氯化钠密度梯度离心法制备用于显微注射的外源DNA片段_cropped

氯化钠密度梯度离心法制备用于显微注射的外源DNA片段_cropped ( ) () 遗 传 H ER ED I TA S Beiji n g25 5:587,590 ,2003 技术与 氯化钠密度梯度离心法制备用于 显微注射的外源 D NA 片段 刘立仁 ,赵华路 ,张俊武 ( )中国医学科学院基础医学研究所 中国协和医科大学基础医学院 医学分子生物学国家重点实验室 ,北京 100005 摘 要 :DNA 显微注射是生产转基因动物最可靠和最常使用的一种方法 ,外源 DNA 的纯度对显微注射的成功起 着至关重要的作用 。本文介绍用氯化钠密度梯度离心的方法制备用于显微注射的外源 DNA 片段 。与传统的琼脂 糖凝胶回收的方法相比较 ,用此方法制备的外源 DNA 片段对小鼠受精卵进行显微注射后 ,受卵体母鼠的胚胎存活 率 ,以及子代小鼠的外源基因整合率均有明显的提高 。这一方法可为进一步提高转基因动物的成功率 ,提供方法 学上的参考 。 关键词 :显微注射 ; 氯化钠密度梯度离心 ; 胚胎存活率 ; 外源基因整合率 () 文章编号 :0253 - 9772 200305 - 0587 - 04 中图分类号 :Q781 文献标识码 :A Sodium Chloride Step Gra dients Centrif uge to Fractionate Foreign D NA Fragment f or Microinjection L IU Li2Ren , ZHAO Hua2L u , ZHAN G J un2Wu ( )N ational laboratory of Medical Molecular Biology , I nstit ute of B asic Medical Science , CA MS &PU M C , Beiji ng 100005 , Chi na Abstract :DNA microinjectio n is t he most pop ular and reliable met hod of p roducing t ransgenic animals. The p urit y of for2 eign DNA plays an important role for t he success of microinjectio n. In t his st udy ,we int roduced t he use of sodium chloride step gradient s in f ractio nating foreign DNA f ragment for microinjectio n. The data demo nst rated t hat ,co mpared wit h t he co nventio nal agarose gel ext ractio n met hod , NaCl p urificatio n scheme of toreign DNA could imp rove t he t reated embryo survival and foreign DNA intergratio n rate mar kedly. Key words :microinjection ; sodium chloride step gradient s cent rif uge ; embryo survival ; foreign DNA intergration rate 1980 年 , Go rdo n 等 人 首 先 报 道 用 显 微 注 射,德国人 Ber m 对此期间几十个实验室进行的转期 1 DNA 的方法获得了转基因小鼠。在此后的一年 基因动物实验作了全面统计 ,但是结果并不令人十 时间内 ,先后又有 5 个实验室陆续发了通过向原 分满意 ,出生幼仔数还不到注射卵数的 10 % , 外源 核期的小鼠胚胎显微注射 DNA ,获得转基因小鼠的 基因整合率也只有出生幼仔的 10 %左右 ,也就是说2 所获得的转基因动物的数量还不到注射卵的 1 % 。报告。从此 , 向受 精 卵 直 接 注 射 纯 化 的 DNA 片 段作为生产转基因动物的主要方式被确立下来 ,并所以 ,如何提高转基因动物的成功率 ,长期以来一直 且至今仍是一种最可靠和最常使用的方法 。