突变重组人卵透明带蛋白3的生物活性研究（可编辑）

突变重组人卵透明带蛋白3的生物活性研究（可编辑） 目 录 摘 要.I ABSTRACT. II 1 前言. 1 1.1 卵透明带避孕疫苗概述2 1.2 mrhZP3 在毕赤酵母中的达. 3 1.3 粘膜免疫5 1.4 mrhZP3 诱发人精子顶体反应的临床意义7 1.5 本研究的目的和意义 8 1.6 本研究的技术路线. 9 2 实验材料、试剂与仪器.11 2.1 实验材料与试剂.11 2.2 主要实验仪器. 12 3 实验方法 12 3.1 酵母工程菌的筛选及目的蛋白的诱导表达13 3.2 高密度发酵生产mrhZP313 3.3 mrhZP3 的分离纯化 14 3.4 mrhZP3 纯化条件的优化. 15 3.5 SDS-PAGE 16 3.6 免疫印迹(Western blotting)鉴定目的蛋白16 3.7 mrhZP3 蛋白免疫小鼠17 3.8 抗卵透明带抗体的测定 18 3.9 小鼠抗生育实验 18 3.10 小鼠卵巢组织结构的观察18 3.11 mrhZP3 诱发人精子顶体反应 18 4 实验结果 21 4.1 不同载体mrhZP3 酵母工程菌株的鉴定和筛选21 4.2 mrhZP3 的金属螯合层析. 21 4.3 不同上样浓度对纯化效果的影响22 4.4 不同pH测试方法对纯化效果的影响. 23 4.5 mrhZP3 的Western blotting分析 23 4.6 免疫组小鼠血清抗ZP3 IgG抗体反应结果. 24 4.7 空白对照组小鼠血清抗ZP3 抗体反应结果26 4.8 小鼠的抗生育结果26 4.9 卵巢的组织学观察26 4.10 mrhZP3 诱发人精子顶体反应结果. 27 5 讨 论. 29 5.1 毕赤酵母表达mrhZP3 295.2 mrhZP3 蛋白的纯化305.3 mrhZP3 诱 发人精子顶体反应活性测定. 31 5.4 注射免疫和生殖道粘膜免疫. 33 5.5 免疫对小鼠卵巢的影响 35 5.6 结论和展望35 6 参考文献 37 附录43 附录 ?本研究中所用常规实验方法43 附录 ?本研究中所用试剂. 44 附录 ?英文缩略词索引. 50 致 谢. 51 摘 要 本研究采用突变重组人卵透明带蛋白3(mutant recombinant human zona pellucida protein 3,mrhZP3)酵母工程菌株,经小规模甲醇诱导表达,筛选高表达酵母菌株。在2 L 发酵罐中进行高密度发酵生产mrhZP3。分离浓缩发酵上清液,通过螯合镍离子的亲和柱 纯化mrhZP3并进行工艺优化。通过SDS-PAGE 和Western blotting鉴定,与rhZP3的分子量 和表达产量进行比较,并进行诱发人精子顶体反应实验和小鼠免疫实验。实验小鼠分4组, 每组10只雌性小鼠。A组采用mrhZP3蛋白阴道栓剂进行免疫,B组使用不含mrhZP3蛋白的 阴道栓剂,C组注射mrhZP3蛋白进行免疫,D组注射空白佐剂做为对照。每组动物接受4 次免疫(第0、1、2、3周)。采用ELISA法监测小鼠血清抗体滴度变化。第5周合笼,第8 周统计雌鼠怀孕情况,取实验小鼠双侧卵巢做病理冰冻切片,光镜观察卵巢 病理学变化。 Western blotting结果显示mrhZP3具备抗原活性。mrhZP3可诱发人精子发生顶体反应。分 别采用mrhZP3和pZP3作为包被抗原,C组小鼠血清中均检测到明显的抗ZP3 IgG抗体,A 组、B组和D组小鼠血清中未检测出抗ZP3抗体。统计受孕率,A组、B组、C组和D组小鼠 的受孕率分别为0、9/10、0及8/10,统计学检验分析表明A组与B组,C组和D组间的差异 有统计学意义(P 0.01),结果显示mrhZP3蛋白具备较强的抗生育效能。小鼠卵巢切片 的组织病理学观察结果表明,实验小鼠的卵巢组织均未观察到明显的病理变化。本研究结 果初步表明mrhZP3具有与天然人卵透明带相似的诱发人精子顶体反应活性和抗原活性, 并为发展不孕不育检测试剂和避孕疫苗提供了实验依据。 关键词:卵透明带;巴氏毕赤酵母;蛋白纯化;粘膜免疫;顶体反应 IAbstract In the present study, the Pichia pastoris strains which protease cleavage sites of hZP3 had been replaced for producing the mutant recombinant human zona pellucida protein 3mrhZP3 were adopted. Induced by methanol, mrhZP3 were expressed in shake flasks. High-efficiency strains were chose to produce mrhZP3 in high-density fermentation. The fermentative supernatants were separated and concentrated. Under the optimized conditions, mrhZP3 were 2+ purified by Ni metal chelating chromatography. The