脱氧雪腐镰刀菌烯醇抑制体外培养人外周血单个核细胞低分子量蛋白酶体-2表达

脱氧雪腐镰刀菌烯醇抑制体外培养人外周血单个核细胞低分子量蛋白酶体-2达 脱氧雪腐镰刀菌烯醇抑制体外培养人外周 血单个核细胞低分子量蛋白酶体-2表达 细胞生物学杂志 ChineseJournalofCellBiology2005,27:347350 脱氧雪腐镰刀菌烯醇抑制体外培养人外周血 单个核细胞低分子量蛋白酶体.2表达 李月红张祥宏邢凌霄左连富严霞王俊灵王凤荣 (河北医科大学基础医学研究所实验病理室,石家庄市0500l7; ?河北省肿瘤研究所细胞室,石家庄市0500l1) 摘要探讨脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)对人外周血单个核细胞参与抗原呈递的低分子量蛋 白酶体.2(LMP-2)表达的影响.采用流式细胞术(FCM)和半定量RT.PCR从蛋白质和mRNA水 平了不同剂量DON对体外培养人外周血单个核细胞LMP.2分子表达的影响及其量效关系. FCM定量检测结果表明,不同浓度DON处理均可一定程度抑制人外周血单个核细胞LMP.2的表 达,50ng/mlDON组,100ng/mlDON组,1000ng/mlDON组和2000ng/mlDON组LMP.2平均 荧光强度分别为6.99?0.72,6.21?0.55,5.34?0.56和5.03?0.43,在50, 2000ng/mL范围 内随着DON浓度增加,外周血单个核细胞LMP.2表达降低,与DON浓度呈显着负相关(r=O.824, P<O.01).半定量RT.PCR结果显示,不同浓度DON处理均可抑制人外周血单个核细胞LMP.2 mRNA表达.DON在蛋白质和mRNA水平可剂量依赖地抑制体外培养的人外周血单个核细胞LMP. 2的表达. 关键词脱氧雪腐镰刀菌烯醇;人外周血单个核细胞;低分子量蛋白酶体.2;RT.PCR 低分子量蛋白酶体(1OWmolecularweight polypeptide,LMP)包括LMP.2和LMP.7两个亚基是 抗原加工呈递过程的重要辅助分子,负责加工抗 原,将其酶解成能被抗原加工相关转运体 (transporterassociatedwithantigenprocessing,TAP) 转运的小分子多肽,才能进一步呈递给人类白细胞 抗原.I(humanleucocyteantigenI,HLA.I)引起免疫应 答.LMP在调节HLA.1分子限制性抗原的加工和呈 递功能中发挥着重要作用,LMP的表达丢失或下降 可造成蛋白酶解功能降低进而HLA.1分子表达下 调,影响T淋巴细胞免疫应答和免疫监视功能…. 脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)又称 作呕吐毒素(vomitoxin,VT),是我国食管癌,胃癌 高发区居民粮食的主要污染霉菌毒素之一【2】.国内 外研究表明,DON可通过诱导免疫细胞凋亡,影 响细胞子分泌等对人和动物免疫功能产生负面影 响[3-5】,但有关D0N对机体免疫细胞HLA.I,TAP 和LMP等与细胞免疫监视功能密切相关因素表达影 响的研究尚未见报道.为进一步探讨我国肿瘤高发 区粮食常见污染霉菌毒素DON对人体免疫监视功能 的可能影响,分析其在肿瘤发生中的可能意义,本 研究应用半定量RT.PCR和流式细胞定量检测的方 法,在mRNA和蛋白质水平分析了DON对体外培 养的人外周血单个核细胞与免疫监视有关的LMP.2 表达的影响. 1材料与方法 1.1材料 流式细胞仪为美国BD公司生产的FACS42O 型;新鲜健康成年人外周静脉血由河北省血液中心 提供;DON为Sigma公司产品;淋巴细胞分离液 购自上海试剂二厂;RPMI1640培养基为GibcoBRL 公司产品;小鼠抗人LMP.2单克隆抗体为Santa Cruz公司产品. 1.2人外周静脉血单个核细胞的分离与培养 采用聚蔗糖.泛影葡胺密度梯度离心法(ficol1. hypaquedensitygradientcentrifugation)分离人外周静 脉血单个核细胞.