简单快速的多糖植物双生病毒核酸提取方法

简单快速的多糖植物双生病毒核酸提取方法 第卷 第 期 年 月 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . .......... . . . . . . . ? ? 一 / . .. 简单快速的多糖植物双生病毒核酸提取方法 郭灵芳 ,张长青 ,鲁红学 ,孙正祥 ,章松柏 ,张友军 ,吴祖建。.长江大学工程技术学院,湖北 荆州 ; .长江大学农学院,湖北荆州 ; .福建农林大学植物病毒研究所,福建 福州 ; .中国农业科学院 蔬菜花卉研究所,北京 摘 要:以朱槿曲叶病毒病株为材料,结合总 提取的 法和质粒提取的离心柱方法,发展一种简 单快速的多糖植物双生病毒基因组核酸的提取方法,用聚合酶链式反应 和实时定量予以验证。【薹 结果显示:与目前的 种常用方法相比,改进的方法在灵敏度、时间、价格和产率上都具有一定的优势,更适合 实 于双生病毒基因组核酸的提取和检测应用。 验 关键词:双生病毒; 法;离心柱法;实时定量 中图分类号: . 文献标志码: 文章编号: ?? ?技 术山 与 ? 管?理 ,, , 。,, ,。. & ,, , ; .,, , ; . ,,, ; . , , , : ? , . ? , ., ,. : ;; ;组分结构,大小为 . ~ . , 通常由昆虫介体以持久 双生病毒 性方式传播,大多侵染寄主植物的韧皮部组织。 。双 双生病毒 是植物病毒中唯一的一类 生病毒一般发生在热带、亚热带地区,温带地区也偶有 具有孪生颗粒形态的单链环状病毒,病毒粒子的 发生。 世纪 年代后该病毒在世界范围内大面积爆 大小约为 ,无包膜,基因组为单组分或双 发,并在多种重要作物上引起严重危害,其中番茄、木 薯、棉花和烟草是遭受双生病毒危害最严重的作物,给 收藕日期: ? ? 修改日期: ? ? 种植者造成巨大经济损失 。 世纪 年代以前,双 基金项目:长江大学工程技术学院教研项目 ;农业部农业公 益性行业专项 生病毒引起的病害在我国发生范围小、危害不大。但 作者简介:郭灵芳 一 ,女,湖北黄梅,硕士,讲师,研究方向为应用 年代以后,广西、云南等地相继发现烟草、番茄、南瓜和 化学 番木瓜等作物遭受双生病毒危害,并且发生范围逐年扩 :.大,危害程度日益加深,如:广西的番木瓜和番茄发病普 通信作者:章松柏 一 ,男,湖北黄梅,讲师,研究方向为植物病毒 遍,发病严重地区病株率高达 ~; 年 的监测和分子病毒学. ?: .上海和浙江先后发现双生病毒危害番茄后,该病害在华郭灵芳,等:简单快速的多糖植物双生病毒核酸提取方法 东地区迅速蔓延开来,造成严重危害 。 植物总提取试剂盒 ? 北京天根生化科 随着双生病毒危害的加重,快速检测和鉴定病原十 技有限公司 ,具体操作见说明,朱槿叶片取 .分必要。目前应用于双生病毒的检测手段主要有血清 健株叶片 份、病株叶片 份,即 次重复 ,最后用 学方法、核酸杂交、聚合酶链式反应 、 溶液溶解,一 ?贮存备用。等方法。尽管已经得到了一些双生 . 改进后的植物总提取方法 病毒的多克隆抗体或单克隆抗体,但由于双生病毒血清 取约 . 朱槿叶片 病株叶片 份即 次重 关系有远有近,限制了血清学方法的应用】 。核酸杂 复 ,在液氮中研磨成粉末,加入 、 ?