高浓度EGF对小鼠肝细胞信号转导的动力学研究

高浓度EGF对小鼠肝细胞信号转导的动力学研究 0>.投稿赚钱 陕西医学杂志2005 年 6 月第 34 卷第 6 期 643 ??论著??临床研究?? 高浓度EGF 对小鼠肝细胞信号转导的动力学研究 四川省泸州医学院生物化学教研室 泸州 646000 刘友平 丁慧荣 吴民泸 李 洪 摘 要 目的: 探讨高浓度表皮生长因子 EGF 对小鼠肝细胞信号转导的动力学改变。 方法: 从细胞整体水平的角度出发, 采用双向电泳及放射 性同位素标记技术, 并结合相关数 据库资源和双向电泳专用分析软件, 分析小鼠肝细胞在高浓度的 EGF 信号持续刺激不同时 间得到的EGF 信号蛋白在EGF 信号转导过程中其磷酸化水平发生的动力学变化。结果: 在 高浓度 EGF 持续刺激下, 小鼠肝细胞内的某些结点信号蛋白如 Ep s 15 和 ER K 2 的磷酸化 动力学曲线表现为持续活化状态。结论: 在高浓度的 EGF 持续刺激下, EGF 信号网络系统 中的某些信号蛋白将会发生一定的改变, 这些改变可能与肿瘤的发生、发展有密切关系。 主题词 表皮生长因子 肝细胞 信号传导 小鼠 D ynam ics of h igh concen tra tion EGF signa lling tran sduction system in m ice hepa tocytes , 646000 D epartm en t of B iochem istry L uzhou M edical Co llege L uzhou L iu Youp ing D ing H u irong W u M in lu et al ABSTRACT O bjective: To study the change of dynam ics of h igh concentration EGF signalling . : 2 , 2 , transduction system in m ice hepatocytes M ethods D E m ethod PDQ uest D Sw iss P ro t T rEM BL and . PPDB etc w ere used to assay the pho spho rylated p ro teins related to h igh concentration EGF signaling . transduction in the w ho le hepatocytes D ynam ic curves of relative intensity versus tim e w ere draw n after . : analyzing changing of pho spho rylating level versus varying tim e of pho spho rylated p ro teins R esults Som e node p ro teins of EGF such as Ep s 15 and ER K2 show ed constant activation under the constant stim ulation of h igh concentration EGF. Conclusion: U nder the constant stim ulation of h igh concentration EGF , the activity of som e signal p ro teins in EGF signalling transduction system w ill change , w h ich is p robably related to the developm ent of tumo r. .投稿赚钱 KEY WORD S Ep iderm al grow th facto r H epatocytes Signal transduction M ice 表皮生长因子 EGF 属胞外信息物质, 其作 统在生理浓度的 EGF 刺激下可能表现为自适应 用信号通过和靶细胞膜上特异性 EGF 受体结合, 控制作用而正常发挥其调节细胞的生长、存活、增 2 然后激活相应的调节蛋白及酶反应物质, 引起一 殖和分化等功能 。目前许多研究发现肿瘤的发 系列生化过程并产生相应的、丰富多样的生物学 生、发展与 EGF 及其受体有非常密切的关系, 而 效应。前期的研究表明, EGF 信号转导途径并不 且经检测, 癌症病人体内的 EGF 及表皮生长因子 是单条的线形途径, 而是在细胞内传递中构成一 受体 EGFR 含量往往比一般人体内高出许多3 。 