purified mrhZP3 were identified by SDS-PAGE and Western blotting. Then mrhZP3 were compared with rhZP3 in molecular weight and yield. Human sperm acrosome reaction was induced by mrhZP3. Female mice were immunized with mrhZP3. The mice were divided into four groups at random, each group 10 mice. Group A were immunized with mrhZP3 suppository by vagina, the suppository without mrhZP3 were administered to group B. Group C were immunized with mrhZP3 by muscle injection, and group D were injected with adjuvant only. All the groups were administered on week 0, 1, 2, and 3. Serum samples of the immunized mice were collected on week 1, 2, 3, and 5. The antibodies against ZP3 were detected by ELISA. The female mice were mated on week 5 and killed on week 8 for checking pregnancy. Ovarian frozen sections were prepared for microscopical pathological observation. The antigenic activity of mrhZP3 was confirmed by Western blotting. The human sperm acrosome reaction was induced with mrhZP3. With mrhZP3 and pZP3 as coating antigens respectively, the antibodies could be detected in group C, while none were detected in the sera of group A, B and D. Pregnancy rate of group A was 0, B was 9/10, C was 0 and D was 8/10. There were significant statistic differences between group A and B, between group C and D P 0.01. No obvious pathological changes were observed in the mice ovarian frozen sections. The results implied mrhZP3 are similar to natural human ZP in inducing sperm acrosome reaction and mrhZP3 possess antigenic activity, mrhZP3 has the potential to develop diagnostic kits for AR and effective contraceptive vaccine Key words: zona pellucida; Pichia pastoris; purification; mucosal immunization; acrosome reaction II 突变重组人卵透明带蛋白 3 的生物活性研究 1 前言 世界人口的急剧增长给可持续发展带来巨大挑战。世界人口数量已经从 1950 年的 25 亿和 1980 年的 44 亿猛增到 2000 年的 60多亿。据可持续发展世界首脑会议提供的资料, 联合国预计全球人口将增加到 2025 年的 80 亿和 2050 年 93 亿,预计全球人口能稳定在 105 或 110亿左右。而未来的几乎所有人口增长均来自于发展中国家,为此未来世界不得 不养活另外的 50 亿人。随着人口的增长和人们生活水平的提高,土地、水资源、能源和 其他自然资源将更加紧张,特别是在发展中国家,可能会引发空前的危机。控制人口增加 己成为一个全球性刻不容缓的关键问题,而选择有效的避孕节育方法已成为控制人口数量 的主要手段之一。但尽管目前有多种避孕节育措施,却均有着这样或那样的弊端,不尽如 人意。研究一种新型、安全、廉价、无毒副作用的避孕方法已是当务之急。早在 70 年代 末世界卫生组织WHO就致力于研究和建立新的生育调节方法,并取得了一些进展。其中 免疫避孕是生育调节方法研究中一个非常重要的领域,近年来免疫避孕研究一直围绕着: ? 寻找合适的免疫抗原;? 