配子都以相等的频率形成和两种配子冈而从×或×的杂交组合中戍该得到频率相等的和个体同样在的白交繁殖后代中、、的个体府是的比例但实际情况并哲如此在×杂交组合的 后代中个体的频率远远低于丽在×的杂交组合后代中个体则更少极端的例子是川在年研究大麦三体的传递率时发现大麦中额外染色体没有一个是经过雄配子传递的。植物三体额外染色体通过雄配子传递率降低是受多种冈素影响的这些冈素在某一具体植物的三体中可能是其中一种冈素起主导作埘也可能是儿种冈素共同起作用但其中一种作用更明显“对此国内外已有不少学者做过一些研究本文综合如下。异常的减数分裂导致雄配子传递率低由于额外染色体常成为落后染色体和进行错误分裂或者两者兼而有之使额外染色体不进入细胞棱的组成两被丢弃从而减少配子的比例致使额外染色体传递率的降低。这一点与染色体的长度、单价体和三价体的频率有关。从减数分裂前期染色体联会观察到两种类型其一额外染色体与同源染色体联会成三价体其颓外染色体不联会而白成单价体。一般的讲较长的染色体形成交叉的频率高因而形成三价体的频率商在减数分裂过程中染色体丢失的机会就少形成配予的机率就高因而较长染色体的三体传递率就高。小染色体在减数分裂过程中由于形成交叉的机会少。常以单价体形式存在易丢失因而形成配子的频率低所以小染色体的三体传递率低。】在玉米三体的研究中得到结论玉米的染色体有较长的、中等的和较短的其单价体的频率分别为额外染色体的传递率分别为和证明了三体的传递率与染色体的妖度及单价体、三价体的频率有关。然而等在研究水稻初级三体的传递率时发现号染色体三体传递率为而号染色体三体传递率为。】研究水稻三体传递率时也发查旦墨至旦三堡苎里主堡垄皇篓墨塑鲤壅一现长染色体传递率最低这一现象。胡保民等】在研究陆地棉三体传递率时同样发现个大染色体传递率比个小染色体的三体传递率低。因此。一些学者认为 十配子传递率受额外染色体造成的不平衡影响那么长染色体造成的不平衡大于小染色体造成的不平衡此理论可以解释上述研究结果。此外 】对毒麦草的传递率进行研究后认为尽管大染色体形成三价体的频率高于小染色体但三价体传递率与染色体的长度及三、单价体的频率是无关的。花粉生活力降低导致 雄配子传递率低许多作者…认为额外染色体不能通过花粉传递的一个原因是三体的花粉活力降低具额外染色体的花粉不能与正常者竞争之故 和 在曼陀罗的研究中发现具有额外染色体的花粉粒的第一次有丝分裂是正常的并产生两个核但是在第一次分裂之后便开始瓦解致使不能形成正常的花粉。这个结论与徐绑英等”已报道的初级三体的花粉败育率增高相一致。 “的研究指出大麦三体有大小不同豹两类花粉粒较小的一类是 。当 花粉粒从花粉敬出并完全成熟能参与受精作用时而 的花粉粒还没有成熟而不能参与受精作用 的研究支持了 提出把三体花粉粒分成 和 两种不周犬小的观点 指出 花糟粒与正常的 花粉粒相比其生活力降低的原因是 花粉粒成熟延迟? 花粉粒的花粉管生长缓慢? 花粉粒可能产生无效的花粉管 ? 花粉粒失去萌发能力但胡保民等在研究陆地棉三体传递率时发现花粉活力高的兰体传递奉未必比活力低的三体传递率高所以不能单用花糟活力商低来解释三体通过花粉传递率低的原因而影响花粉传递率的因素是多方面的花粉败育导致 雄配子传递宰低在植物三体传递率研究中。