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色谱基础理论林直宏Email：Linzh@cnfuli.com.cn目录三高效气相色谱仪的结构与原理一、色谱法的基本理论色谱法的起源20世纪初，俄国科学家茨维（M.S.Tswett）提出经典液相色谱法后，色谱分析法取得了迅速的发展，分离基本模型3种组分同时进入色谱柱3种组分开始在色谱柱中分离3种组分在色谱柱中基本达到分离3种组分在色谱柱中完全达到分离色谱法，即利用组分在体系中固定相与流动相的分配差异，将混合物组分进行分离和测定的方法。色谱分类GC进样方式：样品转化为液体流动相：惰性气体，不予组分发生反应，黏度10-5Pa·s，输出压力0.1～1.0MPa。固定相：1、分离机理：吸附、分配、络合、手性作用2、色谱柱：填充（粒度0.1-0.5mm，柱内径1-4mm，柱长1-4m，柱效102-103；毛细（内径0.1-0.5mm，柱长10-100m，柱效103-104）；柱温室温-420℃。检测器：FID、TCD、ECD、FPD、NPD应用范围：低分子量、低沸点有机化合物；永久气体。LC进样方式：样品需为液体流动相：离子型、极性、弱极性或非极性溶液，可与被分析组分发生反应，黏度10-3Pa·s，输出压力45MPa。固定相：1、分离机理：吸附、分配、筛析、离子交换、亲和、手性作用。2、色谱柱：填充（粒度5-10um，柱内径3-6mm，柱长10-25cm，柱效104；柱温室温-50℃。检测器：UVD、DAD、FD（荧光）、ECD（电导）、RID、ELSD应用范围：低分子量、部分低沸点、高沸点、高分子量有机化合物；离子型化合物；生物活性物质。基本术语色谱图检测信号和时间的关系图不同的色谱峰对应相应的组分可以得到相应组分的保留时间和峰面积信息。保留时间–定性分析峰面积–定量分析基本术语保留时间（Retentiontime)：组份从进样到出现最大值所需要的时间，tR死时间(deadtime):不被固定相滞留的组份，从进样到出峰最大值所需要的时间，t0峰高（PeakHeigh)从峰最大值到峰底的距离,峰面积（PeakArea)峰与峰底之间的面积出峰异常-无峰或峰很小GCA.色谱柱连接是否正确B.系统是否有漏C.检测器是否工作开启，如FID点火了吗？FID高压静电正常吗？TCD加电流了吗D.柱中是否有载气E.样品是否降解、沉淀LCA.色谱柱连接是否正确B.系统是否有漏C.检测器是否正常，如UVD的是否能力异常，R/S是否正常；氘灯是否点亮D.流动相组分、纯度、配比是否正常E.样品是否降解、沉淀基线(baseline)基线(baseline)—经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。噪音(noise)—基线信号的波动。流动相波动、电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、色谱柱被污染所致。漂移(drift)—基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。基线异常-噪声、漂移变大或不GC流动相：载气不纯气源输出不稳气路有漏气检测器被污染色谱柱被污染LC流动相：流动相非色谱纯，使用试剂、水或药品不纯，或被污染；有气泡泵输液不稳检测器故障，如流过池漏液色谱柱被污染分离度（Resolution)当R=1时，有5％的重叠；当R=1.5时，分离程度为99.7%，可视为基线分离毛细管色谱柱比填充柱有更高的分辨率。两个相邻峰的分离程度。以两个组份保留值之差与其平均半峰宽值的比来示：峰的形状理想的峰型是高斯曲线.分子的理论统计学分布拖尾因子(tailingfactor，T)用以衡量色谱峰的对称性。也称为对称因子(symmetryfactor)或不对称因子(asymmetryfactor)。《中国药典》规定T应为0.95~1.05。T＜0.95为前延峰，T＞1.05为拖尾峰。峰型异常-前伸峰GC峰伸舌多为色谱柱过载，减小进样量，使用大容量柱子提高OVEN，INJ温度；进样技巧提高。色谱柱的连接LC死体积太大样品溶液的配比极性与流动相的极性相差太大。