OLP T淋巴细胞亚群分析及T细胞分选和体外培养初步研究.pdf.doc

OLP T淋巴细胞亚群分析及T细胞分选和体外培养初步研究.pdf.doc 复旦大学 硕士学位 OLP T淋巴细胞亚群分析及T细胞分选和体外培养初步研究 姓名:赵黎 申请学位级别:硕士 专业:口腔临床医学 指导教师:孙红英 20090320 胞 凋 亡 检测 显示， 传代培养第 , 欤 , δ芙 】 迪 赴 , , , , , ， , ( , サ 腛 , , , , 颊 咄 庵 苎猅 细 胞 亚群分 析 明, , 颊 逤, , 细 胞 上 升， 即 , 种葡 赴 , , , 从 , , 庵 苎V蟹 掷氤龈叽 慷燃案 呋 盍Φ 腡 淋巴细 胞 ， 并可 成 功 进 行 体 外 培养 , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ( , , , , , , , , , , 琣 , , , , , , , , , , , , , , ,,,,, ,,,,,,,,,,,,珻, , , , , , , , , , , , , , , 琣 , ,,,,, ,,,,,, ,, , , , , , , , , , , , , , , ,,( ,,, , , , , , , , , , , , , , ,,,,,, ,,( , , , , , , , , , , ,, , , , , , , , , , , 琺 , 琧 , , , , , , , ,, , , , , , , , , , , , ,,, , , , , , , , , ,, , , , , , , , , , , , , 缩写 词 , , , , , , , 主要 组织 相 容 性 , , , , , , , , , 复 合 体 外 周 血单个核 细 胞 , , , , , 和 ’苦 , , , , , , ， , , 将 其 列 为 癌 前状态 ?, 。 口 腔扁 平 苔 藓 发病 率为 达 淋巴 细胞 功 能相 关 抗 原 研究。 , 本课 题 涉 及三 部分: 第 一 部分 :人 , , 庵 苎 猅 细胞 亚群 分 析 亚 群 变 化 情 况 的 研 究不 多 ，且 结论有不 同 之 处 ，为 此 ，本 研 究对 , , 颊咄庵 苎 V蠺 淋 ,,研 究对 象 ,,,患 者纳 入 标 准: , , て 诠 媛 煞,? 钥刂撇 ?榈 南低承约膊, 自 身 免 疫 性疾 病 、糖 尿 病 、心 血 管疾 , , 个 月 内 使 用过抗生素 、 免 疫 制 剂 者; ,,主要 试 剂 , , , , , , , 疌, , , , , , , , , , , , , , 二 方 法 , ,混 匀 ，, , , , , 尤 , , , , 流式 细 胞 仪数 据 获 取 和分 析 , , , , 甁 , , , , , 照 鲥 【 外 , 軯, , , , 柔躩 ‘, , , 黋 , 甪 西, , , , , , 珻 , , , , ， , , , 忠 存 ‘组 , 二, , ,哉 兆閕 也 彳, 档 蚮 , 尢 、 , , 著 ‘, , 差 片 , , ( , , ,, 表 , 及 流 式 枪测 图 , — , , , ?, 确 ? 謑 , 颊 咄 庵苎V蠧 , , 淋巴 细 胞 ,”,发 现 无 论是 早 期还 是 晚期病 变 ， 本 次实 验 发 现 ,,颊 咦 橥 庵苎V蠧 ,,与 正 常 对 照 组 外 周 血 相比有 明显升 高 , ,,,,,現 ,,可 对 单 细 胞或 其 他 生 物颗 粒膜 表 面 以及 内部 的 , 众多研 究 表明, 馨 拖 赴 , 贠 , , 发病 中 发挥 重 要 作 用，关 于 口 腔 扁 平 苔 藓患者 , 赴 , 姆 掷 爰 芭嘌, 壳肮 , 谕 馍形 醇, 南妆 ǖ溃 , , 赥淋巴 细 胞 在扁 平 苔 藓发病 中 的 重 要 作用，我 们 认为，从 , , 颊哐 <白 橹 , 瓯 局 行 蠺淋巴 细 胞 分 选及 体外培养 和 免疫 分 析 具 有重 要 意义 ，有助于 进一 步了 解上 皮 及 免疫 细 胞 的 相互作用，明确疾病 的 发病 机 理 ，并 为后 期 进行 上 皮 一 淋巴 免疫 共建 打下基 础 。 