但是 是人们不断探索的一个课 。 显微注射的成功率, 受多种因素的影响 ,这些因 多年来 人 们 一 直 被 显 微 注 射 法 的 低 效 率 所 困 扰 。 1985 年至 1992 年是全世界生产转基因动物的高峰素包括 :外源 DNA 的纯 度 、受 精 卵 的 体 外 耐 受 性 、 收稿日期 :2003 - 02 - 14 ;修回日期 :2003 - 05 - 22 ( ) 基金项目 :国家自然基金 39893320资助 ( ) 作者简介 :刘立仁 1970 - ,男 ,博士研究生 ,分子生物学专业 ( ) 通讯作者 :张俊武 1946 - ,男 ,博士生导师 ,专业方向 :分子生物学 。Tel :010 - 65296423 , E2mail :junwu- zhang @hot mail . co m () 细胞核内显微注射的时相 、显微注射操作的熟练程min ,离心 16 h Beckman SW40 Ti rotor。离心完毕 3 度 ,以及 受 卵 体 母 鼠 的 假 孕 状 态 等 等。其 中 , 外 后 ,用 18 号注射针头刺穿离心管底部 ,收集离心液 , μ) ( 源 DNA 的纯度对显微注射的成功起着至关重要的 每管收集 400L 大 约 7 滴。然 后 , 从 每 管 中 各 取 μ作用 。为了提高外源 DNA 的 纯 度 , 人 们 尝 试 过 各 10L ,用 ddHO 稀释一倍后与适量电泳加样缓冲液 2 种各样的方法 ,比如酚2氯仿抽提 、透析 、氯化铯密度 混匀 ,上样 。开始电泳前 ,先将样品静臵 15 min ,以利 4 梯度离 心 、蔗 糖 密 度 梯 度 离 心 等 等。近 年 来 , 随 于 NaCl 的扩散 。开始电泳后 ,待样品已进入凝胶 ,再 着琼脂糖凝胶回收技术的不断改进 ,各个实验室普 次关闭电源静臵 1 h ,让 NaCl 进一步充分扩散后再继 遍采用琼脂糖凝胶回收法作为制备显微注射用外源 续进行电泳 。电泳结束后 ,在紫外灯下观察凝胶 ,确 () DNA 的主要方法 。目前 ,最为常用的琼脂糖凝胶回定目的 DNA 所在管 共 5 管,然后将浓度较高并且 收试剂盒是 Qiagen 公 司 生 产 的 Q IAquick Gel Ex2无载体序列混杂的两管样品合并 。脱盐前 ,先用 5mL (t ractio n 试剂盒 。该方法先将外源 DNA 用琼脂糖凝 显微注射缓冲液 10 mmol/ L Tris ,p H 7. 4 ;0. 1 mmol/ ) ( ) 胶电泳分离 ,再切下包含目的 DNA 的条带 ,用琼脂 L ED TA 平衡脱盐柱 NAP210 , Pharmacia,共 3 次 。 糖凝胶回收试剂盒回收 ,然后用酚2氯仿抽提 ,最后然后加入收集到的样品 ,自然排空 ,如样品不到 1mL , 再用乙醇沉淀目的 DNA 片段 。但由于琼脂糖凝胶 则再补加剩余体积的注射缓冲液 ,再次自然排空 。加 中必然存在的一些潜在杂质以及制备过程中可能存 入 1. 5mL 注射缓冲液 ,用干净离心管收集流出液 ,每 在痕量的酚或氯仿污染 ,外源 DNA 的纯度不可避免 管约 0. 3mL 。将最先流出的 0. 3mL 洗脱液丢弃 ,收 地会 受 到 一 定 程 度 的 影 响 。本 文 参 考 Davis 的 方 ) (集随后的 0. 9mL 含目的 DNA 片段。将收集到的样 5,用氯化钠梯度离心法制备外源 DNA 片段 ,可以 法 品于 4 ?,以 12 000g 离心 1h 后 ,移至干净的离心管 , 完全避免上述物质污染的可能性 ,用此方法制备的μ 丢弃管底的 100L 样品 。然后 ,取适量样品 ,用紫外 DNA 片段对小鼠受精卵进行显微注射后 ,与琼脂糖 分光光度计测定 DNA 浓度 。最后 ,将样品用显微注 凝胶回收法相比 ,受卵体母鼠的胚胎存活率 ,以及子 μ(μ 射缓冲液稀释到 1,2g/ mL ,分装为若干小份 20L/ ) 代小鼠中外源基因的整合率均有明显的提高 。 管,臵于 - 80 ?冰箱待用 。 1 . 3 琼脂糖凝胶回收法制备外源 D NA 片段1 材 料 和 方 法 将重组嗜菌体 DNA 用适当内切酶消化后 ,进行 1 . 1 材料 电泳 ,分离目的 DNA 片段和嗜菌体载体序列 。电泳 动物 : 昆明种小鼠购自中国药品生物制品检定 结束后 ,于紫外灯下切取目的 DNA 片段 ,然后加入适 γ所动物繁育场 。