重组人促红素注射液（CHO细胞）

重组人促红素注射液（CHO细胞） 重组人促红素注射液(CHO细胞) Chongzu Ren Cuhongsu Zhusheye (CHO Xibao) Injection (CHO Cell) Recombinant Human Erythropoietin 本品系由高效表达人红细胞生成素(简称人促红素)基因的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，经细胞培养、分离和高度纯化后制成。含适宜稳定剂，不含防腐剂和抗生素。 1基本 生产和检定用设施、原料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。 2制造 2.1工程细胞 2.1.1名称及来源 -重组人促红素工程细胞系由带有人促红素基因的重组质粒转染的CHO-dhfr(二氢叶酸还原酶基因缺陷型细胞)细胞系。 2.1.2细胞库建立、传代及保存 由原始细胞库的细胞传代，扩增后冻存于液氮中，作为主细胞库;从主细胞库的细胞传代，扩增后冻存于液氮中，作为工作细胞库。每次传代不超过经批准的代次。细胞系冻存于液氮中，检定合格后方可用于生产。 2.1.3主细胞库及工作细胞库细胞的检定 应符合“生物制品生产用动物细胞基质制备及检定规程”规定。 2.1.3.1外源因子检查 细菌和真菌、支原体、病毒检查均应为阴性。 2.1.3.2细胞鉴别试验 应用同工酶分析、生物化学、免疫学、细胞学和遗传标记物等任一方法进行鉴别，应为典型CHO细胞。 2.1.3.3人促红素表达量 应不低于原始细胞库细胞表达量。 2.1.3.4目的基因核苷酸序列检查(工作种子批可免做) 目的基因核苷酸序列应与批准序列相符。 2.2原液 2.2.1细胞的复苏与扩增 从工作细胞库来源的细胞复苏后，于含灭能小牛血清培养液中进行传代、扩增，供转瓶或细胞培养罐接种用。小牛血清的质量应符合规定(附录?? D)。 2.2.2细胞培养液 生产用细胞培养液应不含牛血清和任何抗生素。 2.2.3细胞培养 细胞培养全过程应严格按照无菌操作。细胞培养时间可根据细胞生长情况而定。 2.2.4分离纯化 收集的培养液按经批准的纯化工艺进行，采用经批准的超滤法或其他适宜方法进行浓缩，多步色谱纯化后制得高纯度的重组人促红素，即为人促红素原液，除菌过滤后保存于适宜温度，并规定其有效期。 2.2.5原液检定 按3.1项进行。 2.3半成品 2.3.1配制与除菌 原液加入适宜稳定剂，并用缓冲液稀释。除菌过滤后即为半成品。 2.3.2半成品检定 按3.2项进行。 2.4成品 2.4.1分批 应符合“生物制品分批规程”规定。 2.4.2分装 应符合“生物制品分装和冻干规程”规定。 2.4.3规格 应为经批准的规格。 2.4.4包装 应符合“生物制品包装规程”规定。 3检定 3.1原液检定 3.1.1蛋白质含量 用4g/L碳酸氢铵溶液 将供试品稀释至0.5-2mg/ml，作为供试品溶液。以4g/L碳酸氢铵溶液作为空白测定供试品溶液在320nm，325nm，330nm，340nm，345nm和350nm的吸光度。用读出的吸光度的对数与其对应波长的对数做直线回归，求得回归方程。照紫外-可见分光光度法(附录II A)，在波长276nm,280nm处，测定供试品溶液最大吸光度A，将A对应波长带入回maxmax归方程求得供试品溶液由于光散射产生的吸光度A。按下式计算，应不低于0.5 mg/ml。 光散射 蛋白质含量(g/100ml)=(A-A)?7.43×供试品稀释倍数 光散射max 3.1.2生物学活性 3.1.2.1体内法 依法测定(附录? B)。 3.1.2.2体外法 按酶联免疫法试剂盒说明测定。 3.1.3体内比活性 5每1mg蛋白质应不低于1.0×10IU。 体外比活性 4每1mg蛋白质应不低于9.0×10IU。 3.1.4纯度 3.1.4.1电泳法 依法测定(附录? C)。用非还原SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，考马斯亮蓝染色，分离胶胶浓度为12.5%，加样量应不低于10μg，经扫描仪扫描，纯度应不低于98.0%。 3.1.4.2高效液相色谱法 依法测定(附录? B)。亲水硅胶体积排阻色谱柱，排阻极限300kD，孔径24nm,粒度10μm，直径7.5mm,长30cm;流动相为3.2mmol/L磷酸氢二钠-1.5mmol/L磷酸二氢钾-400.4mmol/L氯化钠，pH7.3;上样量20,100μg，于波长280nm处检测，以人促红素色谱峰计算理论板数应不低于1500。按面积归一化法计算人促红素纯度，应不低于98.0%。 3.1.5分子量 依法测定(附录? C)。