以兰体为父本、倍体为母本进行杂交或三体自交些组合的结籽宰为零。因此传递率也为零鉴于表现的这种花粉高度败育而影响了传递率因此深入了解花粉的发生、发育和形成过程以及影响花粉正常发育的因素是十分必需的但目前关于植物三体花粉发育的组织切片观察研究尚未见报道下面就影响檀物花粉败育的因素作一综述花粉败育的时期与过程关于花粉败育的时期。 和 认为双子叶植物多在四分体形成前单子叶植物多在小孢子后期或双核期。李传友、孙兰珍四对不周小麦、、三类不育系的花粉败育过程进行了细胞学比较观察。认为型不育系花粉败育的关键时期是小孢子后期败育首先从细胞质开始然后才是细胞核细胞质染色变浅。逐渐解体最终消失核的解体要晚于细胞质当细胞质解体完毕时核尚可见及但已显著变小呈高度凝缩状态有时甚至看到个别小孢子细胞质已相当稀薄而核仍在分裂中细胞质和细胞核解体后剩下的只是空壳花粉 型不育系花粉的关键时期是小孢子末期至二细胞花粉期败育通常是细胞质先于细胞核而解体这与型不育系花粉的败育方式相似而二细胞花粉的败育则从生殖细胞开始般是生殖核先发生异常核膜破裂释放出染色较深的核物质接着营养核也显示不正常形成不定型的染色质团块随后细胞质也解体这样整个原生质团染色逐渐变浅直至消失。最后形成具萌发孔的空壳花粉还有近的花粉败育较晚败育前营养细胞和细胞质已发挥了部分功能积累了少量淀粉颗粒和其他营养细胞这样的花粉能够部分染色型不育系花粉不育的关键时期是二细胞花粉期或三细胞花粉期败育主要是由于核行为的异常造成的。表现为部分花粉在生殖细胞分裂精显示败育现象。生殖核和营养核先后解体核物质被抛出而逐渐消解有些花粉生殖细胞能够进入有丝分裂但在分裂过程中常见到染色颗粒外渗现象或长期停滞于中期状态而营养细胞败育迹象不明显还有一定比爿的花粉。生殖细臆能够完成有丝分裂形成近乎正常的三细胞花粉但田问套袋自交结果表明。这些花粉仍然没有受精能力。王福青等 叫通过对大白菜援雄性不育两用系的细胞形态解骞 学观察表明败育从小孢子母细胞至二核花粉粒皆有发生。高峰期发生在四分体前后不同时期败育形式、数量和特点不同大体可划为小孢子母细胞不能进入减数分裂即当药室内的小孢子母细胞进入减数分裂之后。约有同一视野内小孢子母细胞却停止发育或者增生成巨型细胞或者发生有丝分裂。小孢子母细胞不能完成减数分裂过程在减数分裂过程中的不同时期败育如停止发育或中期、中期【的染色体捧列琉松或后期和后期 的纺锤丝消失或末期 核膜、核仁不能再现或不能形成小孢子壁等并且随小孢予母细胞减数分裂的进行败育数量越来越多即由少数到多数甚至到末期约有的花药内性细胞完全败育并表现末期之前以单个性细胞查皂墨至堕三竺苎曼王堡望兰苎墨塑婴塞一——解体为主要形式末划之后解体和凝集成堆均有发生。小孢子不发育或发育不正常约有的花药内能形成四分体小孢子但有的花药内的小孢子不能发育它们因被浓厚的胼胝质包围两不能自由解离??或胼胝质分布不均匀或核仁、核膜消失或核质稀薄等从而它们凝集成堆而败育约有的花药内的小孢子虽能从胼胝质中解离出来但在花粉发育过程中不同时期凝集成堆而败育。影响花粉败育的因素绒毡层花粉成熟过程中花药绒毡层发育不完全可能是导致花粉败育的一个主要原踊„”】。