[doc] 人红细胞血型糖蛋白：生物化学和抗原性质

[doc] 人红细胞血型糖蛋白：生物化学和抗原性质 人红细胞血型糖蛋白:生物化学和抗原性质 国外医学输血及血液学分册1991年第?卷第4期 [1【]c0nH髓丑日M.crIl1.BtJHacmar~1987.65(d)j475 [1?Lb~mlaR.&JHaematot1986.45Sul48 [】3]AkmalM.nIl1.JCtinInvest1985,76(4)j1695 ? 225? (143RayJM,.Seine1986.1Jj879 [15)Sornch~L,HIl1.BtJEa~rnmoa1987,67I473 人红细胞血型糖蛋白:生物化学和抗原性质 Blanchard,D 人红细胞唾藏酸糖蛋白(SGes),也叫血型糖蛋 白(GPs),可通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝腔 电泳(s噼PAGE)继以过碘酸希夫氏反应染色 (PAS)鉴定.采用Laerrtmli的不连续缓冲系统电泳, PAS染色可检出4种GP:GPA,GPB.GPC和GPD GPs的PAS图谱复杂,因为GPs不能被SDS充分解 离.常以二聚体(AX2,BX2)和异二聚体(A+B)方 式泳动.可用各带洗脱物的再次电泳或双向电泳分 析各募聚物的组成. 血型糖蛋白的免疫化学 血型糖蛋白的纯化 田GPs唾藏酸含量高,用有机溶剂抽提红细胞 膜时.进入水相.用于抽提的有机溶剂有多种,但其 含大部分GPs的水相中,或多或少有杂蛋白. 为了获得不古杂蛋白的GPs,并有好的回收率, 作者采用65X3的酚/盐水抽提.得到含GPs的抽提 液;按FurtIurmyr等的方法凝胶过滤得GPA,混杂有 少量GPA的GPB+GPC组分,再上阳离子高效液 牛目层析(PLPLC)柱,Naa梯度洗脱.GPB被0.25M Naa首先洗脱.GPC在0.35MNaCI被冼脱.纯度在 80~85.可在面活性剂存在下用HPLC柱凝胶 过滤进一步纯化达纯度.该法可以从一单位血 中纯化出足够量的GPB和GPC(分别为14Dnmol和 40nroo1)用于结构分析.因此适用于研究与这些分子 相关的稀有的血型变异型.因为酚/盐水抽提藏中不 古糖基化程度低的GPD,故GPD不能用此法纯化. 可用丁醇抽提和TSKG3000柱凝腔过滤层析获得富 含GPD和GPB的组分.再用制备性SDS-PAGE进 一 步纯化,获得可用于结构分析的GPD. 血型糖蛋白A的生物化学性质 GPA的坫恂GPA是主要的GP,从J单位红 细胞中可得ltamoleGPA纯品.故软早就巳测得其 131个氨基酸残基的完整序列.GPA是一种贯穿细 胞膜的蛋白质,由3部分构成,第一部分为糖基化的 膜外结掏域(1—72位氨基酸残基).第二部分为膜 中部分(73—95位氪基酸残基),第三部分为非糖基 化的胞浆内区段(93一J3J位氨基酸残基).N-末端 的膜外结构域通常连接有一个N-聚糖和J5个O 聚糖.大部分o_聚塘为四聚精,和丝氨酸或苏氨酸 相连,其结构为,唾液酸2—3半乳糖BI-3(唾液酸 葩一6)N-乙酰氨基半乳塘一丝氨酸/苏氨酸.尚有J J5的O-聚糖为三聚糖,其结构为:唾液酸兰!半 RI’ 乳糖N-乙酰氨基半乳糖一丝氨酸/苏氨酸.N1 聚糖连结于天冬酰胺.其结陶为: 唾藏酸旦半乳糖乙酰氨基葡萄锖甘露糖 lal,6 甘露糖N乙酰氨基葡萄糖卫N乙酰氨基葡萄糖 唾液酸!堡半乳塘乙酰氟基葡萄锖旦甘天酰胺 GPA的N末端结构域含肯胰蛋白酶和木瓜蛋 白酶的作用位点,但用靡蛋白酶作用完整细胞.GPA 只部分破水解.与GPD相比,GPh的C末端与膜骨 架结台较弱. GPA的抗原性质GPA载有M和N血型抗 原.M.N抗原的结构差异在于GPAN未端的塘基 化五肽.