预热的 交、、 种方法都基于双生病毒基因组核酸的 × 提取缓冲液,温和混匀; ?保温 , 方法,比较特异和灵敏,广泛应用于双生病毒的检测和 期间不时摇动,使其充分混匀;用等体积的 : 氯 鉴定。双生病毒基因组核酸的提取质量对检测结果影 仿/异戊醇抽提匀浆液,颠倒使充分混合,于室温 响很大,特别是从富含多糖、多酚、单宁、色素及其他次 / 离心,回收水 上 相;加入 . 倍 生代谢物质的植物中提取的双生病毒基因组核酸。从 体积的 溶液 ~/ 盐酸胍, . / 这些植物中分离出的由于多酚被氧化成棕褐色, , 一 . ~ . ,混匀;将混 匀后的溶液加入离 多糖、单宁等物质与会结合成黏稠的胶状物,获得 心柱质粒小提试剂盒 ,北京天根生化科技有限 的常出现产量低、质量差、易降解等问,影响 公司 中,后面步骤参照质粒小提试剂盒说明书;最后 质量和纯度,不能被限 制性内切酶酶切,严重的甚 用 溶液溶解,一 ?贮存备用。 至不能作为进行扩增?】 。此外,双生病毒 . 检测和灵敏性分析 基因组是单链环状的,在大小和性质上都与寄主 以上述 种方法提取的植物总为模板,进 基因组不同,完全用植物基因组的提取方 行检测,引物引用谢艳等根据双生病毒共同区及 法提取双生病毒基因组,可能会对其产率有一定的影 外壳蛋白基因保守序列的简并引物 和 ,扩 响。基于此,在传统双生病毒基因核酸提取方法的基础 增片段大小为 。 上,结合总提取的 法和质粒提取的离心柱 检测:反应体系按照 的方法,探 索一种简单快速的多糖多酚植物双生病毒基因 酶使用说明进行,反应程序为: ?变性 , 个 组核酸的提取方法。 循环的扩增 ?, ?, ? ,最 材料与方法 后 ?延伸 , ?保存。 灵敏性分析:取 . 节中获取的 ,进行 . 材料 、 、、 、 倍稀释,然后按上述的 植物样品:朱槿曲叶病病株和朱槿健株,病株和健 程序进行实验,以检测改进后的植物总提取方 株叶片采集于福建省福州市郊区,经过鉴定 病毒为 法的灵敏性。产物经 琼脂糖凝胶电泳, 染色后后保存于一 ?超低凝胶成 像系统观察记录。 温冰箱中备用。 . 反应 .法提取植物的总 根据实验室已测定的木尔坦棉花曲叶病毒? 取约 . 朱槿叶片 病株叶片 份,即 次重 组分设计荧光定量引物,筛选得到扩增效率高、反 复 ,在液氮中研磨成粉末,加入 、 ?预热的 应特异 性 强 的一对 引 物 / , ? × 提取缓冲液,温和混匀; ?保温~ 一 和~,期间不时摇动,使其充分混匀;用等体积的 : 一 ,扩增片段大小为 氯仿/异戊醇抽提匀浆液,颠倒使充分混合,于室温下。上述 种方法提取的各取 ,稀释/ 离心,回收水上 相;用等体积的 倍后使用。根据 氯仿/异戊醇抽提,颠倒混匀,离心,回收上层水相;取 : 试剂盒操作说明配制反应液。用离心 上清,加人等体积的异丙醇,混匀,~ ?放置 机快速离心含有反应液的反应管后,放人后 / 离心 以沉淀;弃掉上清,中,然后运行程序,采用两步 加入适量的 乙醇清洗、沉淀一次,随后法进行 反应。反应条件如下:预变 / 离心 ;弃掉上清液,干燥后加入 肚 的 性, ?, ?, ?, 个循环。为了溶液以溶解,一 ?贮存备用。 建立产物的熔解曲线,扩增反应结束后继续从 . 离心柱法提取植物的总 ?缓慢加热到 ? 每 升高 . ? 。 选用特别适用于多酚、多糖含量高的植物组织的