减少进样量；保护柱或柱失效峰型异常-峰拖尾GC溶剂/固定相极性不相匹配色谱柱安装不正确同时有两个峰流出分流比太小LC色谱柱被污染或失效进样阀漏液峰型异常-峰开叉GC进样口污染色谱柱被污染样品被污染，混入难分离杂质检测器被污染LC保护柱污染柱失效样品被污染，混入难分离杂质分配系数(distributioncoefficient，K)在一定温度下，化合物在两相间达到分配平衡时，在固定相与流动相中的浓度之比。分配系数与组分、流动相和固定相的热力学性质有关，也与温度、压力有关。混合物中各组分的分配系数相差越大，越容易分LC:流动相（组分比例、pH）、流速、进样量GC:流速、温度、进样量峰展宽的度量.以塔板数来表示类似蒸馏中的气液平衡柱效（ColumnEfficiency)例如，图示中塔板数为3.塔板理论理论塔板数为：n=5.54(tR/W1/2)2速率方程气相色谱速率方程（VanDeemter方程）液相色谱速率方程（即Giddings方程）ABCABCvanDeemter曲线（颗粒度和柱床填装的优良程度）HeightEquivalenttoTheoreticalPlate线速度U（mm/sec）HETP最低HETP=>最优化的塔板数H（传质）（纵向扩散）HETPPLATES影响色谱柱效率的因素A.涡流扩散(不同路径的影响).•采用细而均匀的载体，这样有助于提高柱效•毛细管柱可忽略该项A＝2λdp，dp为填料直径，λ为填充不规则因子，填充越不均匀λ越大。对于HPLC来说颗粒度越小柱效越高颗粒度控制着分离的质量更小的颗粒度：使最高柱效点向更高线速度方向移动有更宽的线速度范围降低颗粒度不但可以增加柱效，同时也增加分离速度vanDeemter曲线的挑战如果填料的颗粒继续演变……HPLC（高效液相色谱法）填料颗粒尺寸的演变如果我们使用更小颗粒度的填料会发生什么情况？影响色谱柱效率的因素B.纵向扩散.气相中分子的扩散主要决定于气体流速由于进样后溶质分子在柱内存在浓度梯度，导致轴向扩散而引起的峰展宽。B/u＝2γDm/u。u为流动相线速度，分子在柱内的滞留时间越长（u小），展宽越严重。Dm为分子在流动相中的扩散系数，由于液相的Dm很小，通常仅为气相的10-4~10-5，因此在HPLC中，只要流速不太低的话，这一项可以忽略不计。γ是考虑到填料的存在使溶质分子不能自由地轴向扩散，而引入的柱，用以对Dm进行校正。γ一般在0.6~0.7左右，毛细管柱的γ＝1。影响色谱柱效率的因素C.传质阻力.•对于GC来说•主要取决于气体的流速和固定相量的多少。由于溶质分子在流动相、静态流动相和固定相中的传质过程而导致的峰展宽。对于LC来说流动相传质阻抗静态流动相传质阻抗这是由于在一个流路中流路中心和边缘的流速不等所致。靠近填充颗粒的流动相流速较慢，而中心较快，处于中心的分子还未来得及与固定相达到分配平衡就随流动相前移，因而产生峰展宽。这是由于溶质分子进入处于固定相孔穴内的静止流动相中，晚回到流路中而引起峰展宽。高柱温颗粒越小，微孔孔径越大固定相传质阻抗只有在厚涂层固定液、深孔离子交换树脂或解吸速度慢的吸附色谱中，Hs才有明显影响。速率方程给我们的启示①进样时间要短。②填料粒度要小。③改善传质过程。过高的吸附作用力可导致严重的峰展宽和拖尾，甚至不可逆吸附。④适当的流速。以H对u作图，则有一最佳线速度uopt，在此线速度时，H最小。一般在液相色谱中，uopt很小（大约0.03~0.1mm/s），在这样的线速度下分析样品需要很长时间，一般来说都选在1mm/s的条件下操作。⑤较小的检测器死体积。例：载气对VanDeemter图的影响•N2,变化最大,可得到最低的HETP.•H2和He曲线较平坦，即使较高的流速下也能得到较低的HETP，所以即使在较高的分析速度时，也可以得到较好的分离度.常用毛细管柱的最佳载气流量二、气相色谱仪的结构及检测器原理作用：1）载气：作为色谱的流动相2）检测器的工作气体。载气：-惰性：He,Ar,N2,H2.-根据检测器,价格及方便程度来决定-采用压力调节器以获得恒定的仪器输入压力-控制流量来得到恒定的流速气源气体进口及连接（9790型）进样口作用：样品进样和汽化.