个复杂的代谢网络; 网络中各条信号途径之间, 甚 可见, 在高浓度的 EGF 持续刺激下, 该网络系统 至途径上下游之间都存在着多层次的相互交流 中的信号蛋白将会发生一定的改变, 且这些改变 cro sstalk , 从而形成一个网络系统1 。该网络 系 可能与肿瘤的发生、发展有密切关系。本文从细胞 整体 水平的角度出发, 采用双向电泳及放射性同 国家自然科学基金资助项目 . 70071040 及 泸州医 位素标记技术, 并结合相关数据库资源和双向电 N o 学院科研基金资助项目 泳专用分析软件, 分析小鼠肝细胞在高浓度的 .投稿赚钱 644 陕西医 学杂志2005 年 6 月第 34 卷第 6 期 信号持续刺激不同时间, 得到的 信号 EGF EGF E. P 管内 每组各收集一管 并离心 13 200rpm , 蛋白在 EGF 信号转导过程中其磷酸化水平发生 30 , 取上清液按 法试剂盒操作手 m in B io R ad DC 的时间动力学变化, 以确定EGF 相关信号蛋白在 册进行蛋白质定量。 高浓度的 EGF 信号持续刺激下信号途径之间的 3. 4 双向凝胶电泳分离蛋白质及放射自显 相互影响、相互作用和相互制约的关系, 并进一步 影 采用 17cm 的线性 IPG 预制干胶条 pH 3, 探讨这种相互交流对 EGF 信号转导产生的最终 10 , 每根胶条加入样品蛋白总量 150g, 按照 生理效应的影响。 公司的仪器说明书进行第一相固相 B IO RAD pH 材料与方法 梯度等 电聚焦, 总伏时为 800 00 。采用浓度为 V h 1 材 料 10% 的 聚丙烯酰胺凝胶按照 公司 SD S B IO RAD 1. 1 实验动物 昆明种封闭群乳小鼠 泸州 的仪器说明书继续进行第二相 。电泳 SD S PA GE 医学院动物科 。 结束后, 将凝胶置于固定液 50% 甲醛, 10% 冰醋 1. 2 试 剂 培养基及新生小牛血 酸, 40% 蒸馏水 内固定 30 , 按 干胶 DM EM m in B io R ad 清 H yclone 公司 , 无磷培养基 Invitrogen 公 仪 操作手册提供的方法进行干胶, 将干好的胶与 司 , 蛋白质定量的 试剂盒、双向电泳 胶片一起放入暗盒, 在- 70 ?冰箱中曝光 7 。 B io R ad DC X d 所用试剂及电泳仪器均购自 公司, 同 于自动洗片机内冲洗 光胶片可得自显影片。电 B IO RAD X 位素 32P 磷酸二氢钠购自中国北京原子能研究 泳及放射自显影重复两次。 所。 3. 5 自显影图谱分析 采用 2 PDQ uest D 2 主要仪器及设备 二氧化碳培养箱 C 分析鉴定软件分析自显影图谱中磷蛋白的等电点 2323 型, 9800 444 为美国 公司产品, 及分 子量, 将实验所得磷蛋白质点与 B Slshellab Sw iss P ro t - 70 ?超低温冰箱为美国福塔公司产品。检索数 T rEM BL 及 PPDB 等数据库资源中小鼠肝细胞 据库为 蛋白质数据库及 磷蛋白质进行分子量、等电点及磷酸化状态进行 Sw iss P ro t T rEM BL 和自建磷蛋白数据库, 2 分析软 相互比较, 初步确定小鼠肝细胞 信号转导网 PPDB PDQ uest D EGF 件为 公司产品。 络系统的组成成分或效应蛋白酶等相关磷蛋白。 B io R ad 3 方 法 同时, 采用 2 分析软件分析 刺激 PDQ uest D EGF 3. 1 肝细胞的培养 取 1, 3d 乳小鼠的肝 不同时间的蛋白质磷酸化水平的变化, 并绘制出 组织, 采用组织块法培养肝细胞; 大约 6, 7d 肝细 相应的时间动力学曲线。 胞长满瓶底, 传一代除去组织块及其它间质细 结 果 4 1 刺激后的小鼠肝细胞磷蛋白双向电 胞 , 继续培养 4, 5d , 肝细胞再次铺满瓶底。 EGF .投稿赚钱 3. 2 同位素标记及 EGF 刺激 选取细胞长 泳图谱及磷蛋白初步鉴定结果 双向电泳放射自 势相当的肝细胞 18 瓶, 更换为无磷培养基, 二氧 显影图谱显示, 对照组与刺激组磷酸化蛋白点数 化碳培养箱中孵育 30 后, 再更换为用无磷培 目基本相同, 大约有 100 个蛋白点, 丰度较高的蛋 m in 6 32 白点主要集中 在 4, 7 的范围内。经 养基配置的含有浓度为 2. 78 ×10 同位素 pH PDQ uest Bq m l 2 分析, 并 结合 及 P 的培养基, 孵育 8h 。将 18 瓶细胞分为对照组 3 D Sw iss P ro t T rEM BL PPDB 等数据库资源 初步检测到参与 信号转导且 瓶 与刺激组 15 瓶 , 给予刺激组 10 EGF EGF ng l 分别作用 0 、5 、20 、60 和 120 丰度 较高的相关磷蛋白有 8 种, 糖代谢相关蛋白 m in m in m in m in m in 各时间点 3 瓶 , 相应时间后将各组细胞放入液 有 2 种 见表 1 。 