因为大多数抗一M和抗一N抗体与抗原的结 台需唾液酸,推测M和N抗原有不同的唾液酰化 O一聚糖,M和N基因编码唾液酰转移酶.但某些抗 M和抗一N抗体与抗原的结合不需唾液酸.进而,M 和N抗原之间的差异被明确归国于J和5位氮基 酸的多态胜(M:丝氪酸/甘氨酸{N:亮氨酸/各氮 酸). 某些稀有个体表现为EI】(a一)表型,缺步GPA{ 可以产生与直接针对GPA的抗-M和抗一N抗体不 同的抗体(抗一En’).其抗原结构按其对蛋白水懈的 易感性分类:En’髑,En’Fs分别被胰蛋白酶无花果 蛋白酶水解.而En’FR抵抗无花果酶的水解.免疫 ?226? 化学研究表明,抗Et1侣结合于GPA的30,40位 氨基酸残基,而抗EnFS与GPA的46,56位氰基 陵残基反应.值得注意的是抗En’TS和抗Et1.FS被 溶剂抽提的GPs抑制+而抗En~FR不被抑制 另外一种抗一w抗体由Wr’Wr-基因型十体产 生.w抗原报可能相当于GPA中En’FR抗原决定 簇的结构,但从Wr(a—b+)红细胞分离的GPA的 氨基酸序刊未能拽出差异,故其抗原决定簇的确切 结掏尚未确定. 血型糖蛋白B的生轴化学性质 GPB的结构由于纯化困难,首先测定了从 GPs混合物中纯化的GPBN一端胰蛋白酶水解肽段 (1,35位氨基酸残基)的序列.已观察到29位氨基 酸的多态性+它决定了分子表现为s(甲硫氨酸)或 S(苏氨酸)血型特异性.分别从S和s型红细胞中 .分离纯化出GPB.测定其膜内结掏的氨基酸序列 (36,71位氰基酸残基序列)+发现无多态性.从 K562细胞获得eDNA克隆的核苷酸序列推测出 GPB的完整氨基酸序列t分子含72十氨基酸残基, 萁中,半胱氨酸和苏氨酸与以前由氨基酸序列分 析测得的结果(丝氨酸,丝氨酸)不一致.丙氨酸 前未能测定.GPB与GPA有根好的同源性.从遗 传学的观点+可以认为GPB基因是GPA基因经复 制和点突变后的产物.和GPA相反.完整细胞上的 GPB对姨蛋白酶处理有相当抵抗性+但它被糜蛋白 酶术解,该性质被用于分析这些分子的抗原决定簇. GPB(40,66位氨基酸残基)的疏水结掏域比GPA 和GPC的长.但其胞浆内部分根短,不能与膜骨架 怍用.因GPB缺乏28位的丝氨酸和苏氨酸残基.且 其序列不能满足有如天冬酰胺N-糖墓化的需求. GPB平均有11十O一聚糖.主要是含2十唾液酸的 叫聚糖,位于N端的胰蛋白酶水解肽段. GPB的抗原性质GPBN端与GPA一致,有 一 抵抗胰蛋白酶水解的血型N抗原决定族.其29 位氨基酸残基的多态性决定S和s的特异性(甲硫 氨酸,sj苏氨酸,s)I苏氨酸”,组氨酸”和精氪酸’ 位于多克隆识别的S和s抗原决定簇中. 另外.由和人多克隆抗体的反应性推测GPB可 隧含有u抗原(u,和).近来积累的证据表明, 它位于GPB中靠近s吕抗原的C端.u和抗原 可能分别位于GPB糖基化N端的29,40位氨基 陵残基间.u抗原位置暗示它也与GPA的同源部 分结合.但抗u抗体优先与GPB反应.虽后.应注 意’N’,U,U和U抗原在S和s细胞中的表达是 不同的,S表型细胞的GPB量比s细胞GPB量高 1.5倍.有证据表明,Rhnu1]红细胞GPB严重减少, 国外医学输血丑血学分册1991年第l{卷第4期 提示GPB和Rh蛋白问有相互作用,它们可睡:在红 细胞膜上形成一十复合物. 血型?蛋白C和D的生轴化学性质 现已从GPC基因的eDNA序列推导出GPC的 完整结构.它含有128十氨基酸残基}GPC的氨基 酸序列与GPA和GPIB的氨基畦序列无明显同源 性.GPC基因位于2号染色体.而GPA和GPB基因 位于4号染色体.GPD只占GPs总量的1+因此 它的完整氨基酸序列不能用常规方法获得.然而.从 Gctbich阴性红细胞的分析.提示GPc和GPD之间 有结掏同源性.结合GPC和GPD都含有Gc3抗 原决定簇的事实,提示它们从t3抗原决定簇到 分子末端的序列是相同的.