探索昀佳的免疫传递体系;? 选择适当的免疫途径和方式 等三个方面进行着,并取得了一些进展。目前己鉴定了包括ZP3,SP22,YWK等多种抗 原。免疫体系也多种多样:有的以蛋白辅以佐剂进行免疫;有的以携带目的片段的质粒 DNA直接进行免疫;有的以沙门氏菌或病毒为载体进行免疫。免疫途径也各异,如粘膜 免疫的口服免疫、鼻腔免疫、阴道免疫、直肠免疫等。而今后免疫避孕研究的热点主要围 绕以下几个方面:? 雌雄性生殖道粘膜免疫系统的作用机制,尤其是细胞介导的免疫反 应机制,继续寻找和鉴定那些在淋巴细胞导航、定位等过程中起关键作用的受体及其配体; ? 继续寻找和鉴定那些在人类生殖过程中起作用的、免疫原性较高的抗原;? 在此基础 上寻找适当的抗原免疫途径和方式,以期获得昀佳免疫应答。一种具有使用价值的避孕疫 苗必须是安全有效的,长效而又可逆,价格较低,易于应用,对温度稳定,能长期保存。 在高等哺乳动物中,卵透明带zona pellucida,ZP是一个特异性抗生育阻断位点,国内外 已对卵透明带避孕疫苗进行了多层次的研究。本研究选用毕赤酵母表达系统表达rhZP3 突 变体,对比注射免疫和阴道粘膜免疫等不同免疫途径的抗生育效果,为卵透明带避孕疫苗 的研究提供重要资料。 1暨南大学硕士学位论文 1.1 卵透明带避孕疫苗概述 哺乳动物卵透明带是由卵母细胞及颗粒细胞分泌并覆盖于卵母细胞及着床前受精卵 [1] 外的一层丝状酸性糖蛋白基质,主要由ZP1、ZP2、ZP3 三种糖蛋白组成 。卵透明带的 生物学功能涉及精卵识别和结合,顶体反应以及防止多精子受精等许多重要生殖事件,影 响受精过程的成败。在空间结构上,ZP1 发挥结构支撑功能,把ZP2 和ZP3 横向连接起来, 形成一种三维网状结构。功能上ZP3 被认为是第一精子受体,是精卵识别结合的主要成分, 而且还是诱发精子顶体反应导致精子穿透的物质,ZP2 是第二精子受体,与发生顶体反应 的精子结合,ZP1 只起连接ZP2 和ZP3 的作用。在哺乳动物中,控制这三种糖蛋白的基因 在各种属间有很大的同源性,编码卵透明带蛋白的基因在进化上是保守的。如猪ZP3 和人 ZP3 的氨基酸序列同源性是 74%,冠毛猕猴ZP3 和人ZP3 的同源性是 94%,小鼠ZP3 和人 类的ZP3 氨基酸均是 424 个,氨基酸序列同源性为 67%。虽然编码ZP蛋白的基因在进化 上是保守的,但是在物理化学、免疫化学和功能特性上还存在差异,这主要是转录后的修 [2] 饰作用所致 。 ZP 蛋白具有很强的抗原性,主动免疫动物可诱发产生抗体,其抗体与ZP结合能干扰 卵子和卵泡细胞间信息交流,使卵子失去与同种精子结合的能力,抗ZP抗体在体内还能 [3] 干扰孕卵“脱壳”而妨碍着床 。当抗ZP抗体水平增高时,动物不孕;若抗体 水平下降到 基础状态,动物的生育力也恢复。在ZP免疫避孕的早期研究中,人们用天然ZP蛋白直接 免疫动物观察效果,其中天然猪ZPpZP被广泛用做抗原。有研究用天然pZP对灵长类动 物进行免疫避孕实验,结果表明主动免疫后猴体内产生了高滴度的抗体反应,产生的抗 pZP抗体与猴自身ZP 结合,被免疫猴在一段时间内可以保持不孕。在体外人类精卵结合 [4] 实验中,抗pZP抗体也能抑制人精卵结合 。本研究所用重组人卵透明带蛋白 3 免疫食蟹 猴进行免疫抗生育实验也得到相似结果,体内外实验均证明rhZP3 具有免疫抗生育效能。 [5] Dunbar等 的实验资料表明,针对ZP蛋白的抗体是组织特异性的,不会与其它组织发生交 叉反应,从而降低了用ZP蛋白免疫产生副作用的可能性。有实验表明,用猪ZP免疫兔后 [6] 在兔体内产生的抗体与马和狗的 14 种非卵巢体细胞(如脑、肝等)没有交叉反应 。ZP 蛋白在多种动物中有相似的抗原决定簇,其抗原为交叉抗原,因此用同一种ZP蛋白可以 [7] 免疫不同的哺乳动物,这就为利用异体抗原作为人或动物抗生育疫苗提供了可能性 。但 ZP3 疫苗的开发还受到两方面的困扰,即卵巢的病变以及免疫反应的遗传限制性。在用天 然ZP蛋白直接免疫达到避孕目的的同时,被免疫动物出现了较严重的卵巢炎、卵巢功能 2 突变重组人卵透明带蛋白 3 的生物活性研究 紊乱及原始卵泡衰竭。产生这种副作用的原因可能是当用同源性较大的ZP3 进行免疫时, 在免疫原上存在着一些表位,被抗原提呈细胞提呈后,引起了针对动物体自身的T细胞反 [8] 应而发生了自身免疫性疾病。本研究所潘善培教授等 用猪卵透明带 55kDa 糖蛋白抗原 免疫恒河猴,发现免疫猴的卵泡发育在初级卵泡阶段被阻断,卵泡发育的停止可能是导致 不育的主要原因。他们用胞壁酰胺二肽佐剂免疫恒河猴,证实引起卵巢功能紊乱的不是佐 [9] 剂,而正是ZP3 本身。Sun等 研究表明单独的抗ZP抗体不能引起卵巢自身免疫疾病,它 需要一个针对ZP抗原的T细胞应答。所以将一个去除了T细胞表位而保留B细胞表位的ZP 多肽与异源的T细胞表位相联(后者是为了刺激T细胞应答来帮助B细胞产生抗ZP抗体)可 能可避免自身卵巢免疫疾病的产生。Lou等通过嵌合肽在小鼠中初步解决了困扰ZP3 [10] 避孕疫苗诱发的卵巢病变和遗传限制两个主要问题 。