氮, 以终止EGF 的作用。 2 小鼠肝细胞 EGF 信号转导相关磷蛋白时 3. 3 肝细胞的裂解及蛋白质的测定 倒尽 间动力学改变 比较刺激组中不同时间点的双向 以上EGF 作用相应时间后的培养液, 每培养瓶加 电泳放射自显影图谱, 与 EGF 信号转导相关且其 5% 葡萄糖液 4 洗一遍, 沥干。各瓶加细胞裂解 磷酸化水平随刺激时间变化有显著意义的有 3 种 m l 液 8 、40 、4% 、 磷蛋白, 分 别是 15、 2、 6 图 1 。 m o l l U rea mm o l L T ris CHA PS Ep s ER K M A PKK 5 400 冰浴 30 。收集裂解液于 L m l B io lyte l m in .投稿赚钱 陕西医学杂志2005 年 6 月第 34 卷第 6 期 645 表 1 初步鉴定小鼠肝细胞 EGF 信 号转导相关磷蛋白 理论 理论MW 实验 实验MW 序号 名称 缩写 Sw iss P ro t p I kD p I kD 信号转导蛋白 1 42567 底物 15 15 4. 48 98. 471 4. 4 96. 7 P EGFR EP s 2 42225 信号转导子 1 5. 42 87. 197 5. 3 85. 2 P STA T 3 07901 热休克蛋白 86 86 4. 93 84. 656 4. 5 82. 6 P H SP 5 20444 蛋白激酶 6. 73 76. 851 6. 7 75. 9 P C PKC 6 27703 细胞外信号调节激酶 2 2 6. 50 41. 275 6. 5 43. 3 P ER K 7 9 1 磷酸酶 3 3 4. 75 42. 407 4. 5 40. 5 Q DBB M A Pk M KP 9 9 8 1433 蛋白 1433 4. 77 27. 955 4. 7 26. 4 Q CQV 10 70236 激酶 6 6 7. 00 37. 432 6. 9 35. 7 P M A PK M A PKK 糖代谢相关蛋白 4 12382 磷酸果糖激酶1 同工酶 6. 62 85. 300 6. 5 83. 7 P B PFK B 8 9 062 糖原合成底物 1 5. 06 37. 27 4. 7 35. 5 Q R Glycogenin 用 2 分析软件对 15、 2、 PDQ uest D Ep s ER K M A P KK 6 等磷蛋白斑点作半定量分析后 刺激组减去 对照组 , 分别获得其相应磷蛋白时间动力学曲 线, 曲线都呈峰型, 6 的曲线高峰在 5 M A PKK m in 图 2 , 而 15、 2 的曲线高峰在 120 Ep s ER K m in 图3, 图4 。 .投稿赚钱 图2 磷酸化 Ep s 15 蛋白时间动力学曲线 图 1 15、 2 和 6 Ep s ER K M A PKK 刺激不同时间磷酸化图谱 图3 磷酸化 ER K2 蛋白时间动力学曲线 .投稿赚钱 646 陕 西医学杂志2005 年 6 月第 34 卷第 6 期 5 , 100 , 这个正反馈环将被激活2 计算 nM m in 机模拟资 料 , 从而使得M A PK ER K 2 表现为持 续活化状态, 本实验正是在高浓度的 EGF 长时间 刺激肝细胞而得到的结果。由此可见, EGF 在生 理浓度下可能表现为自适应控制作用而正常发挥 其调节细胞的生长、存活、增殖和分化等功能, 但 在高浓度长时间刺激下, 由于某些节点蛋白的持 续活化, 如Ep s 15 和ER K 2 等, 从而使得相关的细 胞表现为异常增生。目前研究发现, 肝脏之所以具 图4 磷酸化M A PKK 6 蛋白时间动力学曲线 有很强的再生能力, 原因可能在于部分肝切除的 讨 论 病人, 其体内的EGF 和EGFR 的含量确实比一般 以上实验结果表明, 在细胞整体水平上, 在 3 人高出许 多 , 同时目前大量的实验结果的确也 持续高浓度的 EGF 刺激下, 不同 EGF 信号蛋白 证实了 EGF 及其受体与肿瘤的发生、发展有非常 其磷酸化时间动力学曲线表现不一样,M A PKK 6 5 密切的关 系 。可见, 如果对高浓度的 EGF 长时 的磷酸化时间动力学曲线表现为一定的峰型, 其 间刺激肝细胞而得到的这些持续活化的节点蛋白 最高峰值在 5 , 这与许多相关实验资料是一致 m in 做进一步研 究, 可能会给癌症的预防、治疗提供相 的2, 5 。 15 和 2 的动力学曲线却表现为持 Ep s ER K 关的靶药, 其临床意义尤为重要。 6 续活化状态, 这似乎与某些实验资料相勃 , 但仔 参考文献 细比较发现: 凡 Ep s 15 和 ER K 2 的动力学曲线表 1 代荣阳, 李 洪, 周志远. 细胞信号转导网络的无尺 现为峰型的, 即在 EGF 的持续刺激下, 其活化过 度属性及其意义. 