【doc】甘油磷酸脱氢酶法测定血清甘油三酯及其试剂的研制

【doc】甘油磷酸脱氢酶法测定血清甘油三酯及其试剂的研制 甘油磷酸脱氢酶法测定血清甘油三酯及其 试剂的研制 用医学2002年旦箜?555? ? 检验技术? 甘油磷酸脱氢酶法测定血清甘油三酯及其 试剂的研制 吕邦泰徐瑛 【主题词】甘油三酯类/血液甘油磷酸脱氢酶/方法 【中图分类号】R446.113【文献标识码】B【文章编号】 1671-0800{2002}10—0555—02 血清中甘油三酯的测定方法有化 学法和酶法.化学法准确性差,手续繁 复,不能自动化.酶法有甘油磷酸氧化 酶偶联Trinder反应…和甘油磷酸脱氢 酶(GDH)偶联四氮唑盐的比色法,以及 GDH的紫外法】.我们参照文献[2] 通过实验建立了甘油磷酸脱氢酶法测 定血清中甘油三酯的方法.本法不受 胆红素和VitC引起的负干扰,不仅适 合各种能加双试剂以上的各种类型的 自动生化分析仪,而且还能直接应用到 DimensionAR全自动生化分析仪代替 价格昂贵的进口原装试剂. 1原理 甘油三酯墅型!甘油+脂 肪酸 甘油+NAD+I旦二羟丙酮+NADH +H LPL和GDH,烟酰胺腺嘌呤二核 苷酸(NAD’)与标本混匀后,预孵育 300s水解甘油三酯,再加碳酸钾 (1(2CO,)在340nm二点比色,与标准 比较可计算出甘油三酯浓度. 2材料和方法 2.1仪器自动生化分析仪Dimen. sionAR(杜邦公司),EXPRESSPLUS (CibaCoring公司),分光光度计DU- 640(Beckman公司). 2.2试剂1,4呱嗪二乙基磺酸 (PIPES),NAD,Tris,(均为Roche公司 作者单位:315031宁波市保黎医院 作者简介:吕邦泰,男,1953年出生,副 主任检验师,发表论文12篇 产品)GDH,LPL,(均Tyobo公司产品) TritonX一100(Sigma公司产品),氢氧 化钾(KOH)和l(2CO,(国产分析纯). 2.3应用试剂的配制 2.3.1试剂ILPL5000U/L,GDH 400U/L溶于700mlPIPES.KOH缓冲 液(pH7.5,50mmol/L)中. 2.3.2试剂?取NAD400mg溶于 10mlPIPES-KOH缓冲液(pH7.5, 50mmol/L)中. 2.3.3试剂?取l(2CO32.65g溶 于100ml去离子水中. 2.3.4DimensionAR专用试剂试 剂I加到DimensionAR专用试剂船1 , 4孔,每孔2ml,5,6孔加试剂? 2ml,冷冻干燥,7孔加试剂Iil6ml,用 热封机封口,并贴上DimensionAR TRIG专用条形码. 2.3.5甘油三酯标准液2.26mmo]/ L溶于8.5s/L氯化钠溶液,加Triton X一100lml. 2.4测定方法DimensionAR,试剂船 直接送入试剂仓,校准后即可直接应 用.通用反应类型:二点法,波长340 mn(主)/380nm(次),校准方法为Lin. ear,反应温度37?.试剂I260,试 剂?36,延迟时间300s,试剂? 75.标准:按标定值,标本50a,读数 时间120s. 3实验结果 3.1试剂配方优化实验 3.1.1最佳pH选择第一步反应,pH 6.0-9.0之间6种不同pH的PIPES缓 冲液,试剂中的其它成分浓度不变,选 择1.1和4.05mmol/L两个标本测定, 观察LPL活性,结果显示pH在7.5时 u活性最高,和Toyobo提供的技术资 料相一致.第二步反应,分别制备不同 浓度的试剂?,其它浓度不变,待加入 试剂?和?后使最后反应体系的pH分 别达到10,10.5和11,观察线性和灵敏 度,结果显示pH在1O.5时,线性和灵 敏度最好,与Toyobo提供的技术资料相 一 致.最终选择l(2CO,浓度为26.5g/ L(pH10.5). 3.1.2缓冲液选择用50mmol/L PIPES和Tris缓冲液以及100mmol/L 磷酸钾缓冲液(PB),pH均为7.5,配 制试剂I,试剂中其它成分的浓度均 和前述试剂I同,分别在37?保存观 察稳定性.结果:PIPES稳定72h.PB 和Tris稳定48h,选择PIPES系统. 3.I.3LPL浓度选择取含Ik’L活性 分别为1000,2000,5000,10000U/L (GDH均为400U/L)的试剂I,分别测定 3份血清标本(A=I.01mmol/L,B= 4.05mmol/L,C=5.84mmol/L),结果显 示LPL5000U/L已达终点.考虑价格 因素,在实际应用中选择5OOOU/L. 3.1.4GDH浓度选择取含GDH活 性分别为200,400,1000U/L(LPL均 为5000U/L)的试剂I,取1份4.5 mmol/L标本,倍量稀释后作线性测 定,结果显示:随着GDH浓度增加,反 应灵敏度增高.考虑价格因素,在实 际应用中选择枷U/L. 3.1.5NAD浓度选择取含NAD浓 度分别为1,3,6,8mmol/L4种试剂 ?,试剂中其它成分不变,选择4.05 mmol/L标本测定,结果表明NAD在 3.5—8mmol/L已趋平衡.