三磷酸腺苷对大鼠移植胰腺细胞死亡方式的影响_医学论文

三磷酸腺苷对大鼠移植胰腺细胞死亡方式的影响_医学论文 三磷酸腺苷对大鼠移植胰腺细胞死亡方式的影响_医学论文 【摘要】 目的 研究三磷酸腺苷(ATP)对大鼠移植胰腺细胞死亡方式 的影响，探讨ATP对大鼠移植胰腺缺血再灌注损伤的作用及相关机 制。方法 SD大鼠102只，随机分为假手术组、单纯移植组和ATP保 护组，后2组按再灌注时间再各分为0、1、6、12 h亚组，单纯移植 组供体胰腺单纯用肝素平衡盐液进行低温(0,4?)灌注并保存60 min后行移植手术，ATP保护组供体胰腺用添加了ATP的肝素平衡盐 液进行低温(0,4?)灌注并保存60 min后行移植手术。观察ATP对 血糖、血清脂肪酶、淀粉酶含量和胰腺组织病理学变化的影响，研究 胰腺组织ATP含量与凋亡、胀亡细胞百分比的关系。结果 ATP保护 组胰腺组织病理损伤明显轻于单纯移植组，再灌注6、12 h ATP保护 组血糖、血清淀粉酶、脂肪酶含量明显低于同时间点单纯移植组 (血 糖、脂肪酶，0.05;淀粉酶，0. 01)，再灌注0、1 h ATP保护组胰 腺组织ATP含量明显高于同时间点单纯移植组(0.01)，ATP保护组 胀亡细胞百分比明显小于同时间点单纯移植组(0、1、6 h，0.01;12 h, 0.05)，ATP保护组细胞的主要死亡方式是凋亡，ATP含量与胀亡 细胞百分比明显负相关(r=-0.956, 0.01),与凋亡细胞百分比无明 显相关。结论 ATP促进移植胰腺的不可逆损伤细胞以凋亡方式死亡， 减少细胞胀亡的发生。 【关键词】 胰十二指肠移植;三磷酸腺苷;细胞凋亡;细胞胀亡 Abstract:Objective To study the effects of adenosine triphosphate (ATP) on the death pattern of transplanted pancreatic cells in diabetic rat models to explore the protective mechanism of ATP against the I/R injury of the graft.Methods 102 drug-induced diabetic SD rats were randomized into 3 groups: sham operation group, simple transplant group and ATP protection group. The latter two groups were further divided into subgroups 0h, 1 h, 6 h and 12 h according to the start time points of reperfusion respectivly. The isolated pancreas from donor rat was (re-)perfused with calciparine balanced saline and stored at 0,4? for 60 min before transplantation. ATP as an additive agent was added to the saline used in the ATP protection group, not to that for the simple transplant group. Blood sugar，plasma amylase and lipase concentrations, and ATP content in pancreatic tissue, were determined when the recipient rats were killed to perform histopathological study later. The percentages of normal, apoptotic, oncotic and necrotic cells were determined by flow cytometry.Results It was found that the histomorphological changes of pancreas in ATP group were much milder than those in simple transplant