主要步骤如下:每批新鲜抗凝静 收稿日期:2004.04.19接受日期:2005.01.O7 河北省自然科学基金资助项目(No.301350),科技部重大基础研究 项目前期研究专项(No.2001CCC00500) 通讯作者.Tel:03l1-7222082.E?mail:blyjs@hebmu.edu.cn 348研究论文 脉血100ml加等体积的生理盐水稀释,吸取淋巴细 胞分离液(每1Om1稀释血加5m1分离液)置于5Om1 离心管中,然后小心地将2倍体积的稀释血加在淋 巴细胞分离液上,2000r/min离心25min,小心 吸出分层液与血浆交界处的灰白色浑浊层(单个核细 胞),PBS洗2次,细胞按1×10个/ml的浓度接 种于含10%胎牛血清,10U/L青霉素,100mg/L 链霉素的RPMI1640培养基中,加入植物血凝素 (PHA)至终浓度300gg/ml,37?,5%C02培养. 1.3实验分组与处理 将单个核细胞浓度为1×106个/ml的4ml培养 基置于25ml的培养瓶中,按上述方法培养48h, 然后更换不含PHA的新的RPMI1640培养基,随 机分为对照组和实验组,实验组根据DON处理浓 度分为4个亚组,每组5瓶细胞.各DON处理组 分别加入浓度为100g/ml的DON溶液(生理盐水配 ~lJ)O.5gl,1gl,10gl和2O1,不足2O1的用生 理盐水补足,至终浓度分别为50ng/ml,100ng/ml, 1000ng/ml和2000ng/ml.对照组加入等量生理盐水 2O1,继续温育24h,生理盐水洗涤2次,更换 新的RPMI1640培养基,继续培养24h,然后离 心收集细胞,用于流式细胞术(flowcytometry, FCM)~URT—PCR检测. 1.4FCM样品的制备及LMP.2检测 离心收集细胞,PBS洗2次,1%多聚甲醛固 定,4?保存待测.LMP一2检测采用间接免疫荧光 法,主要步骤如下:离心收集细胞,以冷PBS(含 0.1%TritonX—lO0)洗涤,离心弃上清液:加入200 glPBS稀释的鼠抗人LMP一2的单克隆抗体轻吹混 匀,4?温育30min;PBS洗涤1次,加入200 glPBS稀释的荧光素标记的二抗轻吹混匀,避光4 ?温育3Omin:冷PBS离心洗涤2次,细胞重新 悬浮于200glPBS中混匀,置流式测试管中上机检 测.以荧光强度表示LMP一2表达的强弱,以平均 荧光强度计量各组LMP一2表达量. 1.5细胞总RNA的提取及电泳鉴定 采用异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA,主要 步骤如下:细胞沉淀中加入500裂解液【4mmoL/L 异硫氰酸胍,25mmol/L柠檬酸钠:0.5%十二烷 基肌氨酸钠(sodiumlauroylsarcosine.SLS),0.1mol/ LB—ME】,冰浴中裂解,转移至1.5mlEP管中, 依次加入1/10体积的2mol/L醋酸钠,等体积饱和 酚和1/5体积氯仿/异戊醇(49:1),剧烈振摇,冰 表1GAI)PIt和LMP.2引物 浴15min,4?10000r/min离心15min,上清液加 入等体积异丙醇混匀,一20?过夜,4?10000r/ min离心20min,加1ml75%乙醇洗涤沉淀,4 ?离心5min,沉淀自然干燥,加入2OglDepc—H,O 溶解沉淀,经1%琼脂糖凝胶电泳(1×TAE)1h, 鉴定其完整性,紫外灯下观察并照相. 1.6半定量RT.PCR检测LMP.2mRNA的表达 1.6.1反转录合成cDNA按顺序依次加入:5山 5×缓冲液,2.5gldNTP,0.5glRNasin,l1 AMV,O.5glOligo(dT).5,2gg样品RNA,加水 至终体积为251,42?水浴1h,冰浴10min, 放置一8O?冰箱备用. 1.6.2引物设计见表1.引物由软件辅助设计, 由上海生工公司合成. 1.6.3PCR反应PCR反应体系如下:5gl反转 录产物,5gl10×缓冲液,3glMgC12,O.5gl dNTP,0.3glTaqDNA聚合酶,上,下游引物各 10pmol,加三蒸水至终体积为5O1.置PCR仪 中扩增,扩增循环参数如下:94?变性5min, 94?50S,54?30S,72?30S,35次循环后 72?延伸10min,PCR产物于10%聚丙烯酰胺凝 胶中电泳,紫外分析仪中观察并照相,凝胶分析软 件进行定量. 1.7统计学处理 实验数据均以均数?标准差(?)表示,将实 验数据输入计算机,采用SPSSlO.o统计软件进行方 差分析和直线回归分析. 2结果 2.1FCM检测LMP.2表达 FCM定量分析表明,DON处理24h后,各 DON组单个核细胞LMP一2的平均表达量均低于对照 组,高浓度DoN(1000ng/mL和2000ng/mL)处理 组LMP一2表达降低更明显(表2,P<0.05,为3次 实验的平均值).在50ng/mL到2000ng/mL的浓 度范围内,随着DON处理浓度的升高,LMP.2表 达量相应降低,两者呈明显的负相关,直线回归方 程为y=7.382—0.608x(,=O.824,P<0.01,=15). 