但两者有区别+因为 GPD分子(24kd)短于G(321u1),而且GPD古有 ;2抗原决定簇.GPc却不含.为解释两者结掏上 的同源性和Gerbich阴性样品的eDNA分析结果. 有人推掼fGPD是GPC的节略翻译产物,它们由同 一 十基因编码,通过RNA的剪接或不同的翻译 加工产生了两种分子.作者认为,GPD的氯基酸序 列是从GPC序列的22位甲硫氨酸(或23位丙氨 酸)开始的.因为GPC的rnRNA拥有1十允许从 22位蛋氨酸开始翻译的起始密码子. GPC和GPD的抗原性质人抗一t3抗体与 GPC和GPD都结合,而抗一Get2抗体仅与GPD结 合j推测t2抗原决定簇位于GPD的N末端.已 制得几种直接针对GPC的N端部分而不与GPD 反应的单克隆抗体,可用于区别Leach红细胞Get- bieh型中的Gej一2—3红细胞.至今尚无针对GPD 的特异性单克隆抗体.而鬼多克隆抗体与GPC和 GPD均反应. 变异红细胞血型锖蛋白的免疫化学特性 变异红细胞因缺少或有异常的GPs而不表达 上述某些共同抗原(M.N,Er】.S,S,U和Gerbich抗 原).有这类红细胞的十体可产生直接针对他们所缺 少的抗原的抗体.另外一种情况,变异红细胞表达位 于异常或新GPs上的新抗原.各种变异可分类如 下:(1)缺乏GPs的变异红细胞:En(a一).S一U-.M 和Leach虹细胞.分别缺乏GPA,或GPB,或GPA 和GPB,或GPC和GPD?(2)有异常GP的变异红 细胞:,Mr,Mi1.MiI,Mj?和??,都有异常的 GPAjHcnshaw,MiI,Mi?.Mi?都有改变的GPBj 而w曲b和Gctbich阴性细胞(除Leach型外),则有 变异的GPC;(3)拥有一种由GPA和GPB的氮基酸 序列组成的象台GP(A-B和B.A杂台)的变异红细 胞.这些不常见GPs除有异常氨基酸序列外,某些 垦医学输血厦血液学分册1991年第l卷第4期 GPs也可有改变的寡聚塘链.异常糖基化的糖蛋白 与遗传性的(Cad.TmtCantMD或获得性的(T和 Tn)抗原有关. 缺乏血型?置白的童异虹细囊 En(a-)有两类t芬兰型和英国型.英国型红细胞 有杂台GP,芬兰型缺乏GPA.取自三十芬兰型En a一)家系十体的En(a一)红细胞不表达M.N和En? 抗原.SDS-PAGE表明缺乏GPA.同时有第3带的 高糖基化.使用针对GPAN靖或c端的多克隆抗 体也证明其完全缺乏GPA.最近,cDNA分折显示其 GPA基因完全缺失.更证明了逸一论点. 黑人中.约J十体的虹细胞不表达S和?抗 原t并且常无U抗原.而某些譬.-虹l田胞t抗一U徽 弱凝集.最近t一十自人家宣被鉴定为S-s-U表型, 电诛分析表明缺乏0PB,但有一薪成分,以表示, 迁移串比GPB快.韧步确定它为改变的GPB.其N 端不表达’N’tS或0抗原或Nv$受体.eDNA分忻 挺示t这种S一骞_u十体的GPB缺乏,是GPB基周缺 失的结果. M纯合子红细胞缺乏M.N.SU和En’抗原 是GPA和GPB都乏的结果. 不表达G~blch抗原(0.I2和0.?3)的Leach 红细胞,同时缺乏GPC和GPD.Leach红l田胞在形 态上也区别于其它Gerbich变异l田臆,因为它们呈椭 圊形.GPC和GPD的生物学重要性是它们和膜骨 架的相互作用tGPA和GPB的作用尚未确定. N蚺5肚内改变的异常血型糖蛋白 用不与M或N细胞凝集的特异性抗体确认的 抗原.经SDS-PAGE分析,发班其位于GPA的N 端部分.从M-红细胞纯化GPA其N端与血型N- 特异性GPA相似,但4位天冬酰胺被苏氨酸取代, 它使2t3,4位氟基酸残基不能糖基化. 与此相反,M抗原不被特异性抗体识别.M红 细胞有M和N细胞两者的特异性,即它们被大多 数抗一M和某些抗一N凝集.M特异性GPA有一十 介于GPA和GPAs之间的中问序列.