肠毒素大肠杆菌耐热肠毒素与谷胱甘肽巯基转移酶融合蛋白的制备和耐热肠毒素抗体测定

肠毒素大肠杆菌耐热肠毒素与谷胱甘肽巯基转移酶融合蛋白的制备和耐热肠毒素抗体测定 肠毒素大肠杆菌耐热肠毒素与谷胱甘肽巯基转移酶融合蛋白的制备和耐热肠毒素抗 体测定 肠毒素大肠杆菌耐热肠毒素与谷胱甘肽巯基转碴酶融合蛋自的制备和耐热壹塞塞堑 ? 免疫学技术与? 肠毒素大肠杆菌耐热肠毒素与谷胱甘肽巯基转移酶融合蛋白 的制备和耐热肠毒素抗体测定 郑继平刘向昕王令春王茼李淑琴张兆山?(军事医学科学院生物工程研究所,北京100071) 中国图分类号R373文献标识码A文章编号1000.484X(2005)08-0617.02 实现Srr抗体测定.方法:采用生物工程技术,融合[摘要]目的:弥补Srr的弱抗原性, 达GST和带有前导序列的突 变耐热肠毒素progF.,制备Srr融合蛋白,测定Srr抗体.结果:测到了抗ST的血清IgG和黏膜IgA.结论:融合蛋白GST/proST~ 能有效提高sr的抗原活性,可直接用于sr抗体测定. [关键词]耐热肠毒素;谷胱甘肽巯基转移酶;融合蛋白;抗体测定 ConstructionofenterotoxigenicEscherichiacoilheat-stableenterotoxinfusionpro- tein,vithglutathioneS-transferaseanddetectionofantibodyagainstheat-stableen- terotoxin ZHENGJi-Ping,LIUXiang-Xin,WANGLing-Chun,WANGPeng,Shu-Qin,ZHANGZha o-Shan.Beijing,"of Biotechnology,Bet100071,China lAbstractJObjective:Todetectionantibodyagainstheat—stableememto~nbyfusionprotein.Methods:Mutantheat—stableenterotoxin precursorgenewasligatedinvectorpGEX-4T-2toinductivelyexpressasafusionproteinGS T/proST.tl1glutattfioneS-transferase(GST).To investigatetheantigenicaction.semmandfecalantibodiesagainstheat—stableenterotoxinwasdet~tedWi山thisfusionprotein.Results:Thefu— sionproteinWaSaabout32kDprotein.AllthesamplescontaindieantibodyagainstST.Condu ~on:Suchstrategywasapromisingmethodto detectantibodyagainstheat?stableenterotoxin. [Keywords]Heat—stableenterotoxin;GlutatlfioneS-tr.1sfe;Fusionpmtem;Antibodydetection 耐热肠毒素(ST)由18,19个氨基酸组成,没有 免疫原性…,传统sT抗体测定是采用化学合成sT 与化学偶联的方法来提高sT的抗原活性].谷胱 甘肽巯基转移酶(GST)能有效增强融合的小分子目 的抗原的免疫原性.本研究尝试sT与GST融合来 测定sT抗体.同传统方法相比,该方法具有制备简 易,成本低的特点. 1材料与方法 1.1材料 1.1.1菌株与质粒菌株BL21(DE3),质粒pGEX一 4T-2,pXZL01为本实验室保存,载体pZST由本次研 究构建. 1.1.2试剂各种工具酶购自TaKaRa公司,GST 纯化试剂盒为AmershamBiosciences公司产品. 1.1.3培养基LB培养基;2XrIYA培养基:16L 水解蛋白胨,10g/L酵母粉,5g/LNaC1,调节pH值 至7.4. 1.1.4抗体sT多抗兔血清由本实验室制备,sr ?通讯作者,E—mail:zhangzs@nlc.bmi.ac.al 作者简介:郑继平(1973年一),男,博士,主要从事疫苗研究. 单克隆抗体由瑞典A肿.MariSvenneriholm教授惠赠. 1.2方法 1.2.1重组质粒的构建见图1. lsmaIlTBam.NHAI,EPc.o?R' ppro—STm or8 p cIGsTl96b " iIIGST… AP — Ptrc/ SinaiISmII | Ial lT4DNALigase 图1重组质粒pZST的构建 rig.1ConductionofplasmdpZST Tm 1.2.2融合蛋白的诱导表达与鉴定见文献[3]. 