他们通过丙氨酸 5 聚体将小鼠ZP3 335~342 8 肽B细胞抗原决定簇 与牛核糖核酸酶RNase94~104 T cell 抗原决定簇 连接,同时将ZP3 中的Phe 336 残基(曾被确定是ZP3 T 细胞抗原决定簇的关键残基,但 在ZP3 B细胞抗原决定簇中为非关键残基)替换成丙氨酸,用该嵌合肽进行免疫,结果在 所有实验品系的小鼠中都产生了ZP抗体,却没有出现自身免疫性卵巢炎。但这种方法是 否适用于灵长类动物还需进一步研究。此外,由单个ZP3 B细胞抗原决定簇构成的疫苗引 起的抗体是否足以阻止受精也未能确定。由于受精发生在输卵管壶腹部,通过阻断受精产 生抗生育作用的疫苗实际上是不需要作用于卵巢的,所以我们提出了从粘膜免疫入手解决 卵巢功能紊乱问题的设想。如果能够通过粘膜免疫在输卵管粘膜表面诱发足量的抗ZP抗 体,即可阻断受精产生抗生育作用,又可避免产生大量血循环抗体干扰卵巢正常功能。 1.2 mrhZP3在毕赤酵母中的表达 分子生物学技术的发展为外源基因在各种细胞中的表达提供了广阔的前景。长期以 来,人们用大肠杆菌作为宿主表达了多种蛋白。但这一系统表达的蛋白缺少了真核生物的 蛋白翻译后修饰和加工,且多以包涵体形式存在,需要经过复杂的复性才能恢复构象和活 性,作为体内药物应用时,其内毒素的去除也是一个难题。与大肠杆菌表达系统及第一代 酵母表达系统?酿酒酵母相比,甲醇酵母具有不可比拟的优势。作为单细胞真核生物,它 既具备了原核生物生长快速、培养基廉价和实验手段简单可行的特点,又具备典型的真核 生物分子生物学特性:可对表达的蛋白进行加工折叠和翻译后修饰;可高水 平分泌表达外 源蛋白,且由于自身分泌到培养基中蛋白很少,因而纯化方便;外源基因随表达载体一起 整合到了酵母染色体上,随染色体一起复制和遗传,不会发生外源基因的丢失现象;分泌 3暨南大学硕士学位论文 产物无过度糖基化,临床应用较安全。因此巴斯德毕赤酵母表达系统已成为较为成功的外 [11?14] 源蛋白表达系统之一 。本研究所也已用毕赤酵母表达系统先后成功表达了猪卵透明 [15?17] 带蛋白3 α、重组人卵透明带蛋白3和重组人巨细胞病毒嵌合肽 。 大多数应用型巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是通过对野生型石油酵母Y11430 进 [18] 行突变改造而来,目前使用昀广泛的宿主菌株是 Cregg 1985 年建立的GS115。Pichia pastoris 是可利用甲醇为唯一碳源和能源的酵母,在其细胞的过氧化物酶体中含有甲醇代 谢途径所必需的酶,如醇氧化酶alcohol oxidase,AOX、过氧化氢酶、二羟丙酮合成酶 [19] 等 。AOX1 和AOX2 两个基因编码AOX。AOX1 基因严格受甲醇诱导和调控,其编码 产物在氧化过程中起主要作用。AOX2 基因与AOX1 基因序列相似,有92%的同源性, [20] 其编码蛋白有97%的同源性 。根据对甲醇利用的情况,巴斯德毕赤酵母可分为三种表型: + ?甲醇利用正表型Mut ,这种菌株含有AOX1 和AOX2 基因,在含甲醇的培养基内生长 + 正常。GS115 和SMD1168 的表型就是Mut ;?甲醇利用慢表型Muts,如KM71 菌株, 它的AOXl 基因被AOX2 取代,在含甲醇的培养基内生长速度比野生型菌株慢;?甲醇利 ? 用负表型Mut ,该型菌株的AOXl 和AOX2 基因完全缺失,不能利用甲醇。 P. pastoris 没 有稳定的附加体质粒,所以一般用整合型载体作为外源基因的表达载体。P. pastoris 重组 可分两种情况:一种是单交换,即在HIS 或5'AOX的单酶切位点将质粒载体 线性化,通过 + 单交换(插入)整合入染色体,这样由于AOX1基因仍然保留,所得到的转化子表型为Mut , 另一种为双交换(替换),即外源基因通过重组替换了染色体上的AOX1 基因,从而造 成AOX1 的缺失,得到的转化子为Muts。外源基因的拷贝数也是影响 P. pastoris 高效表 达的一个重要因素。一般情况下,整合到酵母染色体上的基因拷贝数越多,蛋白表达量越 [21] 高。在许多实例中,单拷贝整合体表达产量很低 ,多拷贝数整合体却可得到令人满意 的高表达量,如重组鼠表皮生长因子mEGF在 P. pastoris 中的表达量与其含外源基因拷 [22] 贝数成正相关 。多拷贝发生在AOX1或组氨酸基因位点,但同一位点同时插入多个基因 的几率仅占转化体的1%~10%。构建含多拷贝外源基因表达的P. pastoris 菌株的方法有: ? 通过SDS-PAGE、斑点印迹、菌株斑点杂交、不断提高抗生素浓度的方法鉴定转化菌 [22?26] 中仅占百分之几的天然存在的多拷贝菌株 。? 将多拷贝表达盒插入到载体质粒中进 行转化,或者将目的基因的DNA 片段在体外连接成串联体后再转化酵母菌。?多重转化 [27] 筛选法 。 酵母表达基因工程产物存在内部降解问题,Bitter等人用酿酒酵母表达人 α?干扰素, 3 3 3 3 [28] 人 α?干扰素分子量为 20×10 ,但还发现另外有 13.5×10 、 12.5×10 、 11.0×10 的降解片段 。 4 突变重组人卵透明带蛋白 3 的生物活性研究 Gabrielsen等用酿酒酵母表达甲状旁腺激素(84 肽),和未插入外源基因的原始菌株比, 发现除正确条带(1-84)外,由于两个碱性氨基酸(Arg25,Arg26)的右侧断裂,又出现 [29] 了 27-84 肽,以及 1-26 肽两段降解肽段 。