目的 DNA :含有人 G2珠蛋白基因 量 Buffer QX1 将含目的 DNA 片段的凝胶块溶解 。加 ( ) 及其调控序列 共约 20 kb的重组嗜菌体 L YBg R 入适量 Q IA EX?硅胶颗粒悬浮液 ,于室温 ,以10 000g 由本 室 构 建 。试 剂 : 琼 脂 糖 凝 胶 回 收 试 剂 盒 购 自 离心 5min 后 ,用适量 Buffer PE 清洗两次 。离心后 , Qiagen 公司 ; NA P210 脱盐柱购自 Phar macia 公司 ; 加入适量 ddHO 重悬沉淀 ,然后将上清液用酚2氯仿 2 dd HO 购 自 Gibco 公 司 ; NaCl 、ED TA 、Tris 等 其 他 () 12 ?1抽提 2 次 ,再用氯仿抽提 1 次 ,用乙醇沉淀样品 后 ,75 %乙醇洗 2 次 ,最后将样品重溶于显微注射缓 试剂均为 Sigma 公司产品 。 冲液 。用紫外分光光度计测定浓度 。将样品稀释到 1 . 2 氯化钠密度梯度离心法制备外源 DNA 片段 μ(μ) γ 用低复数感染法制备含有人 G2珠蛋白基因及 1,2g / mL 后 ,分装为若干小份 20L/ 管,臵于 - 6 μ80 ?冰箱储存 ,待用 。调控序列的重组嗜菌体 DNA,取 DNA 100g ,用适 1 . 4 用于转基因操作小鼠的准备当限制性内切核酸酶消化 ,以分离目的基因和嗜菌体 ( 卵供体母鼠的获得 :将 4,5 周昆明小鼠在明暗 载体 序 列 。用 离 心 缓 冲 液 10mmol/ L Tris2Cl , p H ) 循环中适应 3,5d 后即可用于超排卵 。下午 1,2 810 ;5 mmol/ L ED TA 分 别 配 制 20 %、15 %、10 %和 ( () 点钟腹腔注射孕马血清促性腺激素 PM S G ,5 U / 只 5 %w/ v的 NaCl 溶液 ,各取 3mL 依次缓慢加入超速 ) 鼠,46, 48 h 后 腹 腔 注 射 人 类 绒 毛 膜 促 性 腺 激 素 离心管中 ,室温放臵 4 h ,以形成递增的 NaCl 密度梯 ( ) 度 。然后 ,将上述限制酶消化产物用 ddHO 稀释到 hC G ,5 U / 只鼠,然后将每只母鼠同一只 8 周龄以 2 上的种鼠合笼 ,次日晨检查精栓 ,有精栓的小鼠即为 2mL ,小心加到 NaCl 密度梯度上层 ,于 20 ?、35 000r/ 5 期刘立仁等 :氯化钠密度梯度离心法制备用于显微注射的外源 DNA 片段 589 μ用于取卵的卵供体母鼠 。卵受体假孕母鼠的获得 :6,共收集 30 管 。每管各取 10L 样品进行 收集离心液 周以上昆明雌鼠与 8 周龄以上的输精管结扎公鼠交 电泳 。电泳结束后 ,在紫外灯下观察凝胶 ,目的 DNA (() 配产生精栓者即可作为当天的卵受体母鼠 ,供显微 约 20kb与嗜菌体载体序列 酶切后长度分别为 11. ) 注射后受精卵移植使用 。 9kb 、7. 5kb 、7. 3kb分布于 11 个管中 ,20kb 带与 11. ( 1 . 5 转基因小鼠的制备9kb 带及 7. 5kb 带得到很好的分离 715kb 带不能与 ) 受精卵的采集 、显微注射和移植 ,以及转基因阳7. 3kb 带分离。其中第 16 、17 管样品中目的 DNA 7() Ho gan 等的方法进行 性小鼠的鉴定均按 。约 20kb浓度较高 ,并且无载体序列混杂 ,将两管合 ( ) 1 . 6 统计学分析并后 ,用于进一步脱盐纯化及显微注射 图 1。 用 SPSS 软件对实验数据进行 统 计 学 分 析 , 计 2 . 2 两种纯化 D NA 片段方法制备转基因小鼠情况 2 χ数资料数据以百分比表示 ,采用检验 。 2 . 2 . 1 氯化钠密度梯度离心法制备外源 DNA 片段 显微 注 射 受 精 卵 986 枚 , 注 射 后 受 精 卵 存 活 2 结果 502 枚 。向当天的卵受体假孕母鼠移卵 502 枚 , 共 用氯化钠密度梯度离心法制备外源 D NA 片段出生仔鼠 72 只 ,其中在仔鼠中检测出转基因阳性鼠 2 . 1 () 17 只 见表 1。