三 蒸 水蒸 馏 器 ,,培养 液 胎 牛 血 清 青霉 素 、 链 霉 素 , , , , 胶 猓, 稳芤 海 , ( , , , , , ( , , , 、 , , , , :, , ( , 篛 、 , , , 惶 ㄏ 陆, 孪 释 庵苎 , , , 訢, , , 等 比例 稀释 。 ,,取 ,,离心 管 中 ，于 管 底加入 淋巴 细 胞分 离液, ,。 ,,,磁珠 孵 育 , , 将分 离柱 从 分 离器 中 取 出，并 将其至 于 , , 离心 管 中 。 , , 匦 , 螅, , , , 分 钟 。 , , 以 , , 培养 基 , 琁 , , , 胎 牛 血 清 , , 重 悬。 镜 下观 察 死 细 胞被 染成淡 蓝色 ，而 活 细 胞拒 染，根 据下式 计 算 细 胞活 力 :细 , , 观 察 其生长 情 况并 于 第 , , ，, , 天 行 倒 置 相差 显 微 镜 摄 像 。 , , , , 荧 光 抗体 , , 。 , , 吸 出 上 层 悬 液 后 再 重 复 操作 一 次 ， 以 洗去多余抗体 。 , , 将, , , , ( , , 鱿 赴 , , 鲋 列 碌 , , 离 心 管 。 , 狥 , , , , , , 尤 , , 实验 结 果 所下降 ， 这是 由 于 分 离 和培养过程中一些细胞 失 去活力 并渐 渐 碎 裂 。 多数细胞 在第二 到 三天 发 生显著 变 化， 形 态上 表 现 为细胞 体 积 明显增 大 ,本 犊 稍 黾右槐 兑 陨 ,， 为圆 形 ， 也 有 不规 则形 ， 倒 置 显微镜 于 , 倍 下 可 见 小的 点 状深 色 团块 ， , , 都 , , 倍 倒 置 显微镜 下 观 察 细胞 团块 ， 可 见 细胞 成 聚 集 状态， 形 成 椭 圆 行 外 观 , , ， , ， 此时细 胞 具 贴壁 生 长 和 集 群 生 长 能 力 ， 并随 时间 推 移 集 群 生 长 占优 ， 形 成 肉 眼 可 见 的 由 几 十 一 : ? ? ? 矿 , , 传 第, , 大 , ， , 嬖 胞 ( 附 , , 图 , 图 , , , 糽 营养， 凶 此发 ,卜 凋 ,:增 加 。 附 凋 亡 检 测 数值 表 ; , 馨拖赴 , 蛲 黾 觳饬 魇酵, , , , 图 , , , , ,唬 簀 人晚 ,禝,周 ,,杭 癏 ( 孤 匹 , , , , , , 凇 Ц , 油晟 啤 , , , , 胞 的增 殖、 分化 和活 化 ， 增 强 靶 细 胞 的功 能 。 , , , , 后 期 可 形 成 大 的细 胞 团。 传 代 后 细 胞 生 长 加 快， 后 期 细 胞 增 殖分裂 能 力下降 ， 细 胞 团 块分解 散开细 胞 死 亡 ， 传 代 目的主 要 为 搅 散大 的细 胞 集聚团块， 有利 于 细 胞 与 培养液 的充 分接 触 ， 利 于 细 胞 生 长 ， 避 免因营 养缺 乏 而导 致 的细 胞 死 亡 ， 大 细 胞 团块经过 搅 动 后 变 为 分散的细 胞 或小 细 胞 团， 可 再 次 集聚生 长 ， 但 是后 期 单 个 细 胞 不 易生 长 ， 易 细 胞 碎 解 死 亡。 , 原 理 为 ， 正 常细 胞 膜 磷 脂 的分布 是不 对 称 的， 膜 内 表 面含负电 的磷 脂 ， 如 磷 脂 酰 丝氨酸 , , , , , , , , , , 琍 , ， 而膜 外表 面绝 大 多数为 中 性磷 脂 。 在细 胞 凋亡 早 期 ， , 从 细 胞 膜 内 侧翻 转 到 细 胞 膜 的表 面， 暴露 在细 胞 外环境 中 , 。 , , , , 是一种 分子 量 为 , , , , , 的, , 依 赖性磷 脂 结合蛋 白， 能 与 , 高 亲和力特 异 性结合。 将 , , , , 进 行 异 硫氰 酸荧 光 素 , , , , , , 这样 就可 以将 早 、 晚期凋亡 细胞 和 死 细胞 区分不 来 。 , , 虾 ; 懔 , 潜 淼 缱佑 邢拊 鹑 喂 , , , 本 , , , , , , , 拦鶬, , , , , , , , 拦鶥, , , , ,,,排 除 标 准:同 第 一 部 分 存待用 。 进 行病理 组 织 检 查 组 织 块 置 于 ,,福 尔马 林 中 待用 。 ,,组 织 块 操 作方 法 : 实验 结 果 口 腔 组 织 块 经 过 中 性 蛋 白酶消化 去 除 上 皮 层 后， 再 经 过 机 械分 离 和 酶消化 后过 滤 , 讨 论 ,掷 胍,?,。 肿 瘤组 织如 肺癌 中 淋 巴细 胞分 离常首 先 通过 机 械 剪 碎后，在胶 原酶消 化后，通过 滤 网 获得 单 分 离液 之 间收 集淋 巴细 胞?盯。 分 析, ,橹, ?砀 谋 淇芍 # 琌 ,为 基 底膜 区 角 化细 胞变 性，上 皮 基 底膜 崩 解 ， 上 皮 下 , 赴 , 秩 蟆 , 虼 艘 ;竦肨 淋 巴细 胞首 先 应 该除 去 上 皮 层 ，暴露上 皮 下 层 的淋 巴细 胞，再 通过 机 械 和 酶消 化 作 用游 离暴露的淋 巴细 胞。 除 去 上 皮 层 的优 点为 ，能减 少 后面 操 作 中 上 皮 细 胞混杂于 后续 细 胞悬 液 中 ，并 在较 保 留 上 皮 层 的直 接 剪 碎消 化 更利于 淋 巴细 胞提 取 。 揭去 上 皮 层 后增 大 消 化 酶和 剩 余 在这 一 部分 我们 运用中 性蛋 白 酶 上 皮 下 组 织 的接 触 面 积 ，有 利于 上 皮 下 淋 巴细 胞的游 离。 缺 点主要 是 在上 皮 层 内 有 浸 实验 中 发 现，经 过 酶消 化和 机 械 消 化后细 胞得 量 不 足 ，镜 下 观察 发 现细 胞杂乱 , , 颊 咄 庵苎猅 细 胞 亚群分析 表 明 , , 颊 咦橥 庵苎V 蠧, , 与 正 常对 照组 外 养 时间 过 长所 致 凋亡 增 加影 响 其特 异代 表性。 量 上 的 损 失 和细 胞 活力的 降 低 ， 都 给 后 期实 验操 作和分析 带 来 很 大 困难 。 实 验条件还 本 研究的 特 色 与 创新 , 馨 拖 赴 , 逋 馀 嘌, 逑 担 , ? 诖舜 问笛 橹 卸 訲 淋 巴 细 胞 进 行相 , , , , , , 【 , , , , , 珽 , , , 珻, , , , , ( , , , , , ,,,,,,,,,: , , , , , 【 ,,,,, ,, , , , , , , , , ,,,,,,,,,,; ,: ,,,( ,， ,( ,琕 ,( ,畇 ,,,,篢 ,,,, , , ,, , , ,,,,,,,( , ,, , , , , ,, , ， , , , , , , , , , ,,,,( ,, , 琒 , , , , ,, , , , , ,,, ,,,,,( ,, ,, ,, , , , ,,,,,甁 , 現 , , , , ,, , , , , , , , , , , , , , , ,緽 ,,， ,, , , , , , ,,?,( , 甅 ( , , , , ,,,,,， ,甁 ， ,, , 甒 ( ,,琣, , , ,,,, , , , , , , 瓸 , , ,, , , , , , , , ( , , , , , , , , ,,, 綣 】 ( ,,,,,,, ,， ,,,, 【 ,】 , ， , , , ,,,, ,, , , , , , , , , , , , , , , , , , , 【 ,】 ,,,, , , , , , ， , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ! 