【doc】寒下药物对MODS大鼠模型肝细胞溶酶体的损伤及膜功能的影响

【doc】寒下药物对MODS大鼠模型肝细胞溶酶体的损伤及膜功能的影响 寒下药物对MODS大鼠模型肝细胞溶酶体 的损伤及膜功能的影响 ()6 中医杂志l998年11月第39卷第u期 实验研究 寒下药物对MUDS大鼠模型肝细胞溶酶体 的损伤及膜功能的影响6 赵琪崔乃强丰继坤吴成中 摘要作者对寒下药物对急性感染性腹膜戎及肠系膜 动脉缺血再灌流致多脏器功能不全综合征(MUDS)大 鼠模型肝细胞溶酶体及膜功能的影响进行了观察,结 果明,MUDS大鼠肝细胞溶酶体中一乙酰氨基葡 萄糖苷酸酶(NAG)活性显着升高(P<O.01),以肠系 膜动脉缺血再灌流致MUDS大鼠肝细胞AG活性升 高最为显着,MUDS大鼠肝细胞溶酶体膜破裂后溢出 之NAG水平显着高于对照组(P<O.01),以急性感染 性腹膜炎致MUDS大鼠肝细胞中溶酶体溶破程度为 着.大承气汤治疗48小时后能显着降低MUDS大鼠 肝细胞溶酶体NAG水平,并使溶酶体破裂溢出之 NAG水平降低(P<005).大承气汤,承气合剂,大黄 均能降低热诱导所致大鼠肝细胞溶酶体膜的溶破率(尸 <o.05),表明通里攻下疗法具有脏器保护作用. 主题词寒下剂/治疗应用肝/酶学溶酶体/药物 —一一—一 j装"酥壹t}陉幢五 溶酶体的主要功能为细胞内消化作用,但在各种 致病因素刺激下,溶酶体膜破裂,可使其内所含酸性水 解酶活化而导致细胞被消化本实验观察多脏器功能 不全练合征(MultipleOrganDysfunctionSyndrome, MODS)模型大飘肝细胞溶酶体功能及溶酶体膜的稳 定性改变,并探讨内毒素及下法药物对其影响. l材料与方法 1_l体内给药实验 1_1.1MUDS大鼠模型复制:感染性腹膜炎致MUDS 大鼠模型复制:Wistar大鼠lO只,雄性,体重200士 l8.强.腹腔内注射致病大肠杆菌(0卅H,8×i0cfu/ m】)生理盐水混悬液lm],内吉l013aSO,对照组腹腔 内注射等量生理盐水,48zbB~后颈椎离断处死大鼠,取 肝组织分离溶酶体待测. 肠系膜上动脉缺血再灌流致MUDS太鼠模型复 天律市中西医结合急腹症研究所,天津市南开区 三纬路122号(3001oo) 收稿日期:1997--10--30;修回日期;1998--03--20 制:大鼠同上,模型制备前l2小时禁食水.皮巴比妥钠 腹腔内注射麻醉,无菌操作下取腹正中切口,切开腹 壁各层,于肠系膜根部近主动脉处寻找肠系膜动抹,以 动脉夹夹闭,逐层缝合腹壁各层,2小时后开放动脉夹, 重新缝合腹壁各层,假手术对照组开腹后于腹腔由轻 扰后关腹,观察48小时后取肝组织分离溶酶体待测. 1_1_2给药方法:上述MUDS大鼠于模型制备同时 予大承气汤(大黄,厚朴,枳实,芒硝,生药浓度lg/m], 本所药研室制备)灌胃,并于模型制备后6小时再次灌 胃,每24小时灌胃2次,每次2ml:对照组分别予等量 生理盐水灌胃 1.1.3大鼠肝细胞溶酶体制各:上述MUDS大鼠,经 治疗后颈椎离断处死,取同一部位肝组织约250, 300mg,称重后迅速置少量预冷0.25M蔗糖溶液中冷 锌后取出,剪碎,加入3倍量预冷0.25M蔗糖溶液.制 成20(W/V)肝组织匀浆,2000g离心15分钟(一 4C),上清液以45000g离心20丹钟,保留上清,一4c 60000g离心30分钟,保留上清液,沉淀,以0.25M蔗 糖溶液洗1次,并制成lrl溶酶体混悬液(v/v).分 别测定肝细胞溶酶体中(NAG)及溶酶体膜稳定性. 1.1_4大鼠肝细胞溶酶体NAG测定方法:在上述已 制备的MUDS大鼠肝细胞溶酶体悬液中加入l0 Tritonx,i000iml,混匀后测定NAG含量,同时测 定所保留的各组离心上清液中NAG含量NAG测定 方法按大连金港制药有限公司生产的NAG检测试剂 盘说明书进行.检测结果每mg蛋白(Lowry法)中 所含NAG含量方式表示,即u/mg/m]. 1.15MODS大鼠肝细胞溶酶体膜稳定性测定:对在 上述各组MUDS大鼠肝细胞溶酶体制备过程中所保 留的上清液行NAG测定. 1.2体外给药实验 1_2.1含有中药寒下药物有救吸收成分兔血清的制 备:健康北京大耳白免6只,分别大承气汤,承气合 剂及大黄(生药浓度lg/m[)灌胃,每种药物试验用兔2 只,剂量为每天30ml/kg,分3次灌服,连续灌服3天, 同时禁食不禁水,在最后一次中药灌胃4小时后做心 684 脏穿刺采血,分离血清,56?2小时使补体成分灭活此 血清即为含中药寒下药物有效吸收成分之兔血清,一 20?