group. The blood sugar，plasma concentrations of amylase and lipase were significantly lower in the ATP subgroups 6 h and 12 h than in the corresponding simple transplant subgroups (0.05, 0.01). The tissue concentration of ATP was higher in the ATP subgroups 0 h and 1 h than in that of simple transplant group (0. 01). The percentage of oncotic cells was significantly lower in all ATP protection subgroups than in those of the simple transplant group (0.01, 0.05) the dead cells were mainly apoptotic ones in ATP group. The tissue concentration of ATP was negatively correlated with the percentage of oncotic cells (r=-0.956, 0.01), but not correlated with that of apoptotic cells.Conclusion ATP can promote the inconvertibly-damaged cells to die of apoptosis and decrease the development of oncosis. Key words: pancreaticoduodenal transplantation adenosine triphosphate apoptosis oncosis 缺血再灌注损伤(I/RI)导致的胰腺细胞死亡是胰腺移植术后移植 胰腺功能不良的主要原因,1,。近年来的研究明，细胞死亡方式包 括凋亡与胀亡，凋亡是需要三磷酸腺苷(ATP)参与的主动性细胞死 亡，胀亡是细胞缺乏ATP时的被动性死亡,2,;由于胀亡可以引起严 重的炎症反应，凋亡是一种更有利于机体的细胞死亡方式,3,。有资料显示,4,，外源性ATP能够进入低温保存的胰腺细胞内。我们利用在器官灌注保存液中加入外源性ATP的方法提高胰腺组织ATP含量，研究ATP对移植胰腺细胞死亡方式的影响，探索新的保护移植胰腺缺血再灌注损伤的方法。 1 材料和方法 1.1 实验动物与分组 健康清洁级、近交系封闭群SD大鼠102只，均为雄性，体重250,300 g，徐州医学院实验动物中心提供。随机分为假手术组(6只)、单纯移植组和ATP保护组，后2组按再灌注时间再各分为0、1、6、12 h亚组(每亚组12只)。假手术组仅行开腹及暴露胰腺手术，单纯移植组供体胰腺单纯用肝素平衡盐液进行低温(0,4?)灌注并保存60 min后行移植手术，ATP保护组供体胰腺用添加了5 mmol/L ATP的肝素平衡盐液进行低温(0,4?)灌注并保存60 min后行移植手术。 1.2 动物模型制作 采用张召辉、李玺,5,方法行大鼠胰十二指肠移植，建立大鼠移植胰腺I/RI模型。切除受体左肾，将供体带腹腔动脉和肠系膜上动脉的腹主动脉段与受体腹主动脉端侧吻合，供体门静脉与受体左肾静脉行端端吻合，供体的十二指肠远端与受体上段空肠作端侧吻合。 1.3 围术期处理 实验前1周受体大鼠经阴茎背静脉按55 mg/kg 一次注入链脲霉素(美国Sigma公司)制备空腹血糖?16.8 mmol/L的糖尿病模型。术前禁食不禁水24 h，肌注氨苄青霉素(100 mg/kg)预防感染。于设计时间点抽血后处死动物并切取胰腺行各项检查。 1.4 血糖、血清淀粉酶、脂肪酶检测 血糖测定采用美国强生血糖仪，淀粉酶、脂肪酶测定采用日立7600-010型全自动生化仪。 1.5 组织病理学检查 切取部分胰腺标本制成石蜡切片后行苏木精-伊红染色，每只动物取2张切片在光学显微镜下观察组织细胞形态学改变，采用Schmidt方法,6,由2位病理科医师进行双盲评分。 1.6 胰腺组织ATP含量测定 切取胰腺组织约0. 5 cm×0.5 cm×0.5 cm，应用岛津SCL-10AVP高效液相色谱仪以反相高效液相色谱法测定胰腺组织ATP含量。 