其J位与5 位分别是丝氨酸和答氨酸.这种杂合序列提示,Mc 体现了血型M和N特异性GPs之间的进化联系. Henshaw(Fie)抗原位于GPB的N末端,它和 GPB的氮基酸序列有3个位置上的不同,其1.4和 5位上的氨基酸分别是亮氨酸.苏氨酸和各氨酸.M 抗原也位于GPB的N末端t但其异常的GPBN末 端8肽的氨基酸序列尚未确定. 中间氨基酸序列改变的异常血型?蛋白 J个氪基酸变换所致的异常GPs乩I和Mi I红细胞属于M]lt~~berser系统,因为它们都与抗一 ?227? MP血清反应,但分别携有Verweyst(Vw)和 Hutchins~~(Hut)抗原.这类红细胞有异常GPA.Mi I一和MiI一特异性GPA的氨基酸序列分别在28位 由蛋氨酸和赣氨酸取代了苏氨酸,使天冬酰胺不 能糖基化t日其不具有N.塘基化所要求的天冬酰胺 一 某氨基酸一苏氨酸/丝氨酸序列.Weab(wb)红细胞 的GPC推测有类似改变. Miltenberser系统共有8类.其中vl和?类由 Aaek,Raddon和Lane抗体鉴定.血清学资料表明, 来自Mi?和MiVll杂台子的红细胞与抗一En*FS仅有 弱凝集,提示其有改变的GPA.氨其酸序列分析表 明,Mi?和MiVll特异性GPA中精氨酸”或精氨酸 和酷氨酸”分别被具有羟基的氨基酸所取代.Mi? 和MWII特异性GPA中的苏氨酸均糖基化.可能参 与Anek反应性. MiI?Mi1V和Mi?红细胞中异常GPB的鉴定 Miltenberger系统中I?和?类红细胞都有携带 M和Mur抗原的特性t可由Hfl和Anek抗原识 别.生化研究表明,这些细胞均携有异常GPB.其含 量较正常者高.但尚不了解其结构.为阐明MiVl和 Mi?中位于GPA的Mi,Anek和Raddon抗娠的表 达,推捏IMiI,Mi?和Mi?红细胞的变异GPB含 有部分GPA的氨基酸序列. Gerbich一胡性红细胞的异常GPC的鉴定G} 阴性Leach型红细胞完全缺乏GPC和GPD,细胞呈 椭圊形;另外一些Ge-阴性的细胞,虽然也歃乏携有 Ge抗娠的GPC和GPD.但不是椭圆形.Ge一阴性红 细胞可分为两类l(Ge{一2,一3.Gerbich型和Gel一2. 3,Y世型),由它们是否表达Gea抗原决定簇而 定.但它们都携有不寻常的GP,这些新GPs电泳位 于GPC和GPD之问,因为它们都有Ge相关的鼠单 克隆抗体和Le惦culinari~凝集索的受体.表明它们 至步古有GPCN端的8个氨基酸残基.C-e{一2+a 红细胞的新GP古有位于GPC的40~50位氨基酸 残基间的Ge3抗原决定簇,针对GPC和GPD胞 浆内部分(和/或膜内部分)的兔多克隆抗体也与这 些新GPs结合.这些结果捱示.造些新GPs可能是 含有GPC的N端结构域和GPD的C端部分的杂 盒分子.可是.cDNA分析表明,GPC和GPD是由同 J个基因编码的t而新的GPs则是由缺乏的3Kb的 变异基因编码的.最近.从相应的cDNA序列推溟f出 了Ge一2?一3红细胞的新GP的氨基酸序列.它相 应于GPC的卜35和64,l28位氨基酸残基,缺乏 GPC的36,63位氨基酸残基.而后者古有胰蛋白 酶术解位点(精氨酸”)和Ge3抗原决定簇,与Ge t…23GP的免疫化学性质有关.从GPC的eDNA ?228? 分析也获得了Ge:一2,3红细胞GP的结构这种 GP缺乏GPc的j6,35位氪基酸残基,可是它含有 胰蛋白酶水解位点和Ge:3抗原决定簇.Ge一阴性 细胞中的这两种GPa都有与膜骨架相结合的GPC C末端.