而这一酵母表达基因工程产物降解现象发生 的原因就在于酵母细胞膜上有一种蛋白水解酶,该酶专一性水解 α?因子前 体中羧端的肽 键,即连续两个碱性氨基酸LysArg,LysLys,ArgArg,ArgLys。如目的基因中存在相似 位点,也可能被该酶所切割。目前已有一些办法解决这一问题。一是在培养基中添加蛋白 胨或酪蛋白水解物等物质作为蛋白酶的底物;二是改变培养基的pH 值,以降低蛋白酶的 活性;三是使用蛋白酶缺陷株来表达外源蛋白,如SMD1163,SMD1165 和SMD1168 等; 四是通过点突变改变目的基因的碱基,从而改变其编码的氨基酸序列,消除外源蛋白的酶 切位点,使其免受蛋白酶的破坏。 1.3 粘膜免疫 1.3.1 粘膜免疫概述 粘膜免疫系统Mucosal Immune System,MIS是机体整个免疫网络的重要组成部分, 是具有独特结构和功能的独立免疫体系,粘膜表面与外界抗原直接接触,是机体抵抗感染 的第一道防线。 粘膜免疫的概念于本世纪 70 年代提出,其昀大特点之一是免疫途径不同于传统的系 统免疫,它是通过粘膜途径如口服、滴鼻、直肠灌注、阴道灌注等,在病原体 进入机体的 各个粘膜入口处直接切断其传播途径,以便有效地保护机体健康。而且实验证明:通过粘 膜免疫后,粘膜局部的抗体比血清抗体出现得早,效价高,且维持的时间长。研究粘膜免 疫无论在理论上还是在生产实践上,均具有重要的意义。近年来,随着粘膜免疫学研究的 深入,粘膜免疫避孕的研究也引起了学者们的重视。鉴于受精和早期胚胎发育均是在输卵 管粘膜管腔和子宫粘膜管腔中实现的,因此在局部免疫机制、疫苗载体和传递系统的研究 成果基础上,如何研制一些安全有效的引发粘膜免疫反应的避孕疫苗,已引起有识之士的 极大关注。在美国的重组配子避孕疫苗原研究中心center for recombinant gamete contraceptive vaccinogens,其总目标就是研制能在雌性生殖道产生足量高效抗体的避孕疫 [30] 苗,以达到阻碍受精的目的 。与肌肉或皮下注射的传统免疫相比,阴道粘膜接种疫苗 更有可能在生殖系统局部诱导高滴度的分泌抗体,从而产生较好的避孕效果。 5暨南大学硕士学位论文 1.3.2 粘膜免疫的特点 粘膜免疫系统不同于系统免疫系统。首先粘膜免疫系统的组织结构不同于系统免疫系 统,粘膜免疫系统是由集合粘膜相关淋巴组织和弥散粘膜相关淋巴组织组成。集合粘膜相 关淋巴组织集合粘膜相关淋巴组织存在于呼吸道、消化道、泌尿生殖道等粘膜组织中,其 数量和位置存在着种间和个体间的差异。但大部分以结肠和直肠数量昀多,由单个或多个 淋巴滤泡聚集成滤泡结节,如Peyer's patches PP、扁桃体、阑尾及大量外分泌腺构成粘 膜相关淋巴组织mucosal associated lymphoid tissue,MALT,包括肠相关淋巴组织 GALT、支气管相关淋巴组织BALT、生殖道相关淋巴组织GUALT、鼻相关淋巴组织 [31] NALT等,是捕捉抗原和产生免疫效应细胞与免疫记忆细胞的主要场所 。弥散粘膜淋 巴组织分布于整个粘膜组织,包括分散在固有膜、粘膜和腺体间质中的淋巴细胞、浆细胞 以及上皮内淋巴细胞,固有膜内的淋巴细胞主要是B 细胞和T 细胞,其中 40%的淋巴细 [32] 胞产生IgA抗体 。 粘膜免疫系统具有的独特免疫分子和独特细胞群。如sIgA、sIgM 是粘膜表面主要和 特有的抗体,从产生IgA的细胞到分泌的抗体sIgA,sIgM,其数量均超过IgG。淋巴细胞 归巢是指抗原通过粘膜中M 细胞激活固有层中B 淋巴细胞,致敏的IgA B 细胞前体通过 [33] 淋巴或血液再迁移到粘膜组织和腺体,从而产生广泛的局部分泌IgA抗体反应 ,这是由 淋巴细胞表达的粘附分子、趋化因子与粘膜血管内皮表达的组织特异性配体相互作用而启 [34?35] 动的,是粘膜疫苗作用发挥的基础 。另外在粘膜部位的神经细胞与神经介质、内分 泌细胞与激素分子都是机体中数量昀集中的部位,这说明在机体神经、内分泌、免疫调节 网络中粘膜部位具有绝对的重要性,也说明粘膜免疫反应受到严密调控。 总之,粘膜免疫系统不同于以血液为载体的系统免疫,不论是在抑制粘膜表面感染, [36] 或是激发全身免疫反应方面,它都是一种行之有效的免疫途径 。 1.3.3 雌性动物生殖道粘膜免疫系统 口腔、鼻腔、直肠以及生殖道均可作为粘膜免疫的途径。但由于粘膜免疫反应的复杂 性,不同粘膜位点所引发的粘膜免疫机制也有所不同。如经口服或肠腔内途径接种疫苗, 在胃肠粘膜有很强的免疫反应出现而其它部位如上下呼吸道、泌尿生殖道却无明显的免疫 反应,而鼻腔内免疫后除了在上呼吸道有强免疫反应出现,在下呼吸道、胃肠道、泌尿生 6 突变重组人卵透明带蛋白 3 的生物活性研究 殖道也有明显的免疫反应,并且可以显著降低免疫原量。Kozlowski, P A等通过对女性进 行口服、呼吸道、阴道免疫,比较了三种免疫路线所产生的免疫应答,在免疫部位均得到 了较高效价的IgA,如阴道免疫可在阴道分泌物中获得昀高的IgA 和IgG,而在呼吸道粘膜 中则不能产生有效的免疫应答;呼吸道免疫则可在呼吸道分泌物中获得昀高的IgA 和IgG, 而在生殖道中则不能产生有效的免疫应答;三种免疫方式在产生血清中的 IgG和唾液分泌 [37] 物中的IgA方面则有同样的作用 。 