自然杂志, 2004; 5 ?259 程表现为一过性的, 都不是肝细胞内的 EGF 信号 2 罗 波, 郑小莉, 刘秋均, 等. ER K 信号转导途径具 转导, 个别支持 ER K 2 在持续 EGF 刺激下表现为 有自适应控制作用. 泸州医学院学报, 2002; 25 4 ? 持续活化状态的资料正好也是肝细胞7, 8 , 这 说明 275 3 , , . Jankow sk iJ Hopw ood D W o rm sley KG F low cyto 肝细胞内的 EGF 信号转导与其它细胞有所不同。 m etric analysis of grow th regulato ry pep tides and 肝细胞内的Ep s 15 和ER K 2 的动力学曲线表现为 their recep to rs in Barrett’s oesophagus and oe 持续活化状态可能与以下因素有关: ?在 EGF 信 . , sophageal adenocarcinom a Scand J Gastroentero l 号转导途径中, EGFR 是其中一种关键组成部分, 1992; 27 2 ?147 在EGF 刺激下 EGFR 会二聚化而激活, 尽管二聚 4 黄杰安, 唐国都, 丁 虹, 等. 一种简单分离、传代培 .投稿赚钱 化的 EGFR 会内吞导致细胞膜上的 EGFR 数量 养成年小鼠肝细胞的方法. 医学文选, 2001; 20 4 ? 9 417 下调 , 但肝细胞与其它细胞不同的是肝细胞膜 10 5 , , , . 上有大量的EGFR 。因此, 肝细胞膜上的 EGFR T eng KK L ander H Fajardo JE et al v C rk modu 12 的数量可能不会下降很明显, 同时二聚化的 lation of gtow th facto r induced PC cell differentia 2 tion invo lves the Src homo logy dom ain of v C rk and EGFR 的内吞作用又可促进 EGF 与 EGFR 的结 sustained activation of the R as m itogen activated p ro 合, 而 Ep s 15 须与 EGFR 相结合才发挥作用, 即 tein k inade pathw ay. J B io l Chem , 1995; 270 35 ? Ep s 15 的活化对EGFR 的数量具有依赖性。因此 20677 在一定时间内, Ep s 15 表现为持续活化状态。?在 6 , , , . T raverse S Gom ez N Paterson H et al Sustained EGF 信号转导途径中, 通过 EGFR 往下传递主要 activation of the m itogen activated p ro tein M A P k i 有两条相互作用的途径: 途径和 nase cascade m ay be required fo r differentiation of PL C PKC R as 12 . 途径; 这两条途径有两个交叉点: PC cells Comparison of the effects of nerve grow th R af M A PK . , 1999; 激活 ; 磷酸化并激活 2, facto r and ep iderm al grow th facto r B iochem PKC R af M A PK cPLA cPLA 2 又可以激活 PKC , 这样这两条途径之间形 274 7 ?4347 成了一个正反馈环, 当高浓度的 EGF 长期作用 下转第 649 页 .投稿赚钱 陕西医学杂志2005 年 6 月第 34 卷第 6 期 649 致肝脏的机械性损伤, 冷灌注开始前结扎肝总动 围, 以期建立良好的胆管侧支循环。?受体大鼠补 脉, 以最大限度地保证供肝血运和减少供肝热缺 液方法的改进: 大鼠血容量较少, 术中失血 2 m l 血时间。?供肝灌注采用门静脉插管, 以含 12. 便很难存活。肝移植手术创面较大, 创面渗血难 5 肝素的 4 ? 乳酸林格氏液直接灌注, 灌洗 免, 大鼠术中即出现血容量不足和水电解质失衡, U m l C 至肝脏呈淡黄色且无肿胀为宜。本法可以减少供 故操作力求轻柔精细, 以减少出血, 同时, 术中注 肝热缺血时间, 避免供肝内微血栓形成, 保证供肝 意补充液体。以往报道, 均通过大鼠尾静脉、阴茎 的质量。供肝安置袖套管时, 应选用合适口径的套 背静脉、下腔静脉或卵巢静脉输液方法补充体液。 管, 在有一定强度的条件下越薄越好, 并在安装袖 但经下腔静脉或卵巢静脉补液操作时易造成血管 套前, 先将静脉外膜组织剔净, 以免卡在袖套管 的损伤; 尾静脉输液较困难且血凝块容易堵塞。