绒毡层是药壁的最内一层它包围着花粉母细胞或小孢子。在花粉形成和发育中起着重要作用转运营养物质保证小孢子发生的需要绒毡层细胞为发育的小孢子提供营养已得到粹遍的承认来自绒毡层舶物质分泌到药室中以提供母细胞减数分裂和小孢子发育所需的营养成分。由于分离的花粉母细胞和早期小孢子可在组织培养中继续发育因此看起来绒毡层和其它花药缀织在花粉的发育中并未提供任何独特的必需因子“。研究表明„它们可能与简单的营养物质的动员和合成有关为花粉发育提供一个必需的物质条件。而不是提供花粉分化过程中的任何关键的形态发生成分这些试验表明皱毡层对于花粉的发育是很重要的但在小孢子形成以后缄毡层即以一种细胞自主状态起作用。它对于花粉的继续分化花药开裂 程序的诱导和完成不是必需的分泌胼胝质酶分解包围四分体的胼胝质壁在小孢子母细胞完成减数分裂后绒毡层适时地分泌胼胝质酶以分解包裹四分雍子的胼艇质壁释放小孢子口”。胼胝质酶合成与分泌的时间特异性对于花糟的正常发育具有决定性作用。在矮牵牛的细胞质雄性不育的一例中胼胝质壁的提前解体导致了发育的小孢子的退化“ 等人在另一更为明确的转基因植物系统中重复了这一事实并发现绒毡层细胞亦同小孢子一样表现出异常这暗示着一个可能性即也许绒毡层细胞并非独立于小孢予发挥作用一换句话说在花粉发育时这两种细胞类型之间可能存在着一些未知的相互作用参与花粉外壁和花粉包被的合成花粉外壁的合成是绒毡层细胞与小孢子共同参与的结果。目前认为。小孢子甚至母细胞建立起一个称为初生外壁的表面系统决定了外壁的沉积模式„????蚓。绒毡层细胞在外壁形成中所大白菜不同三体 雄配子传递率差异的研究起的作用表现为孢粉素前体的分泌这些前体物在模板系统上聚合口”。绒毡层细胞亦在花粉包被的台成中起作用。随着小孢子的液泡化绒毡层细胞逐渐死亡其分解产物填入花粉壁形成一层由脂类、蛋白、色素等成 。花粉包被对于花粉的功能是必需的。花粉积分组成的花粉包被。一些研究表明 累物质正常发育的花粉在发育过程中会积累一些物质如积累丰富的淀粉、富含游离脯氮酸等。可是向目葵、胡萝、小麦、小黑麦、高粱、玉米和水稻等作物 的不育花药中几乎不积累淀粉调节淀粉含量的酶的活性也明显降低。可溶性糖在不育花药与可育花药之间也有差异如玉米中可育花药与不育花药在可溶性糖的含量上就不相同。脯氨酸是花粉中氮基酸的一种贮存形式可以转变成谷氨酸等其他氮基酸在花粉中它与禽肇丰富的碳水化台物互相配台。具有提供营养、促进花粉发育、发芽和花粉管生长的作 。缺乏游离氨基酸是败育花粉的又一重要特征。自从 ” 对雄性不育小麦和玉米花药中的游离氨基酸含量进行分析以来对质核互作性雄性不育的水稻五、矮牵牛? 、萝”、玉米 ”、显性核不育的小麦„和萝胞质不育的大白菜“ 花药进行了分析结果表明不育花药严重缺乏游离脯氨酸的积累。激素一些试验?“慵定结果表明花粉致育植株的内漂激素与正常花粉植株相比发生了变化。如 观察到在缄毡层协 启动予指导下使转基因植株花药生长素含量提高赤霉紊活性降低。花药皱缩花粉败育花冠和花萼变短。耿飒例对 和 转基因烟草研究表明干扰细臆分裂素代谢或增加细胞分裂素也能导致雄性不育除个别研究外大多数研究报道股育花粉脱落酸含量增加。