与呼吸道和肠道免疫相比,生殖道的局部免疫研究相对较少。雌性动物下生殖道是粘 膜免疫系统的一个重要部分,这里有丰富的树突状细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大 + + [38-39] 细胞、 CD4 T细胞、 CD8 T细胞、细胞毒性T 细胞和分泌IgA的浆细胞等多种免疫细胞 。 总体来说,生殖道分泌物中IgA与IgG的比例均高于血清内的含量,其分泌量随性周期和 [40] 妊娠期的变化而波动 。抗原诱导阴道粘膜免疫反应后,子宫颈过渡区域,子宫颈外部 和阴道上皮中均有IgA的产生,表明生殖道可能也是粘膜免疫的一个有效途径。然而,对 雌性动物生殖道进行免疫还有一定难度:因为抗原提呈细胞的活动常受激素的影响,随发 [41] 情期循环不断变化 ;树突状细胞的数量和上皮细胞对蛋白质渗透性常随发情期变动; [42] 生殖道上皮细胞表达MHC??分子也随生殖周期的各阶段而变化 。但有研究表明在人和 罗猴仅阴道免疫就能有效诱导局部免疫应答的产生,口腔和直肠免疫不能增加阴道内特异 [43] 的IgA水平 ,表明阴道粘膜免疫尽管受性周期影响但仍不失为一种有效的粘膜免疫手 段。 1.4 mrhZP3诱发人精子顶体反应的临床意义 顶体反应是指精子获能之后,在穿透卵细胞的卵丘、放射冠和透明带之前或穿透这些 结构期间,有很短的时间内顶体所发生的一系列变化,从而导致顶体内容物的释放,溶解 [44] 卵细胞周围的放射冠和透明带,继而穿过ZP与卵细胞融合完成受精 。顶体反应是精子 和卵子结合必不可少的条件。哺乳动物物种中,ZP3是介导精子?ZP初级结合和诱发顶体 [45?46] 反应的关键分子,其蛋白成分和糖成份都参加了与顶体反应相关的活动 。 研究发现卵透明带、透明带溶解液或提纯的透明带组分ZP3与获能精子培养, 均可诱 [47?51] 发顶体反应,且ZP诱发顶体反应具有一定的种间交叉性 。采用完整人卵透明带诱发 精子顶体反应,顶体反应发生率平均为45%,而采用可溶性人ZP诱发精子顶体反应率约为 [52?53] 30% 。本研究所用rhZP3成功诱发了人精子顶体反应并对rhZP3浓度与精子的顶体反应 发生率相关性进行了初步研究,为发展检测精子顶体反应的试剂盒积累实验资料。 7暨南大学硕士学位论文 目前精子顶体反应检测技术包括:观测精子顶体的完整性、测定顶体酶活性、精子? 卵透明带结合试验、透明带诱发顶体反应或应用钙离子诱导剂、卵泡液和孕酮试剂诱发精 子顶体反应、精子?卵透明带穿透试验等。用孕酮诱发精子顶体反应时虽然AR百分率很高, 但在进行体外受精实验时,受孕率却并不高,孕酮诱发的AR和IVF受精率在未经筛选病人 [54] 中也没有明显差异 。然而研究发现用卵透明带检测合格的精子进行体外受 精的受孕率 较为理想,ZP诱发精子顶体反应与精子穿卵率、IVF受精率成正相关。常规精液分析正常 [55?56] 的不明原因不育患者,透明带诱发顶体反应率低下 ,该项指标比离子载体A23187、 [57] 孕酮诱发的顶体反应显然更有意义 。但人类卵材料来源极端困难是制约人卵诱发精子 顶体反应研究的一大难题,而用基因工程手段制备重组ZP3就成为解决这一难题的首选方 法,mrhZP3也可望成为检测精子顶体反应,评价精子功能及顶体反应缺陷综合征的临床 诊断的重要检测材料。 1.5 本研究的目的和意义 在先前的研究中,本研究所采用毕赤酵母系统成功表达了 hZP3 第 23 位~第 408 位 氨基酸残基之间的序列,但表达产物出现分子量偏小的杂带,推测为被酵母蛋白酶所切割。 因此采用定点诱变的方法消除了野生型 hZP3 蛋白中部分酵母蛋白酶切位点,该突变重组 蛋白被成功表达并分泌到培养基中。但经过突变,蛋白质的一级结构发生了 变化,是否进 而影响其生物学功能,还需要我们通过实验来判断和证实。在相同发酵及纯化条件下与 rhZP3 比较,突变目的蛋白的表达量是否有所提高,也需要我们进行实验证实。前期在食 蟹猴的实验表明卵透明带蛋白免疫可产生抗体,该抗体可与人卵透明带反应,可阻止人和 小鼠体外精卵结合,但体内抗体滴度不是很高,抗体下降后动物均怀孕。本研究采用注射 免疫和粘膜免疫方法,通过不同的免疫途径,使用 mrhZP3 蛋白免疫小鼠以期得到更好的 避孕效果。本研究的主要内容有三个方面:?对比酵母体系发酵制备的 mrhZP3 与 rhZP3 的表达产量和分子量;?检测 mrhZP3 的生物学活性;?对比粘膜免疫和注射免疫等不同 免疫途径的免疫抗生育效果及对卵巢组织的影响。8 突变重组人卵透明带蛋白 3 的生物活性研究 1.6 本研究的技术路线小规模甲醇诱导 表达 mrhZP3检测表达蛋白,筛选高表达酵母菌株 发酵罐高密度表达 mrhZP3 金属螯合层析纯化 mrhZP3诱导人精子顶体反应 mrhZP3 蛋白免疫雌性小鼠 经 SDS-PAGE 与 rhZP3(粘膜免疫和注射免疫) 的分子量和表达量进行 比较;Western blotting 检测 mrhZP3 抗原活性; ELISA 监测小鼠抗体滴度获得较高抗体滴度后与雄鼠交配,统计、比较受孕率 实验小鼠卵巢切片进行病理 分析,比较不同免疫途径对小鼠卵巢组织的影响9突变重组人卵透明带蛋白 3 的生物活性研究 2 实验材料、试剂与仪器 2.1 实验材料与试剂1. 