要求：精度和重现性根据样品的性质选择进样技术——填充柱进样口——毛细管柱进样口色谱柱液膜：0.25-12μm检测器热导检测器（TCD）气相色谱最早的检测器,1946.测量样品气流导热性能的变化。热导-热量从高温物体到低温物体的传导。两个平行的气流，样品和参考。惠斯通电桥用来比较两个气流的阻抗。气流的速度、压力及电的变化影响被最小化。氢火焰检测器（FID）最常用的GC检测器.-是有机物的通用型检测器。-检出限<5pg.-线性范围可达7个数量级.-容易操作破坏型检测器－－样品燃烧信号值大小取决于碳原子数目及替代物的数量。响应离子数目正比于碳原子数目(C-H键).一些官能团如羰基(CO=)、羟基(－OH）、卤素（－X）、胺（NH4+）则很少或根本不会离子化。对无机气体如H2O,CO2,SO2,和Nox不灵敏。火焰以氢气和空气作为燃气。在控制的流速下进行电子点火。火焰无色－除非受到污染。设计结构FID电路设计（9790）基流；可变电阻补偿抵消电子捕获检测器（ECD）非破坏性。对卤素、过氧化物、醌类金属有机物及硝基化合物非常灵敏，0.03pg。而对胺类、醇类及碳氢化合物不灵敏。线性窄，－103.主要用于食品、制药、环保等领域，检测痕量含卤素等的样品一定不要试图去拆卸该检测器ECD原理射线粒子使载气离子化:N2+N2+e-在电场中生成的正离子和电子向两极移动形成基流。当电负性样品进入后即捕获慢速低能量电子使基流下降形成信号。e-+samplecurrentloss12·△f=f-f0=kα其中：f：脉冲频率f0：基本脉冲频率（只有载气通过ECD时的脉冲频率）k：由电子捕获率和其它因素决定的常数α：电负性物质的浓度电离惰性气体分子火焰光度检测器（FPD）◆FPD是利用富氢火焰含硫杂原子或含磷杂原子的有机物分解，形成激发态分子，当它们回到基态时，发射出一定波长的光。此光强度与被测组分成比例。所以它是以物质与光的相互关系为机理的检测方法，属光度法。◆FPD是一种高灵敏度和高选择性的检测器，只能用于含硫、磷化合物，特别是硫化合物的痕量检测。394nm的滤光片来检测含硫的组分526nm的滤光片用于检测含磷的组分氮磷检测器(NPD）只对氮、磷有很高的选择性氮的灵敏度：<1pg/sec；磷为：<0.5pg/sec主要应用于：药物、燃料、香料、农药残留NPD的结构类似FID，主要差别是NPD在喷嘴上方有铷珠。化学反应原理燃烧产生CN·和HPO·Rb·+CN·®Rb++CN-(detected)Rb·+HPO·®Rb++HPO-(detected)当含N、P化合物进人电离源的冷焰区，生成稳定的电负性基团(CN和PO或PO2)，电负性基团从气化的铷原子上获得电子生成Rb+与负离子CN-或PO-,、PO2-。负离子在正电位的收集极释放出一个电子，同时物出信号。Rb+又回到负电位的物表面，被吸收还原.以维持电离源的长期使用。三、高效液相色谱仪结构及原理淋洗液色谱柱检测器数据处理进样器输液泵步进马达凸轮排放阀旋钮压力传感器信号往进样阀排放流动相进口1、输液泵工作原理（FL2200）吸液：柱塞由泵腔向外运动从单向阀进口向上形成较低压力，进口单向阀被打开，流动相进入泵腔。由于系统压力大于泵腔压力，出口单向阀被关闭，此时入口单向阀及泵头内为低压状态，出口单向阀处于高压状态。输液泵工作原理（FL2200）输液泵工作原理（FL2200）排液：柱塞向泵腔内运动，进口单向阀关闭。出口单向阀打开，流动相进入色谱系统。此时整个泵全部处于高压状态。入口单向阀出口单向阀进口单向阀安装在泵头的下部出口单向阀安装在泵头的上部这样有利于气泡的排出，阀体是不锈钢的，里面装宝石小球，安装在阀体进口端的是宝石球座，在出口处装有筛网。液体向反方向流时（从上往下）球落入宝石球座内，阻止液体回流。单向阀工作原理（FL2200）检测器工作原理（FL2200）-光路检测原理：基于流过池中的样品溶液对光产生吸收有信号差。朗伯－比耳定律光能量：Io=透过溶液的光能量It=透过样品的光能量光通量（透过率％）：T=It/Io吸光度：A=-log(T)=log(Io/It)吸光度：A=KcLT-浓度曲线A-浓度曲线低浓度样品高浓度样品不同种类的溶剂有其不同的截止波长溶剂质量的好坏对其截止波长有影响为何溶剂质量影响截止波长？1.含紫外吸收的杂质2.溶解在其中的氧气3.缓冲液溶剂的紫外吸收