用还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，考马斯亮蓝R250染色，分离胶胶浓度为12.5%，加样量应不低于1μg，分子质量应为36,45kD。 3.1.6紫外光谱扫描 依法测定(附录? A)，用水或生理氯化钠溶液将供试品稀释至0.5-2mg/ml,在光路1cm、波长230nm-360nm下进行扫描，其最大吸收峰279nm?2nm;最小吸收峰250nm?2nm;在320,360nm处无吸收峰。 3.1.7等电聚焦 使用含有pH范围为3至5的两性电解质的聚丙烯酰胺凝胶。取尿素9g、30%丙烯酰胺单体溶液6.0ml、40% pH 3至5的两性电解质溶液1.05ml、40% pH 3至10的两性电解质溶液0.45 ml、水13.5ml，充分混匀后，加入N’N’N’N’-四甲基乙二胺 15μl和10%过硫酸铵溶液0.3ml，脱气后制成凝胶，加供试品溶液20μl(浓度应在每1 ml含0.5 mg以上)，照等电聚焦电泳法进行(附录? D)，同时做对照。电泳图谱应与对照品一致。 3.1.8唾液酸含量 每1mol人促红素应不低于10.0，9.0mol (附录? C)。 3.1.9外源性DNA残留量 每10000IU人促红素应不高于100pg(附录? B)。 3.1.10 CHO细胞蛋白残留量 用双抗体夹心酶联免疫法检测，应不高于0.05%。 3.1.11细菌内毒素检查 每10000IU人促红素应小于2EU(附录 ? E凝胶限量试验)。 3.1.12牛血清白蛋白残留量 用酶联免疫检测，应不高于0.01%。 3.1.13肽图(至少每年测定1次) 供试品经透析、冻干后, 用1%碳酸氢铵溶液溶解并稀释至1.5mg/ml，依法测定(附录? E)，其中加入胰蛋白酶(序列分析纯)，37??0.5?保温6小时，色谱柱为反相C8柱(25cm×4.6mm，粒度5μm，孔径30nm) ，柱温为45??0.5?;流速为0.75ml/分钟;进样量为20μl;按下表进行梯度洗脱(表中A为0.1%三氟乙酸水溶液，B为0.1%三氟乙酸-80%乙腈水溶液)。 编号 时间/分钟 流速/ml A% B% 1 0. 00 0.75 100.0 0.0 2 30.00 0.75 85.0 15.0 3 75.00 0.75 65.0 35.0 4 115.00 0.75 15.0 85.0 5 120.00 0.75 0.0 100.0 6 125.00 0.75 100.0 0.0 7 145.00 0.75 100.0 0.0 肽图应与人促红素对照品一致。 3.1.14 N-末端氨基酸序列(至少每年测定1次) 用氨基酸序列分析仪测定。N-末端序列应为: Ala-Pro-Pro-Arg-Leu-Ile-Cys-Asp-Ser-Arg-Val-Leu-Glu-Arg-Tyr。 3.2半成品检定 3.2.1细菌内毒素检查 依法测定,每1000IU人促红素应小于2EU(附录? E凝胶限量试验)。 3.2.2无菌检查 依法检查(附录? A)，应符合规定。 3.3成品检定 3.3.1鉴别试验 按免疫印迹法(附录? A)或免疫斑点法(附录? B)测定，应为阳性。 3.3.2物理检查 3.3.2.1外观 应为无色澄明液体。 3.3.2.2可见异物 依法检查(附录? B)，应符合规定。 3.3.2.3装量 按附录? A中装量项进行，应不低于标示量。 3.3.3化学检定 3.3.3.1 pH值 依法测定(附录V A)，应符合批准的要求。 3.3.3.2钠离子含量 应不大于190mmol/L(附录? J)。 3.3.3.3枸橼酸离子含量 如制品中加入枸橼酸钠，则枸橼酸离子应不大于25mmol/L(附录? H第二法)。 3.3.3.4蛋白质含量 依法测定(附录? B第二法)，应符合经批准的蛋白质含量范围。 3.3.3.5 渗透压摩尔浓度 依法测定(附录V H)，应符合批准的要求。. 3.3.4生物学活性 3.3.4.1体外法 按酶联免疫法试剂盒说明书测定供试品体外活性(IU/ml)， 根据标示装量计算供试品生物学 活性(IU/瓶)， 应为标示量的80%,120%。 3.3.4.2体内法 按附录? B测定供试品体内活性(IU/ml)，根据标示装量计算供试品生物学活性(IU/瓶)， 应为标示量的80%,140%。 3.3.5无菌检查 依法检查(附录? A)，应符合规定。 3.3.6细菌内毒素检查 每1次人用剂量应小于10EU/ml每1000IU人促红素应小于2EU; 5000IU/支以上规格的人促 红素，每支应小于10EU(附录? E凝胶限量试验)。 3.3.7异常毒性检查 依法检查(附录? F小鼠试验法)，应符合规定。 4保存、运输及有效期 于2,8?避光保存和运输。自生产分装之日起，按批准的有效期执行。 5使用说明 应符合“生物制品包装规程”规定和批准的内容。