李月红等:脱氧雪腐镰刀菌烯醇抑制体外培养人外周血单个核细胞低分子量蛋白酶体.2表达349 表2不同浓度DON处理24h,人外周血单个核细胞LMP. 2表达?S,n=15) DON(ng/m1) 7.25?0.65 6.99?O.72 6.2l?O.55 5.34?0.56 5.O3?0.43 图1RT-PCR检测人外周血单个核细胞LMP.2mRNA表达 1:50ng/mlDON.2:100ng/mlDON;3:1000ng/mlDON: 4:2000ng/mlDON:5:对照:M:DNAmarker. 血l 懈 霞 N l-8 1.6 O.4 O.2 0.oo5O.ooloo.oolooO.oo2ooO.OO DON(ng/m1) 图2LMP-2RT.PCR产物凝胶成像定量分析结果 2.2半定量RT.PCR检测LMP.2mRNA表达 RT—PCR产物经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分 析,每个泳道均出现了两条阳性条带,与标准带比 较可知分别为231bp的内参照基因GAPDH和448bp 的LMP一2基因(图1).应用凝胶成像分析系统对其 进行定量分析,以LMP一2/GAPDH比值,表示 LMP一2的相对表达量,DON(50ng/ml,100ng/ml, 1000ng/na和2000ng/m1)处理组的LMP-2相对表达 量分别为1.48?0.26,0.94?0.11,0.71?0.24 和0.49?0.15,都低于对照组的1.64?0.16(3次 实验的平均值,图2). 3讨论 细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocyte, CTL)在机体抗肿瘤和免疫监视中发挥重要作用, HLA.I类分子限制性抗原的呈递是激活CTL的前 奏.在HLA—I类分子限制性抗原加工,转运和呈递 过程中,完整的内源性抗原必须先在细胞浆内,由 LMP.2和LMP-7两个亚基组成的LMP降解形成8,10 个氨基酸构成的多肽,然后由内质网膜上由TAP一1 和TAP-2两个亚基组成的TAP转运到内质网腔,才 能与新合成的HLA—I类分子结合形成HLA—I一抗原肽 复合物,转运至细胞表面,供T淋巴细胞识别引起 免疫应答.抗原的加工,转运,呈递是紧密联系 在一起的,任何一个和/或多个环节发生障碍,都 会导致不能有效的激活T淋巴细胞,抑制机体的免 疫应答.研究表明,LMP活性的降低或缺乏使蛋 白酶体降解蛋白质的能力明显减弱,可直接影响适 宜转运的小多肽的产生;干扰素一Y可以通过上调 LMP亚基的表达,增强蛋白酶体切割肽键的能力, 继而促进抗原的加工提呈【引. DON是我国食管癌高发区居民粮食中最常见的 一 种污染霉菌毒素,其污染率和含量均很高,常与 其他致癌性霉菌毒素如黄曲霉毒素,杂色曲霉素, 伏马菌素等形成混合污染【.目前,DON免疫毒 理学的研究越来越受到医学工作者的重视,但未见 DON对抗原呈递过程中抗原加工,转运影响的研究 报道.本研究从免疫应答的抗原加工,转运环节分 析了DON对体外培养的人外周血单个核细胞LMP一2 分子表达的影响.FCM定量分析结果发现,体外 培养经PHA活化的单个核细胞在DON处理24h后, LMP一2表达均受到明显抑制,而且随着DON浓度 的升高,LMP一2表达相应降低,与DON处理浓度 呈明显的负相关.半定量RT—PCR结果表明,DON 可明显抑制体外培养经PHA活化的单个核细胞LMP一 2mRNA表达.提示DON在蛋白质和mRNA水平上 可抑制HLA—I限制性抗原呈递途径中的抗原加工处 理和转运环节,影响了HLA—I限制性抗原呈递,从 而抑制细胞免疫应答,可能是DON免疫抑制作用 的另一重要机制. 结合河北省食管癌高发区多种霉菌毒素污染的 实际综合分析提示,食管癌高发区居民长期饮食 DON污染,可抑制LMP分子的表达,进而抑制细 胞毒性T淋巴细胞介导的免疫应答,有助于恶变细 胞逃避免疫监视和攻击,可能在其他致癌性霉菌毒 素致癌过程中发挥一定作用.因此,在食管癌高发 o ? O5ll2 350研究论文 区针对霉菌病因的预防工作中,具有免疫抑制作用 的非致癌性霉菌的污染应当引起肿瘤工作者的高度 重视. 