猄 , , , , , 【 ,浚 甁 ,,, , , , , , , 【 ,】 ,,, ,,,?,?,,,,, , , , , , , , , , , , , , , ,,,,,【 ,浚 瓻 , , ,,,,,,, 【 ,,,,, , , , 【 ,浚 甈 ,, ,琓 ,,, , , , , , , , , , , , , ,,,( ,,,( 【 ,浚 畁 ,,,,: ,,— , , , , , , ,,: ,,?,, , ， , 【 ,,,,,, , , , , ， , ,, ,,,, , ( , , , , 琣 , , 隣, 相关的 免 疫 细 胞 , , , 芴 錞 , , 引 发角 化 细 胞凋 亡 ， 当 然这一 凋 亡 过 , 趋化 因子 , , , 土 街諧, 趋化 因子 , , 虸, , 。 体外培 养 的 经 过 , , 激活 的 的 人口 发展 的 关系 仍有待进 一 步研究。 ,, , , 猋 的 含 量 , А, , , 可 通 过 上 调 , , , , 编 码 免 疫 和 前 炎 症介质基因， 提示 , , , , , , 【 ,縈 , ( , ,,,, , , , , , , :, , , , , , ， , , , , , , , , , , ， , , , , 琇 , , , , , , , , , , , , ,,,:, , , , , , , ,,, , ( , , , , , , ,, , , , , , , , ,( ,, ,】 ,,,, , , , , , , , ， , , , , , , :, ,,, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , 瓵 ,,,,疭 , 琈 , , , , ,, , , , , , , ,, ,,, ,, , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,, , , , , , , , , ,,,,, , , , , , , , ， , , ,, , , , ,, , , , ( , , , , , , , , , , , ,,,, ,,,,,( ,, ,,, , , , , , , 甁 , , ,縎 ,,,,,,, , , , , ,, , , , , , , ( , , , , ,, , , , , ,,,,,,,,( , 珿 , , , , , , , , , 珺 , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , 甁 , , , , ,琖 ,, , , , , , , ,, , , ， , , , , ,, ,,, ,,,( ,, , ， , , , , , , , , , ,， ,,,, , , , , , ,, , , , , , , ( , , , , ， , , , ， , , , , , ,, , , , , , ,ぁ,,, , ,( ,,, ,,,,,,,,, , , , , , , , , , , ,珺 ,,, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,, , , , , ， , , , , ， , , ( , , , , , , , , , , , , , 【 ,,,,,,,,,,,,琒 ,,,,( , , ,, ,,, ,,,,,甁 ,,,,,,, , , , , , ,, , , , , , , , , , , , , , , ,, , , , ,,,,, , , , , , , , , , , 疌 , , , , , , ( , , , , , , , , , , , ,