1.7 凋亡和胀亡细胞百分比测定 取胰腺组织1 g，生理盐水洗净，剪碎，振荡后300目筛网过滤，收集细胞制成细胞悬液，调整细胞至1×109个/L，加标记有异硫氰酸荧光素的联结素V(AnnexinV,FITC，上海晶美生物工程有限公司)与碘化丙锭(PI，美国Sigma公司)，混匀双染色。避光冰浴10 min，使用流式细胞仪检测各类细胞百分比。结果判断:正常活细胞(Annexin V,、PI,),胀亡细胞(Annexin V，、PI，),凋亡细胞(Annexin V，、PI,),坏死细胞(Annexin V,、PI，)。 1.8 统计学处理 数据以?s表示，采用q检验及相关，0.05为有统计学意义。 2 结 果 2.1 组织病理学变化 光镜下，假手术组未见明显异常表现;单纯移植0 h亚组胰腺细胞轻度水肿，1 h亚组炎性细胞浸润明显，6 h、12 h亚组，腺泡坏死、出血和炎症细胞浸润严重;ATP保护组与单纯移植组相比，细胞水肿、炎细胞浸润、出血及腺泡坏死均明显减轻。胰腺组织病理学评分明显降低(水肿、出血、炎细胞浸润评分，0.05;腺泡坏死评分，0. 01 )。见表1。表1 各组大鼠胰腺组织病理学评分与假手术组比较:**,<0.01;与同时间点单纯移植组比较:#,<0.05，##,<0.01 2.2 血生化变化 ATP保护组再灌注6、12 h后血糖、血清淀粉酶和脂肪酶含量均较同时点单纯移植组明显降低(P,0.05或P,0.01)。见表2。表2 各组大鼠血糖、血清淀粉酶、脂肪酶含量与假手术组比较:*0.05,**0.01与同时间点单纯移植组比较:#0.05，##0.01 2.3 胰腺组织ATP含量和胀亡、凋亡细胞百分比的变化 ATP保护组再灌注0、1 h时胰腺组织ATP含量较相应单纯移植组明显增高(0.01)，ATP保护组各时间点胀亡细胞百分比较相应单纯移植组均明显降低(0.05)，ATP保护组胰腺细胞的死亡方式主要是凋亡，ATP含量与胀亡细胞百分比明显负相关(r=-0.956, 0.01),与凋亡细胞百分比无明显相关。见表3。表3 各组大鼠胰腺组织胀亡、凋亡、坏死、正常细胞百分比与假手术组比较:*0.05，**0.01;与同时点单纯移植组比较:#0.05，##0.01 3 讨 论 有学者研究发现,低温保存的肝脏细胞内ATP水平与移植后肝脏活力密切相关,7,，Bowers等,8,提出低温保存器官移植前细胞内ATP 水平是判定保存器官活力的一项重要指标。本实验结果显示，单纯移植0 h、1 h亚组胰腺组织ATP含量较假手术组显著降低，ATP保护0 h、1 h亚组胰腺组织ATP含量较相应单纯移植组显著升高，说明在器官灌注保存液中添加外源性ATP可以增加大鼠胰腺组织ATP含量。结果同时显示，ATP保护组胰腺组织病理评分较相应单纯移植组显著降低，再灌注6、12 h后血清淀粉酶、脂肪酶、血糖含量较相应单纯移植组显著降低，说明ATP可以减轻大鼠移植胰腺病理损伤，改善大鼠移植胰腺内分泌功能，即ATP可以减轻大鼠移植胰腺I/RI。根据本实验结果，ATP保护组在胰腺组织ATP含量显著高于单纯移植组的同时，胰腺细胞主要以凋亡方式死亡，说明外源性ATP促进不可逆损伤的胰腺细胞以凋亡的方式死亡;ATP保护组在胰腺组织ATP含量显著高于单纯移植组的同时，胀亡细胞百分比显著小于单纯移植组，并且统计分析提示胰腺组织ATP含量与胀亡细胞百分比显著负相关，说明外源性ATP可以减少移植胰腺细胞胀亡的发生。统计分析提示:ATP含量与凋亡细胞百分比无明显相关，与ATP促进胰腺细胞凋亡并不矛盾，细胞凋亡是需要ATP参与的程序性细胞死亡，但凋亡有自身的变化规律。缺血再灌注导致细胞损伤后，在ATP充足的情况下，不可逆损伤细胞发生凋亡，凋亡高峰一般位于再灌注1,3 h，然后会呈减少趋势;不可逆损伤细胞在缺乏ATP时无法启动凋亡程序，则会发生胀亡。 由于细胞以凋亡的方式死亡远比以胀亡的方式死亡对组织的损害要轻，提示促进细胞凋亡、减少细胞胀亡可能是外源性ATP保护大鼠移植胰腺I/RI的重要机制。当I/RI不可避免时，减少缺血所引起的缺氧及能量消耗这一始动因素，如在术前或术中给予能量物质暂时提高组织细胞能量储备，有利于促进受损细胞以凋亡方式死亡，减少细胞胀亡的发生，从而减轻移植器官I/RI。 【参考文献】 ,1, Drognitz O, Liu X, Benz S, et al. 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