突变重组人透明带蛋白 3 毕赤酵母菌株为本实验室构建的工程菌 2. 实验动物:昆明系小白鼠,购自广东省实验动物中心 3. 新鲜人精液标本:取自暨南大学医学院第一附属医院门诊病人4. 培养试剂和材料:Yeast extract、Tryptone 购自OXID。YNB购自Sigma。琼脂粉购自 广州化学试剂玻璃仪器厂。Biotin 购自FARCO。葡萄糖注射液购自江苏方强制药厂。 Zeocin购自Invitrogen公司。 5. 蛋白纯化试剂:16×20 XK 层析柱、HiTrap Chelating 5mL 预装柱17-0409-01、 Chelating Sepharose Fast Flow、 Sephadex G25 Fine 购自 Amersham Biosciences 公司。 6. 蛋白电泳试剂:Tris 购自上海化学试剂公司分装厂,丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺 购自 Sigma 公司,SDS 购自 SERVA 公司,过硫酸胺、TEMED购自 Bio-Rad 公司, Protein Maker 购自上海生工生物工程有限公司。 免疫学试剂材料:硝酸纤维素膜购自 公司。 、辣根过氧化物酶标记的 7. Bio-Rad BSA 蛋白购自 公司。二氨基联苯胺 购自 公司。辣根过氧化酶 A Sigma DAB-4HCl Fluka HRP?羊抗鼠 IgG 购自武汉博士德生物技术公司。96 孔聚苯乙烯微孔板为 Greiner 公司产品。 其它:孕酮购自明兴制药厂。考马斯亮蓝 购自 公司。冰冻切片组织包 8. G250 Sigma 埋剂 购自美国 公司。 抗原由本实验室从猪卵巢分离纯化 COMPOUND MILES pZP3 制备。兔抗猪 ZP3 蛋白抗血清由本实验室制备。其余试剂均为国产分析纯和优级纯 试剂。 11暨南大学硕士学位论文 2.2 主要实验仪器 BIOSTAR B2 发酵罐B. Braun 多功能空气冷水机组(QCJ-PB5) 珠海宝特生物技术设备有限公司 液相蛋白纯化系统(AKTA FPLC) Amersham Pharmacia Biotech pH Electrode Mettler 3000Xi型电泳仪Bio-Rad SDS-PAGE设备(含转移设备) Bio-Rad 721分光光度计 上海第三分析仪器厂 微型高速离心机 Eppendorf 3K-30 台式高速冷冻离心机 Sigma 型净化工作台苏州净化设备厂CO 细胞培养箱美国Sheldon公司 2 普通细菌培养箱 Sanyo 超低温冰箱 Sanyo 隔水式电热恒温培养箱(YLA-2000) 湖北省黄石市恒丰医疗器械有限公司 HZQ-F全温振荡培养箱 哈尔滨东联电子技术开发有限公司 DK-8B型电热恒温水槽 上海精宏实验设备有限公司 电热恒温干燥箱 湖北省黄石市医疗器厂 LDZX-40SCI立式自动电热压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂 真空浓缩干燥器Heto QBT 干浴器 Grant TnstrumentsCambridge Ltd 2 普通、解剖显微镜、倒置显微镜Nikon 数码相机 Nikon Elx 800 酶标仪 Bio-Tek CM1900冰冻切片机 Leica 彩色CCD(MicroPublisher 3.3 RTV) 加拿大Qimaging公司 12 突变重组人卵透明带蛋白 3 的生物活性研究 3 实验方法 3.1 酵母工程菌的筛选及目的蛋白的诱导表达参照Invitrogen Pichia Expression,以pH 6.0、1.0%甲醇和连续诱导4天进行表达。 1 将经过多拷贝转化子筛选后保存的酵母菌液划线到YPD 平板上,28~30?培养2~3 天,挑选单克隆。 2 从平板上随机挑取数个阳性单克隆,各自接种到5mL YPD培养液里,28~30?, 220rpm,摇瓶培养过夜; 3 次日取出4mL培养液接种到50mL BMGY培养液里扩大培养,28~30?,220 rpm,摇 瓶培养16~18h;4 第三天,将BMGY培养液于4?, 3500 rpm离心5min。弃上清,细胞重悬于200mL BMMY 培养液中,甲醇终浓度为1.0%,28~30?,220rpm,摇瓶诱导培养;5 连续诱导培养96h,期间每24小时补充一次甲醇(终浓度为1.0%)。诱导培养结束后, 4?,10000rpm离心15min,收获上清,加酶抑制剂后保存于-20?备用;6 SDS-PAGE分析目的蛋白:离心去除细胞后的培养液上清,经葡聚糖G25凝胶层析 柱 脱盐(脱盐原理及方法见附录?),冷冻干燥,通过十二烷(基)硫酸钠-聚丙烯酰 胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析酵母培养上清液中的表达蛋白并初步鉴定目的蛋白的 分子量;7 免疫化学方法鉴定目的蛋白:表达上清液中,除了含有目的蛋白,还有酵母分泌的自 身蛋白,因此在SDS-PAGE电泳凝胶上会出现很多条蛋白带。