查鱼苤至旦三签竺苎墼王堡堂皇茎墨箜堡壅一引言额外染色体在减数分裂过程中的行为和传递力的研究是进行三体繁殖保存和利用三体进行基因定位等工作的必须基础和遗传分析的参数。国内外研究者通过多年的努力在玉米、水稻、大麦、黑麦、大豆、番茄、甜菜等作物上已建立了成套初级三体并对其额外染色体在减数分裂过程中的行为及传递力进行了详细的研究。大向菜口为十字花科芸薹属蔬菜原产我国属二倍体物种是我国重要的蔬菜也是我国有关蔬菜研究走向世界先列的蔬菜作物关于火白菜的臼交不亲和性”“、雄性不育”“”和杂种优势的研究较深入在光合机理””“、起源及分类…”“、转基因””和分子标记””…方面也取得一定进展但其基因定位及基因酗谱等研究相对滞后其中大白菜初级三体的刨建是一项非常重要的二作。申书兴等…„”。首次利用向源四倍体火白菜游离小孢子培养获得了个非整倍体小孢子楂株系且对四倍体人向菜小孢予培养获得三体的细胞学依据进行了研究现已获得了火部分三体及少数双三体、单体”“”?本试验主要目的是在已获得的大白菜兰体植株基础上针对备类三体问的传递率差异闯置预从雄配子方 面研究其原因即从三体大白菜花粉母细胞的减数分裂行为和花粉发育的组织切片麓寨及生理生化等方面分析三体通过花粉传递率低的原因同时兢不同三体的颤外染色体的附加效应对减数分裂过程中染色体的行为、花粉活力、结子率、雄配子传递率的影响进行研究为进一步开展大白菜细胞学蒸囡定位、基因圉谱构建、染色体工程等研究奠定基础大白菜不同三体雄配子传递率差异的研究材料与方法试验材料及田间种植用于大白菜减数分裂观察和花粉发育过程观察的试材供试材料为大白菜同源四倍体小孢予培养产生的且已鉴定为三体的号、号、号、号非整倍体植株及二倍体对照植株等。每个试材株以上的试管苗于年月份接种到生根培养基上蔗糖十琼脂待根长达时经锻炼后于年月份直接移栽到阳畦进行低温眷化月份定植到露地按常规管理。用于大白菜生理生化指标测定的试材供试材料仍为上述材料。每个试材株以上的试管苗于年月中旬接种到生根培养基上配方同上待根长达时放入左右的冰箱中进行低温春化个月取出进行照光绿化于年月中旬分苗、定植于温室按常规管理。研究内容与方法三体棱株减数分裂观察取材与固定在大白菜开花蒜期于上午期阔用卡诺固定液酒精冰醋酸固定幼小花序小时以上然后换到乙醇中置于?冰箱中保存。每个试材固定株每株—个花序染色及显微照相丙酸铁水合三氯乙醛苏木耩染色常规压片于显微镜下观察并照相。观察与纪录观察、记录各个三体材料终变期及中期出现的单价体、三价体数后期分到两极的染色体数后期?分配到四极的染色体数。三体花粉发育过程的观察取材与固定于大白菜盛花期取大小不同的花瞀用固定液乙醇冰醋酸甲醛大白菜不同三体雄配子传递率差异的研究。固定小时后转入乙醇内在冰箱中保存。切片前处理采用酒精系列脱水酒精浓度从、、、直至脱水后用二甲苯透明最后进行浸蜡与包埋。切片并观察常规石蜡切片法切片。切片厚度为切片经脱蜡后用铁钒苏木精染色固绿复染中性树胶封周。在显微镜下观察并照相。花粉特征特性的研究取材时间于上午左右从大白菜套袋的花序中采集当天新开的花。花粉整齐度的观察将新鲜的花粉童接撒在载玻片上在×物镜下随机观察记录畸形花粉数和正常花粉数各试材分别观察个花粉粒统计正常花粉所占比例。花粉生活力的测定用氯化三苯基四氮唑染色法进行花粉活力的测定.