超速离心后 ,用 18 号注射针头刺穿离心管底部 , 图 1 超速离心后样品琼脂糖凝胶电泳分析 λFig. 1 Agarose gel of salt f raction that conta in digested recombinatant bacteriophageD NA The f ractio n 12,24 are shown . No DNA were detected in f ractio n 1,11 and () 25,30 figures are not shown. M , Hi n d I I I2digested lambda DNA. 表 1 转基因小鼠制备情况 () 射后 ,移植率 移植卵数/ 注射卵数为 50. 91 % ;胶回 Ta ble 1 Overall transgen ic eff ic iency 收法的移植率为 51. 05 % ,二者在统计学上无显著差 ( () 异性 P > 0. 05。移卵后的胚胎存活率 出生小鼠数 DNA 制备 注射卵数 移植卵数 出生小鼠 转基因 ( )( )( )方法 枚 枚 数 只 ( )小鼠数 只 ) / 移植卵数:氯化钠法为 14. 34 % ,胶回收法为 5158 % ,Off sp ring DNA Zygotes Zygotes Transgenics ( ) Prep . Injected Transferred 二者在统计学上存在显著差异性 P < 01001。外源基 氯化钠法 () 因整合率 转基因小鼠数/ 出生小鼠数?氯化钠法为 986 502 72 17 NaCl 23. 61 % ,而胶回收法为 5. 41 % ,二者在统计学上有显胶回收法 1227 635 37 2 ( ) () 著差异性 P < 0. 05见表 2 、图 2。 Gel 表 2 两种纯化 D NA 片段方法对转基因效率的影响 2 . 2 . 2 琼脂糖凝胶回收法制备外源 DNA 片段 Ta ble 2 Inf luence of the t wo preparation methods of 显微注射 受 精 卵 1227 枚 , 注 射 后 受 精 卵 存 活D NA f ragment on transgen ic eff iciency 635 枚 。向当天的卵受体假孕母鼠移卵 635 枚 , 共 ( ) ( ) ( )DNA 制备 移植率 %胚胎存活率 %外源基因整合率 % 出生仔鼠 37 只 ,其中在仔鼠中检测出转基因阳性鼠 方法 Transfer Embryo Transgene DNA Prep . rat e survival rat e int ergratio n rat e () 2 只 见表 1。氯化钠法 50 . 91 14 . 34 26 . 39 2 . 3 两种纯化 D NA 片段方法对转基因效率影响的 NaCl 胶回 比较分析 收法 Gel 51 . 75 5 . 82 5 . 41 用氯化钠法制备的外源 DNA 片段 ,进行显微注 才能发挥其细胞毒性作用 , 所以在 将 外 源 DNA 注 入受精卵后几个小时 、甚至十几个小时内 ,受精卵的 存活率并不会因为 DNA 纯度的不同而发生明显改 变 。然而 ,当受精卵移植到受卵体母鼠输卵管后 ,由 于纯度 较 低 的 外 源 DNA 具 有 一 定 的 细 胞 毒 性 作 用 ,从而会影响到受精卵的进一步分裂和发育 ,并最 终导致仔鼠出生率的降低 。 目前 ,外源基因整合到受精卵基因组的确切机 制还不 是 十 分 清 楚 , 外 源 DNA 的 浓 度 以 及 外 源 DNA 的末端序列对外源基因的整合率均有一定程 度的影响 ,但这方面的直接证据并不充分 。用氯化 图 2 两种纯化 D NA 片段方法对转基因效率的影响 钠梯度离心的方法制备外源 DNA 片 段 , 能 够 避 免 Fig. 2 Inf luence of the t wo preparation methods of D NA f ragment on transgen ic eff iciency 外源 DNA 受到电流的干扰以及溴化 乙 啶 的 嵌 入 , 同时由于省去了反复的抽提和沉淀步骤 ,外源基因 能够很好地保持其空间构象和线性末端的完整性 , 3 讨论 这很可能是外源基因整合率提高的一个重要因素 。 胚胎存活率和外源基因整合率是评估转基因动 总之 ,用氯 化 钠 梯 度 离 心 法 制 备 的 DNA 片 段 对小物成功率最重要的两个指标 。影响胚胎存活率的因 鼠受精卵进行显微注射后 ,能够明显地提高受 卵体素主要包括受精卵的状态 、显微注射操作的熟练程 母鼠的胚胎存活率及子代小鼠中外源基因的整 合度 、受卵体母鼠的假孕状态 、移卵技术的熟练程度及 率 。