用免疫印迹(Western blotting)的方法能比较快速且灵敏地鉴别出目的蛋白,方法详见3.6;8 用Quantity One软件分析对比各菌株目的蛋白产量,选择表达量昀高的酵母工程菌。3.2 高密度发酵生产 mrhZP3优化条件下,在2L自控式发酵罐进行高密度发酵生产目的蛋白。1 取20 μL -70?保存的甘油酵母GS115,接种于5mL YPD培养液中,28~30?,220rpm 振荡培养过夜;13暨南大学硕士学位论文 2 次日镜检无污染后,取200 μL过夜培养液接种到100mL BMGY培养液中,28~30?, 220rpm扩大培养16~18h;3 将扩增培养工程菌按10%接种量转入装有1.4L发酵培养基的发酵罐中,600rpm,通气 量1:1v/v,29?培养,用NaOH和HCl调控pH值,使保持在优化pH6.0;4 通过溶氧值(DO)监测菌体的生长情况,控制溶氧在20%~30%之间。溶氧上升则流 加50%的甘油,培养至OD 达到60-70后停加甘油;600 5 让菌体将甘油耗尽,待DO值上升到70-80%,流加100%甲醇诱导目的蛋白的表达,控 制DO值在20%~30%之间,每隔4h取样,检测菌体密度和蛋白表达量6 诱导34h后停加甲醇,待DO值再次开始上升,说明甲醇消耗完全,4?,10000rpm离 心15min,收获上清,加酶抑制剂后保存于-70?备用;3.3 mrhZP3 的分离纯化使用AKTA FPLC系统对表达的重组蛋白进行纯化。根据载体pPICZ αA上带有6×his的 纯化标签,发酵上清经超滤浓缩后,用镍离子螯合的亲和层析柱进行分离纯化,昀后用 咪唑竞争洗脱,收集洗脱峰组分,脱盐后冻干保存。1 解冻-70?保存的发酵上清,4?,10000rpm离心15min,收获上清;2 上清液用10KDa超滤膜超滤浓缩;3 超滤浓缩液调pH7.4,使与上样缓冲液(含0.5mol/L NaCl 的0.02 mol/L PB ,pH7.4) 保持一致。3.3.1 金属螯合层析柱的制备 纯化采用 Chelating Sepharose Fast Flow 填料自行装入 16×20 XK 层析柱。 1 用 0.1mol/L的NiCl 流过螯合柱; 2 2 用去离子水洗至电导为零; 3 用 1mol/L 的 NaCl 洗涤 2 个柱体积以上; 4 用 0.02 mol/L PB+0.5mol/L NaCl 平衡 5 个柱体积。 3.3.2 mrhZP3 纯化的基本过程 1 样品调至所需 pH,高速离心除去杂质后,加至制备好的金属螯合层析柱;14 突变重组人卵透明带蛋白 3 的生物活性研究 2 用 0.02 mol/L PB+0.5mol/L NaCl 洗去未结合蛋白(穿透峰); 3 待基线下降并基本平稳时改用 0.02mol/L PB+0.5mol/L NH Cl,洗去非特异结合杂 4 蛋白; 4 待基线基本回零,改用 0.02mol/LPB+100m mol/L咪唑洗脱,收集洗脱峰组分; 5 待基线基本回零,用水洗下吸附在亲和柱上的色素。 3.3.3 纯化后金属螯合层析柱的再生 1 用 0.05mol/L EDTA 剥下亲和层析柱上结合的金属离子,洗柱 2 个柱体积; 2 用 1mol/L NaCl 洗掉柱上的 EDTA,洗柱 2 个柱体积; 3 去离子水洗柱至电导为零; 4 重复 3.3.1 所述的步骤 1)~4)。 3.3.4 mrhZP3 纯化效果鉴定 分别收集穿透峰和洗脱峰,脱盐冻干后进行 SDS-PAGE 电泳,通过 Quantity One 软件分析电泳结果,以 BSA 作为标准对照物,计算每次发酵表达的目的蛋白产量,并 计算回收率(纯化后目的蛋白量/粗样中目的蛋白量)和蛋白纯度(纯化后目的蛋白含 量/纯化后蛋白总量)。 3.4 mrhZP3纯化条件的优化 3.4.1 不同上样浓度对纯化效果的影响 我们把三份发酵上清进行超滤处理及预脱盐后混匀,分别取 1/3 和 2/3,相当于 1 次发酵产物量和 2 次发酵产物量进行纯化,分别收集穿透峰和洗脱峰脱盐冻干做 SDS -PAGE 分析鉴定。 3.4.2 不同上样 pH 对纯化效果的影响 两份等量等体积的待纯化的目的蛋白样品,分别用pH计、pH试纸调节样品浓缩液、 上样缓冲液(含 0.5mol/L NaCl 的 0.02 mol/L PB ,pH7.4)、0.02mol/L PB+0.5mol/L 15暨南大学硕士学位论文 NH Cl为pH7.4,对两份蛋白样品进行纯化,洗脱峰蛋白脱盐冻干做SDS-PAGE分析鉴 4 定。 3.5 SDS-PAGE SDS-PAGE 方法分析酵母培养上清液中的表达蛋白并初步鉴定目的蛋白的分 子量。 1 预先准备好各种试剂(见附录?); 2 先灌 10%分离胶,待聚合后再加入 3.5%的浓缩胶; 3 凝胶完全聚合后,拔出点样孔梳子,分别在上下槽加入电泳缓冲液; 4 准备样品,将事先冻干的样品适量溶解,取 10 μL 样品与 10 μL 样品溶解液混合后, 加样到凝胶中; 5 加样后进行恒流电泳,20mA/板; 6 电泳完毕,取出凝胶,转入 0.1%考马斯亮蓝染液中染色过夜; 7 次日换上脱色液至蛋白带清晰。 3.6 免疫印迹(Western blotting)鉴定目的蛋白 表达上清液中,除了含有目的蛋白,还有酵母分泌的自身蛋白,因此在 SDS-PAGE 电泳凝胶上会出现很多条蛋白带。用免疫印