参考文献(References) DovheySEeta1.CancerReJ.2000.60:5789 ZhangXHeta1.BiomedEnvironSci,l998,11:140 RotterBAeta1.JToxicolEnvironHealth.1996.48:l 夸红等中国病理生理杂志.2002.18778 SunXMeta1.BiomedEnvironSci,2002,15:145 GrjffjnTAeta1.JExpMed.1998,187:97 TheEffectsofDeoxyniValenolonLMP一2ExpressionofHumanPeripheral BloodTononuclearCellsinVitro Yue?HongLi,Xiang-HongZhang,Ling-XiaoXing,Lian-FuZuo.,XiaYan,Jun-LingWang,Feng-RongWang (LaboratoryofExperimentalPathology,InstituteofBasicMedicine,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China; LaboratoryofCytology,InstituteofHebeiProvinceOncology,Shijiazhuang050011,China) AbstractToexploretheeffectsofdeoxynivalenol(DON)onlowmolecularweightpolypeptide一2(LMP一 2)expressionofhumanperipheralbloodmononuclearcells.Effectsofdeoxynivalenolatdifferentconcentrationon LMP一 2expressionofhumanperipheralbloodmononuclearcellsinvitrowerestudiedwithflowcytometry(FCM) analysisandRT-PCR.FCManalysisindicatedthatLMP-2expressionofhumanperipheralbloodmononuclearcells werereducedatproteinlevelinDONtreatmentgroups(50ng/ml,100ng/ml,1000ng/rrdand2000ng/m1),themean fluorescenceintensityofLMP一 2expressioninDONgroupswere6.99~0.72,6.21~0.55,5.34~0.56and 5.03~0.43,respectively.AstheDONconcentrationincreasefrom50ng/mLto2000ng/mL,theexpressionof LMP?-2wasdecreasedcorrespondinglyandasignificantdose--dependedresponsenegativecorrelationcouldbe foundbetweenexpressionsofLMP-2andDONconcentration.RT-PCRalsoconfirmedthatDONathigherconcen- tration(1000ng/rrdand2000ng/rrd)coulddistinctinhibitLMP-2mRNAexpressions.TheresultssuggestthatDON couldreduceLMP-2expressionsofhumanperipheralbloodmononuclearcellsatproteinandmRNAlevelina concentration-dependedmannerinvitro. Keywordsdeoxynivalenol;humanperipheralbloodmononuclearcell;lowmolecularweightpolypeptide. 2:RT.PCR Received:April19,2004Accepted:January7,2005 ThisworkwassupportedbytheNaturalScienceFoundationofHebeiProvince(No.301350)andtheProphaseResearchofMajorBase ResearchofMinistryofScienceandTechnologyofChina(No.2001CCC00500) ‘Correspondingauthor.TeI:86—311—7222082,E—mail:blyjs@hebmu.e du.ca ?23456