1.2.3融合蛋白的制备与纯化按照Ame~ham Bioscienc公司纯化试剂盒说明进行. 1.2.4ST抗体的测定以100fl(1融合蛋 白),孔包被酶联板,测定由表达疫苗株3次免疫 的BALBfc小鼠血清和粪便sT抗体. 2结果 2.1重组质粒的构建质粒pXZL01含有proST~基 因j,融合表达薮体pc既-4T.2含有csT基因. BamHI和EcoRI双酶切从p~L01获取pmST片 段,为保证proS'T,.的正确表达,与pcEx-4T_2多克隆 位点中的SmalI位点相连接,转入到BL21(DE3) 中,Ec0RI和SolI限制性内切酶双酶切筛选重组 质粒,正向连接的酶切片段为4974,192bp,命名为 p罂To 2.2融合蛋白的表达表l结果显示,含pZST的 重组菌表达了融合蛋白,融台蛋白能够与sT多 抗血清抗体结合,sT多抗血清中没有GST抗体,说 明融合蛋白在澳J定sT抗体方面具有良好特异性. 图2显示含pZST的重组菌中没有了26kn的 GST特征性蛋白.而产生一个分子量更大的约32kD 的蛋白.该蛋白能够与sr单抗结合.说明该蛋白为 GSTIproST.. 表l以多抗免血清ELISA测定GST/~.的表达 ofGSTtproST~byELISAtllpolyclonal Tab.1DHecti? rabbitanti-sel-tlanofST 图2Gp帆表达 ng.2FA'pressionanalysisofgSTtpra~= Note:L曲eI-3SDS-P^GE;Lane4.5We~m'nb【d.1.PrateinTr;2. L)~teat"BI21(DE3,):3.tye~tle0rBL21(1)E3,pGEX-4T-2); 4.LIedBE2I(DE3.~zsr);5.Lymkof11121(DE3,pG~-4T-2). 中国位症学杂志2005年第2I卷 图3G刚pr纯化分析 Fig.3SDS-PAGEanalysisofpurmedGSTtproST田 Not1Pr~elnnla;2Purifiedcp;3FiLtrate【B12[(DE3 I,e(761"帅4u;4hitatkmIll21(D船 I)]ysate~5LysateofBI21(D口.F'r);6.Ly~leof1312l(DE3 DcEK_4Tl_2) 2.3融合蛋白的纯化采用2×TYA培养基,对2L 诱导培养物进行纯化,最终共获得3nfl纯化蛋白. 分光光度法测定浓度为20nI111.蛋白纯度为70%. 图3电泳结果显示亲台层析后~ST/proSTm得到了很 好的浓缩和纯化. 2.4ST抗体测定测定结果显示第2,4,6用的免 疫B.~LI3/c小鼠血清sr抗体I滴度分别为25,20O 和20:30;第2,4周测到了粪便ST抗体sl. 3讨论 本研究采用具有天然抗原活性的突变sr与 GST相融合的方法构建的融合蛋白能够有效提高 的抗原活性,且GST部分不与sr多抗反应,保证 了对sT抗体测定的特异性,真实性和可靠性.同传 统合成全长盯蛋白,与BSA进行化学偶联的方法 相比】,本研究为sT抗体测定提供了更为廉价,易 行的包被抗原. 4参考文献 1NataroJP.Kq』B.Diarda%~mlcEsdta,~da【JJClinlcalMiem— biolqD-Re呻.1998;II(1):142-2/)l 2kdDE.~.eru,onDCDeve]olx'nentof?~pe6tiveenzlnm~ linki…呻mI啪y('I~tISA)IrEh日掘?"heat-~table部l lt,toxJn(SI.~)[J].JInramdc?lMetheds,1984;75(2):295-307. 3卢圣栎.现代分子生物学宴验技术[M第2版北京:中国协和 医科大学出版杜,200L:12-27. 4AhlenC,Wenner~C.H0l】Tgr龃JdIntec~md~titxdr嘲?tbeBfl盯 ,andiraratmizati~th0prototypeck,lemBsubunil.colonlzali~fnel~ nntigcm??目cBm"v~irm【JJ.Va~ine.1993;I1 {9):929-934 5你兵.李淑掣.张兆山d吐i产肠群素大脑扦茁耐热翳毒素和 不耐肠毒素B亚基融台基因的构建[J]中华流行病学杂志 1998;19(5】:49.52 [收稿2004-04-25修回2004-06-18] (编辑许四平) m硒l{ m"油