它们起着与GPC和GPD相同的红细胞识 别和预防成为椭圆彤细胞的作用. GPA和GPB基因交换产生的杂合GP GPA和GPB的氪基酸序列大部分相同,其相 应基因毗邻于4号染色体,有同源核苷酸顺序染 色休组合错误和GPA与GPB基因间不相等的交换 产生的杂交基因,指导由GPAN端和GPBC端组 成的新GPs的合成(A—B杂交),或相反,组成B_A 杂交的新GPs 英国型En(a一)红细胞携有GPA和GPB基因 错混组合产生的(A—B)杂交产物.此种红细胞GPA 和GPB都缺乏,但有一种抵抗胰蛋白酶水解和具胄 M一特异性的分子,此种GP电泳处于GPB位置.(A— B)…杂文分子的结构应该含有GPA1,5位氪基 酸残基,故有血型M活性.晟近,eDNA分析确定, 这种异常GP相当于由血型MGPA的N端部分与 GPB的C端部分构成的杂文分子. Miv红细胞缺乏GPA和GPB,但有一个与其自 身相联系的33kd的新成分,被鉴定为(A-B)杂台分 子它具有GPA的特性,在完整的细胞上对胰蛋白 酶处理敏感,而且还携有GPB苏氪酸决定的s抗 原最近在cDNA水平上的研究明确了这种GP分 子是由GPA的1,58位氪基酸残基和GPB的27 , 72位氨基酸残基组成的. JR.红细胞经鉴定也有类似但相异的杂合 GP,该杂合分子携有M,En_FS,En’TS和S抗原决定 簇,但无Hil和s抗原决定簇,其结构相似于MjV的 杂合分子 抗一Lepore型杂合GPs与st0n嚣()或Dantu 抗原相关.这种(B-A)杂交的分子,电泳位置位于 GPB和GPC之间,表达N血型.无S或s抗原,在 完整细胞中,抵抗蛋白酵水解.P]红细胞的s1伽龆 活性分子由GPB的1,26或28垃氪基酸残基和 GPA的59或6l,j31位氪基酸残基纽成. Dantu一活性分子(N.E型)的全部氮基酸序列也 己确定.(B-A)杂合分子含99十氮基酸残基,相 当于GPB的1,39位和GPA的72,131位氨基酸 残基.因此.Dantu一活性分子可鉴定为一种(B-A)杂 合分子,因为GPB的25,39位氪基酸序列在GPA 中不存在. 异常糖基化的糖蛋白 国外医学输血丑血液学分册1991年第l{卷第dl明 GPA和GPC携有o_和N一聚糖,而GPB和 GPD仅有糖苷连接的多聚糖.某些变异红细胞有 不寻常的聚糖聚糖的生物合成首先是N一乙 酰氪基半乳糖连接于多肚链中丝氪酸或苏氨醋残 基,产生T兀结构.有此种抗原结构的红细胞可产生 多凝集反应并和SalviaseIare~凝集索有强凝集.值 得注意的是,在血小板和粒细胞上也发或有抗 原.在上述乙酰氪基半乳糖的3位上延摇I十半 乳糖残基,即形成T结构正常情况下,在半乳糖3 位上和N一己酰氨基半乳糖6位上再各延接1个唾 液酸,就形成了l十四聚糖,这是正常GPs所携带 的主要o_聚糖. 有T结构的红细胞具有强的多凝集性,T结构 (13aomsonFriedenreich抗原)的暴露是细苗感患者 血清中发现有唾液酸酶存在的结果. 在上述正常GPs所携带的四聚糖的倒数第2 位半乳糖的4位上若再连接1个N一乙酰氮基乳 糖,就形成了一种新的五聚糖结构,它是Cad细胞 的主要抗原成分Cad细胞还携有另一种次要成分, 它是一种异常的四聚糖.其结构为: N己酰氪基半乳糖 I叭.4 半乳糖一己酰氪基半乳糖一丝氨酸腑;氡酸 I啦t3 唾液醒 这种异常的四聚塘还表现血型sd.活性.但在 sd(a+)红细胞上不良查出足够量的这种四聚糖. Sd决定族被暂时定为一种糖基化的神经节苷脂.其 寡聚糖部分和Cad活性五聚糖有同源眭. 在Tin,M1和Can红细胞上,发理有其它一些 稀有寡聚糖.这些O一聚糖的结构为: N一己酰氟基葡萄糖 }Bj.6 半乳精N一乙酰氨基半乳糖一丝氨酸/苏氟醴 I,3 唾液酸 或 半乳糖N.乙酰氨基葡萄糖 Ia2.6 半乳糖N一乙酰氨基半乳糖一丝氨酿/苏氨醴 I. 唾液酸 在血小板GPIO和激活的T淋巴细胞上发现有 相似或相同的结构. [TransfMe0RewI990,4(3):170.(英文) 静聪节王憬惺校]