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一、实验目的 学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。 掌握垂直板电泳的操作方法。 运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染色鉴定。二、实验原理 带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动，这种现象称为电泳。 区带电泳是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄层样品溶液，然后加电场，分子在支持介质上或支持介质中迁移。 支持介质的作用：防止机械干扰和由于温度变化以及大分子溶液的高密度而产生的对流。聚丙烯酰胺凝胶的聚合反应 单体：丙烯酰胺（Acr） 交联剂：甲叉双丙烯酰胺（Bis） 催化剂：过硫酸胺 加速剂：四甲基乙二胺（TEMED） 产物：三维网状结构的凝胶 PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类。 连续电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应分离。 不连续电泳系统中缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度具有不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，所分离条带清晰度及分辨率较好。不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶层由浓度不同的两层凝胶组成：上层凝胶浓度较低（3％），为大孔径的浓缩胶，凝胶对溶质的泳动无阻滞作用，溶质在此层得到浓缩；下层凝胶浓度较高（5-25％），为小孔径的分离胶，各个组分根据迁移率的差别分离。当蛋白质的pI小于8-9.5时，一般电极缓冲液采用pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.8的Tris-HCl缓冲液，分离胶为pH8.8的Tris-HCl缓冲液。在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即样品的浓缩效应，凝胶的分子筛效应和电荷效应，由于这三种物理效应，使样品分离效果好，分辨率高。8.38.38.96.7－＋ SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）。 SDS与蛋白质结合后引起蛋白质构象的改变。SDS-蛋白质复合物的形状近似于长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，而长轴则随蛋白质相对分子质量成正比变化。 当SDS与蛋白质结合后，蛋白质分子即带有大量的负电荷，并远远超越其原来的电荷，使蛋白质分子间的电荷差别降低乃至消除。 SDS-蛋白质复合物在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，只是蛋白质相对分子质量的函数。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：lgMW=K-bX式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数。 若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。15%15-45Kd12.5%15-60Kd10%18-75Kd7.5%30-120Kd5%60-210Kd聚丙烯酰胺浓度越高，凝胶孔径越小，适合分离的溶质的相对分子质量越小。不同浓度聚丙烯酰胺分离胶分离蛋白质范围 采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测蛋白质分子量时，只有完全打开二硫键，蛋白质分子才能被解聚，SDS才能定量地结合到亚基上而给出相对迁移率和分子量对数的线性关系。因此在用SDS处理样品同时往往用巯基乙醇处理，使被还原的二硫键不易再氧化，使很多不溶性蛋白质溶解而与SDS定量结合。 有许多蛋白质是由亚基或两条以上肽链组成的，在SDS和巯基乙醇作用下，解离成亚基或单条肽链，因此这一类蛋白质测定时只是它们的亚基或单条肽链的分子量。 已发现有些蛋白质不能用SDS-PAGE测定分子量。如电荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（某些糖蛋白）以及一些结构蛋白，如胶原蛋白等。 一般至少采用两种方法测定未知样品分子量，互相验证。三.实验试剂和器材1.材料低分子量标准蛋白试剂盒低分子量标准蛋白：兔磷酸化酶BMW=97,400牛血清白蛋白MW=66,200兔肌动蛋白MW=43,000牛碳酸酐酶MW=31,000胰蛋白酶抑制剂MW=20,100鸡蛋清溶菌酶MW=14,400根据说明处理标准蛋白。2.实验试剂（1）30%丙烯酰胺（Acr）：称Acr29g，甲叉双丙烯酰胺（Bis）1g，加蒸馏水至100mL，过滤后置棕色瓶中，4℃贮存可用1-2月。（2）1.5mol/LTris-HCl缓冲液，pH8.8：称取Tris18.2g，加入50mL水，用50％盐酸调pH8.8，最后用蒸馏水定容至100mL。（3）1.0mol/LTris-HCl缓冲液，pH6.8：称取Tris12.1g，加入50mL水，用50％盐酸调pH6.8，最后用蒸馏水定容至100mL。（4）10%SDS（十二烷基磺酸钠）。（5）10%过硫酸铵（AP）：称取0.1g过硫酸铵，加入1mL水溶解。（6）TEMED（四甲基乙二胺）（7）2×SDS-PAGE上样缓冲液：0.4gSDS，20mg溴酚蓝，2mL甘油，1mL1MTris-HCl（pH8.0），20μL巯基乙醇，定容至10mL。（8）SDS-PAGE电泳缓冲液（25mMTris，0.25M甘氨酸，0.1%SDS，pH8.3）：称Tris3.02g，甘氨酸18.8g，加入SDS1g，加蒸馏水使其溶解后定容至1L。（9）染色液：称考马斯亮蓝R2500.25g，溶于227mL蒸馏水，227mL甲醇，46mL冰醋酸的混合液中，过滤后备用。（10）脱色液：冰乙酸100ml，乙醇50ml，加蒸馏水850mL，混匀。考马斯亮蓝染色法所用试剂（11）银染固定液。