经 内, 使血管内径变小。安装套管时注意血管走向, 阴茎背静脉输液, 需选择雄性大鼠作为受体, 易受 勿使袖套扭转。修理供肝上下腔静脉时, 尽量剪除 实验大鼠性别限制。本实验采用经腹腔腹壁静脉 肝上下腔静脉断端的膈肌组织及腹膜膈肌环, 以 输液, 术中可根据情况多次输注液体, 以维持有效 免术后吻合口狭窄、漏血。?受体肝脏的游离 离 循环血量和电解质酸碱平衡。可缓解高钾、酸中毒 断肝镰状韧带后, 以往的报道是分离结扎左膈下 症状, 又可防止低血糖。该方法操作方便、可靠, 且 静脉, 本实验缝扎数支膈下静脉, 操作简便, 快捷, 不受实验大鼠性别限制, 为手术的成功提供了有 不仅能够避免分离结扎所致出血, 同时可避免肝 力的保障。 上下腔静脉吻合口的渗血。解剖第一肝门, 分离、 参考文献 结扎肝固有动脉时, 注意辨认和避免损伤肝总动 1 梁雨荣, 何尔斯泰. 三袖套法大鼠原位肝移植术后近 脉和胃十二指肠动脉, 以利于受者术后胃肠道和 期并发症及死因分析. 中华器官移植杂志, 2000; 21 胰腺功能的恢复。?受体手术: 在受体肝切除前, 2 ?81 2 严 佶祺, 蔡伟耀, 张明钧, 等. 大鼠肝移植并发症的预 经门静脉穿刺推注生理盐水以驱出肝脏内血液至 防. 上海第二医科大学学报, 1999; 19 ?412 大循环, 其意义相当于自体血回输, 增加手术耐受 3 Kam ada N , Calne R Y. A surgical experience w ith five 性。肝上、下腔静脉、门静脉吻合均以含肝素 12. hundred th irty liver transp lantation in the rat. 5 常温生理盐水溶液冲洗静脉腔排尽气泡, U m l Surgery, 1983; 93 ?64 并在水浴中完成, 能够冲洗出供肝中冷灌注液和 4 Kam ada N , Calne R Y. O rtho top ic liver transp lanta 代谢产物, 排尽气泡, 有效地阻止气体进入血循环 tion in the rat: technique using cuff fo r po rtal vain 引起空气栓塞, 减轻供肝冷缺血产生的代谢产 物 . , anastomo sis and biliary drinage T ransp lantation 对受体大鼠的损害。此外血管袖套吻合时, 除注意 1979; 28 ?47 .投稿赚钱 勿扭曲或成角外, 且不要套入过深以防套管堵塞 5 杭燕南, 庄心良, 蒋 豪, 等. 当代麻醉学. 上海: 上海 右肾静脉或脾静脉。胆管重建时, 除避免发生扭 科学技术出版社, 2002 ?785, 786 收稿: 20041102 转、损伤胆管壁外, 以大网膜覆盖于胆管套管周 上接第 646 页 9 H augh JM , L auffenburger DA J. A nalysis of recep to r 7 , , , . internalization as a m echanism fo r modulating signal Kelly L Jong Sung P P rem S et al P ro longed acti transduction. T heo r B io l , 1998; 195 2 ?187 vation of the m itogen activated p ro tein k inase pathw ay p romo tes DNA synthesis in p rim ary hepatocytes from 10 O ’Keefe E , Ho llenberg M D , Cuatrecasas P. Ep ider 21 1 1 , m al grow th facto r. characteristics of specific binding p C ip WA F null m ice but no t in hepatocytes 16 4 . , 1998; 336 ?551 in m em branes from liver, p lacenta , and o ther target from p IN K a null m ice B iochem . , 1974; 164 2 ?518 8 Bhaalla U S, Iyengat R. Em ergent p roperties of net tissues A rch B iochem B iophys . , w o rk s of bio logical signaling pathw ays Science 1999; 283 ?381 收稿: 20041101