在实际应 556? 0.7 06 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 ModemPracticalMedicine.October2002.Vo1.14.No.10 图1反应动力学曲线 —-—?一A———?一B——’}—一C 用中选择5.5mmol/L. 3.2分析特性实验 3.2.1反应曲线观察分别取生理 盐水及2份不同浓度的血清标本 (2.25和4.55mmol/L)10,加试剂 I520后,立即于BeckmanDU640 分光光度计上测定反应速率,300s后 加试剂?72和试剂?150,结果见 图1所示(A为空白,B为2.25retool/ L标本,c为4.55mmoL/L标本),表明 加入试剂?和试剂?后120s内呈线 性.实际应用时读数时间采用120s. 3.2.2线性范围选择不同含量 (0.5,5.8mmol/L)的血清标本5份, 用本法测定,按NCCLS(EP6一P)文件 作线性评价,结果Y:1.0247X+ 0.001,:0.9995(为理论值,y为 实测值,单位:mmol/L). 3.2.3精密度选择不同值的标本3 份,每天上下午用DimensionAR自动分 析仪作双份测定,共测20d,按NCCLS 的评价作精密度评价,结果见表1. 3.2.4与其他方法比较选择不同 血清甘油三酯含量(0.5,5.4mmol/L) 的标本50份,同时用本法(y)与甘油 磷酸氧化酶法试剂()和Dimension AR原装甘油脱氢酶法试剂(z)按NC. CLS的方案进行比较,结果: 0.9921,Y=1.0422X+0.001和 :0.9936.Y:1.0176Z一0.0941. 3.2.5干扰试验选择1份混合血 清,分成2份,其中1份分别加入血红 蛋白,VitC和胆红素(含量为临床标本 中可能出现的最大含量),另1份不 加,按比例混合成5个不同干扰物浓 度,按NCCLS的方案评价.每份标本 重复测定20次.干扰值=各组均值 一 未加干扰物相应组的均值.对照这 一 浓度?1.96s,可得出某浓度内有无 干扰.VitC<5g/L,胆红素<342p,mol/ L,无明显干扰.血红蛋白>4g/L将弓 起负干扰. 4讨论 我们发展的甘油三酯测定方法, 仅用2种工具酶,能直接应用于Di. mensionAR生化分析仪的固有通道, 替代价格昂贵的原装试剂.钾离子和 氨离子在反应中能激活GDH,但当pH 在10.5时,铵离子是以氨的形式出 现,不能起到激活GDH的作用,因此 在实验中不用硫酸铵而采用l(2CO, 避免了潜在的仪器污染.根据文献 [2],钠离子达到67mmol/L时将抑止 GDH73%的活性,为了克服血清中钠 离子对检验结果的干扰,制备甘油三 酯标准液时用8.5s/L的氯化钠溶液 来校正.在甘油磷酸氧化酶Trinder反 应中,胆红素和VitC会引起负干扰,虽 然能用高铁氰化钾和VitC氧化酶来排 除干扰,但效果不甚理想.本法在 VitC达到5g/L和胆红素达到340 ~unol/L时无明显干扰. 参考文献: [1]杨昌国,李清华,吕邦泰.排除游离甘 油影响的甘油三酯酶法测定[J].中 华医学检验杂志,1992.15:259—261. [2]StevenH,GrossmanE,GerhardE,et a1.Simplified,totallyenzymaticmethod fordeterminationofflenlmtriglycerldes withacentrifugalanalyzer[J].Clin Chem,1976,22:1310—1313. 收稿日期:2002—03—25 中国肝病论坛学术会议征文 中华医学会学术部与宁波市医学会,定于2003年第一 季度在宁波召开”中国肝病论坛”学术会议.现将有关征 文具体事项通知如下: 1征文内容:病毒性,药物性,免疫性,酒精性,遗传性和胆 汁郁积性肝病以及脂肪肝,重症肝炎,肝纤维化,肝硬化,门 脉高压,肝癌,肝移植的流行病学,病毒学,分子生物学,免疫 学,实验室,病理与影像诊断学,预防与药物,内镜,介入和手 术治疗等方面内容.会议期间将邀请专家作专题学术. 2征文要求:报送的论文要求具科学性,先进性和实用性, 字迹工整,统计数据准确,未在全国性学术会议上交流及公 开出版发行的刊物上发表的论文,经单位同意盖章后,将全 ? 会议征文? 文和800字以内的论文摘要各1份(摘要应包括方法,目的, 结果,结论四部分,并在摘要题目下注明作者单位,邮政编 码,作者姓名)于2002年12月31日前寄往宁波市医学会, 朱丰盛同志收(宁波市迎风街21号,邮政编码315010,电话 0574--87295202),并在信封上注明”中国肝病论坛”字样. 在会议上交流的论文将择优在《现代实用医学》上发 表. 会议具体时间和安排待审稿后另行通知. 备注:?论文被录用者均可参加会议,并获得中华医学 会论文证书.?参加学术会议者,可获得I类继续医学教 育学分.