10%冰乙酸溶液。（12）银染溶液。0.1%硝酸银溶液100mL，使用前加37%甲醛0.5mL。（13）显影液。3%碳酸钠溶液200mL，使用前加硫代硫酸钠0.8mg和37%甲醛1mL。银染法所用试剂3.实验器材 垂直板电泳装置 直流稳压电源 移液管 滤纸 微量注射器 大培养皿四、实验要求 样品1：蔗糖酶 样品2：肌酸激酶（从中华鳖肌肉中提取） 样品3：牛血清白蛋白 样品4：酪氨酸酶（从双胞蘑菇中提取）根据老师提供的蛋白质样品，先查阅资料，按其分子量选择合适的凝胶浓度进行SDS-PAGE凝胶电泳，选择考马斯亮蓝或银染法进行染色，测定样品的分子量和纯度情况。五.实验步骤1.配制SDS聚丙烯酰胺凝胶所需的各种试剂2.SDS聚丙烯酰胺凝胶的灌制1）根据厂家说明书安装玻璃板2）确定所需凝胶溶液体积，按下表给出的数值在一小烧杯中按所需丙烯酰胺浓度配制一定体积的分离胶溶液。一旦加入TEMED，马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物并进入下步操作。 3）迅速在两玻璃板的间隙中灌注丙烯酰胺溶液，留出灌注浓缩胶所需空间（梳子的齿长再加0.5cm）。再在胶液面上小心注入1mL蒸馏水以阻止氧气进入凝胶溶液。 4）分离胶聚合完全后（约30分钟），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。※水封的目的是为了使分离胶上延平直，并隔绝空气。※凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。 5）制备浓缩胶：按下表给出的数据，在另一小烧杯中制备一定体积及一定浓度的丙烯酰胺溶液，一旦加入TEMED，马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物并进入下步操作。 6）聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶，立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。加入浓缩胶溶液以充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下。 7）在等待浓缩胶聚合时，可对样品进行处理，在样品中按1:1体积比加入上样缓冲液，在100℃加热5分钟以使蛋白质变性。 8）浓缩胶聚合完全后（30分钟），小心移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入Tris-甘氨酸电极缓冲液。※要使锯齿孔内的气泡全部排出，否则会影响加样效果。※样梳需一次平稳插入，梳口处不得有气泡，梳底需水平。3.加样电泳 1）按预定顺序加样，加样量通常为10－25μL（1.5mm厚的胶）。 2）将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为60V。当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到120V，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约1cm，然后关闭电源。 3）从电泳装置上卸下玻璃板，用刮勺撬开玻璃板。紧靠最左边一孔（第一槽）凝胶下部切去一角以标注凝胶的方位。※枪头插入不可过低，以防刺破胶体，也不可过高，在样品下沉时会扩散。※为避免边缘效应，最好选用中部的孔注样。※剥胶时要小心，保持胶完好无损。4.染色方法1）用考马斯亮蓝对SDS聚丙烯酰胺凝胶进行染色 经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品可用考马斯亮蓝R250染色。染色1小时。 2）换脱色液脱色 需3～10小时，其间更换多次脱色液至背景清楚。 脱色后，对凝胶进行拍照。考马斯亮蓝染色法要求尽量在低温下操作，所有溶液提前预冷到4℃，戴手套操作，以免指纹污染。 1）把胶放入塑料盒中，加入银染固定液约3～5倍的体积，没过凝胶，在摇床上慢速振荡30min。 2）蒸馏水洗胶3次，每次2min。 3）转移凝胶到银染溶液中，注意：37%甲醛0.5mL在使用前才能加入。摇床上慢速振荡染色30min。 4）转移凝胶到10℃以下的蒸馏水中振荡洗涤10sec。银染法 5）快速转移凝胶到显影液中，注意：硫代硫酸钠0.8mg和37%甲醛1mL在使用前才能加入。快速振荡并观察斑带的出现，若理想结果一出现应及时终止显影。如果显影时间过长，凝胶背景颜色变深，影响整体效果。 6）终止显影。把凝胶放回原来的银染固定液中，中速振荡5min。 7）蒸馏水漂洗最后一次。凝胶成像系统扫描。六.计算分析绘制标准曲线：按下式计算相对迁移率：蛋白样品距加样端距离（cm）相对迁移率＝溴酚蓝区带距加样端距离（cm）以每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁移率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即可测出其分于量。注意：这样的标难曲线只对同一块凝胶上的样品的分子量测定才具有可靠性。注意事项 丙烯酰胺具有中等毒性。常人每天允许的最大暴露量不超过0.5μg/kg，皮肤接触可致中毒，症状为红斑、脱皮、眩晕、动作机能失调、四肢无力等。丙烯酰胺是神经毒剂，可以透过皮肤，不要接触皮肤，戴手套、口罩操作。注意事项 没有聚合的丙烯酰胺不要倾倒到水源附近 一定要催化充分，使之完全聚合 集中处理，实验中全部的胶由专门受过训练的人收集到一起，在一个特殊标明的容器中保存，并进一步催化使之反应完全，最后送交学校危险品仓库，统一处理。七.课后研讨 1、总结本实验操作的关键环节和注意事项。 2、查阅资料，说明SDS-PAGE电泳染色的方法有哪些，比较各种染色方法的下限。 3、查阅资料，举例说明PAGE电泳的应用和发展。 4、查阅资料，结合自己的实验经验，分析以下电泳异常情况的原因和解决办法。 1）电泳的胶凝不了 2）电泳最后脱色后的胶上蛋白质扩散的一塌糊涂， 3）在电泳时蛋白质条带跑歪了 4）电泳时间比正常要长 5）为什么电泳电压很高而电流却很低呢？ 6）配好的胶还没灌胶就凝固了 7）电泳过程中突然发现电压正常，电流为0了 8）染色后发现电泳的条带很不明显八、汇报要求 以大组为单位课后总结结果，讨论，制作一份，课内讨论汇报。 ppt内容包括：实验目的，实验条件的选择，各小组实验结果，计算结果和分析，课后研讨题，实验体会等。