该方法为进一步提高转基因动物的成功率在 动物的饲养条件等 ,但最重要的则是用于显微注射 ,并取得了很好的效果 。方法学上进行了有益的尝试 的外源 DNA 的纯度 。目 前 , 大 多 数 实 验 室 普 遍 采 用琼脂糖凝胶回收法纯化外源 DNA 片段 。但由于 参 考 文 献( Ref erences) : 琼脂糖凝胶中存在着一些未知的杂质 ,同时由于琼 1 Gordon J W ,Scangos G A , Plot kin D J ,Barbosa J A ,Ruddle F H. Ge2 netic t ransformation of mouse embryos by microinjection of purified 脂糖凝胶回收试剂盒中的各种试剂以及制备过程中 DNAJ . Proc Natl Acad Sci USA ,1980 ,77 :7380 ,7384 .多种有机溶剂的污染 , 外源 DNA 的纯 度 会 受 到 一 CHEN Yo ng2Fu. Transgenic Animals M . Bei jing : Sciences 2 定程度的影响 。本文采用氯化钠梯度离心的方法制Press ,2002 ,3 . 备外源 DNA 片段 , 最大限度地减少了 各 种 污 染 的 陈永福. 转基因动物M . 北京 :科学出版社 ,2002 ,3 .可能性 。在纯化过程中 ,外源 DNA 仅仅接触 NaCl Brinster R L , Wsll R J . Transgenic Livestock . In : A. Alt man 3 ( ) Ed. . Agricult ural Biotechnology J . New Yo r k Marcel Dekker 溶液 ,由于 NaCl 本身也是卵细胞的一种组成成分 , Inc ,1998 ,pp . 453,472 . 所以即使在随后的制备过程中 不 能 被 完 全 去 除 干 Davis H L , Schleef M , Mo ritz P , Mancini M , Scho rr J , Whalen R 4 净 ,痕量的 NaCl 也不会 对 卵 细 胞 产 生 致 命 的 毒 性 G. Co mpariso n of Plasmid DNA p reparatio n met ho ds fo r direct 作用 。本文用氯化钠梯度离心法制备外源 DNA 片gene t ransfer and genetic immunizatio n J . Biotechni ques , 1996 , 21 :92,94 . 段对小鼠受精卵进行显微注射 ,与琼脂糖凝胶回收 5 Wall R J , Paleyanda R K , Fo ster J A , Powell A , Rexroad C ,L ubo n 法相比 ,移卵后受卵体母鼠的胚胎存活率具有明显 H. DNA p reparatio n met ho d can influence o utco me of t ransgenic 的提高 。这一结果说明 ,用氯化钠法梯度离心法制 ( ) animal experiment sJ . Anim Biotechnol ,2000 ,11 1:19,32 . 备的 DNA 片段 ,具有较小的细胞毒性 ,用其进行显 6 Sambroo k J E , Frit sch F , Maniatis T. Molecular clo ning : a labo ra2 微注射后 ,对受精卵的分裂增殖和生长发育影响较 to ry manual M . 2nd editio n . New Yo r k : Cold S p ring Harbo r Press ,1994 . 小 ,能够有效地提高转基因动物实验的成功率 。在 Hogan B , Beddo ngto n R , Co stantini F , et al . Manip ulating t he 7 我们的实验中 , 注射外源 DNA 片段后 的 受 精 卵 存 mo use embryo : a labo rato ry manual M . 2nd . New Yo r k : Cold () 活率 即受精卵移植率并没有受到不同制备方法的 Sp ring Harbo r Press ,1994 . 影响 ,这是由于那些潜在的污染物需要一定的时间