保存备用. 1.2.2对溶酶体膜保护作用的体外观察:取健康大 鼠,制备肝细胞溶酶体混悬液方法同上.同时取此溶酶 体混悬液,分别在含大承气汤,承气合剂,大黄有效吸 收成分的兔血清相互作用后测定溶酶体膜溶破后释放 于上清液中的NAG含量具体方法为,取此健康大鼠 肝细胞溶酶体悬液0.8ml,分别加^上述兔血清 0.2ml,42?水浴2小时,热诱导法溶破溶酶体膜, 60000g离心l5分钟(一4?),取上清灌测定NAG含 量(方法同上).以等量0.25M蔗糖溶液代替免血清作 为空白对照组,以地塞米松(终浓度100~g/m])为阳性 对照组,每组设平行管6管 2结果 感染性腹膜炎及肠系膜动脉缺血再灌流所致 MODS大鼠模型肝细胞溶酶NAG含量较健康对照组 明显升高.肠系膜动脉缺血再灌流大鼠肝细咆溶酵 体NAG水平升高晟为显着(P<0.01),感染性腹膜炎 致MODS组次之(P<0.o1).溶破至细胞质内或细胞 组织问之溶酶体酶NAG在MODS模型组中显着高于 对照组但以感染性腹膜炎组升高为着(P<0.01),肠 系膜动脉缺血再灌流致MODS组次之(P<O.01).以 大承气汤作为攻下药物治疗MODs模型大鼠48小时 后能使大鼠肝细胞内溶酶体酶NAG水平降低(P< 0.05),大承气汤同时能使逃溢至细胞内或细胞问的 NAG水平降低,以感染性腹膜炎致MODS模型组 NAG下降最为显着(P<O.or).肠系膜缺血再灌流组 次之(P<0.O5). 体外实验结果表明大承气汤,承气合剂,大黄能 降低热诱导所致大鼠肝细胞溶酶体膜的溶破率,以承 气合剂的溶酶体膜稳定作用最为显着(P<o.o5),大黄 次之(P<0.05),大承气汤最弱(尸<0.05).但三种药 物的稳定溶酶体膜作用均较地塞米松组为弱(P< 0.O1). TCMNov.1998,,,oI_39,No.ii 3讨论 肝细胞同胰腺细胞,多形核白细胞等相似,均含有 丰富的溶酶体,酸性水解酶中的NAG为溶酶体标志物 (marker)之一,且对细胞损伤反应最为敏感.为监测 细咆损伤的标志物之一.但目前对肝细胞的溶酶体酶 活化及舟导细胞损伤的机制尚不十分清楚D]. 本实验证实MODS发病时,肝细胞溶酶体酶含量 急骤增加,且释放至胞质及组织细胞问的NAG酶含量 亦明显增加,表明MODS发病时溶酶体酶大量外溢. 溶酶体酶外溢过程本身亦即溶酶体酶活化的过程.资 料表明,以大脑杆菌LPS复制家兔内毒素休克时.静 注LPS1小时后外周血中NAG活性即显着增高,并舟 导MODs过程的产生.经治疗后MODS的状态改善. 则外周血NAG水平亦随之下降.涪酶体酶活化后,对 细胞及组织产生致损作用.使细胞溶解,叉可导致其他 溶酶体膜溶破厦酶活化,产生溶酶体酶活化及细胞损 伤的"瀑布效应,导致组织脏器功能严重损伤叫溶酶 体膜脆性增加是导致溶酶体酶溢出活化及MODS时 脏器损伤的重要固素之一l3],体内实验证实.大承气扬 能使游离NAG水平降低,即具有稳定溶酶体膜的作 用.体外热诱导法也证实此结论;大黄及承气合剂体外 稳定溶酶体膜的作用要优于大承气汤.大承气汤尚能 抑制MODS发病时溶酶体酶的过度合成,使溶酶体酶 总含量降低此可能为下法治疗MODS的机制之一= 4参考文献 1王今迭.90年代多脏衰综音征:SIRS与MODS.中国危重 扁急救医学,1995,7(6)324. 2Bea1.AI.CerraFB.Muldp]eorgaafai]u~syndrome】n the1990s.systeminflammatoryresponse&orga~ dys~unciton.JAMA,1994,271:226. 3赵琪.崔乃强,吴威中.等.内毒嚣耐人外周血单棱细胞 内蝣离钙离子浓度的影响.中国中西医结合外科杂志. 1996.2(2):115 注:此研究系国家中医药管理局招标课题(0920181) 震墓雾萋1箍I15liIJ,Jll~2kD一4;女H0,自'喜0,自腓20自E目}i口.*3"/自&328,e,T^^#"i::=:=:::':=="::#"&?a/自】50,i?自30^^目22i=2=一二.一:':?gBi,e?325估E】c?;L十一I三:11月2?,月】9B,ex()j『-十uuwj'