ERK调节的神经元凋亡作用脑缺血神经元凋亡机制的新观...

ERK调节的神经元凋亡作用脑缺血神经元凋亡机制的新观... ERK调节的神经元凋亡作用—脑缺血神经元凋亡机制的新观点 曹阳 广州市红十字会医院麻醉科 510220 通常认为，细胞外信号调节激酶(ERK1和ERK2，缩写为ERK1/2)在有丝分裂原激活蛋白酶(MAPKs)家族中属于促进细胞存活类因子，发挥调节增殖和分化的作用(Oncogene.2004;23:2838–2849; Science.2002;298: 1911–1912)。然而德国海德堡大学神经科学研究中心的Subramaniam和他的同事(J.Cell Biol. 2004;165, 357–369)最新研究结果明，在钾离子外流诱导下，ERK1/2也可以发挥促进神经元凋亡的重要作用(proapoptosis)。该研究提出了一个由ERK1/2介导的神经元死亡的新观点。同时也进一步开启了通过调控ERK1/2活性进而调节缺血后神经元的存活的可能机制。 我们前期的研究工作也发现了一些类似的证据，在我们的缺血再灌注脑损伤研究中，抑制ERK1/2的活性，产生了抑制神经元凋亡的作用，提示ERK1/2在某些特定的条件下，可以发挥促凋亡因子的作用，即并非传统意义上的单纯促进存活因子。 我们比较了小鼠中脑动脉梗塞模型(MCAO)中ERK1/2的活性以及炎症因子IL-1β、TNFα、MCP-1的表达变化，探讨脑缺血损伤对ERK1/2活性变化和炎症因子表达的影响;进而我们观察应用ERK1/2抑制剂(U0126)预处理对小鼠MCAO后IL-1β、TNFα、MCP-1表达的变化，观察MAKP通路ERK1/2水平的抑制是否影响脑损伤所致炎症反应的影响;上述试验也证实，在试验条件下，脑损伤后ERK1/2的激活和炎症因子的表达相关联，而抑制了ERK1/2的活性可以控制炎症因子的产生进而是抑制神经元的过度凋亡。许多研究也报道，脑缺血后MAPKs被激活，在小鼠脑MCAO后磷酸化的ERK1/2，P38MAPK，JUN的表达增加，并且伴随炎症因子IL-1β的增加，抑制ERK1/2通路可以抑制炎症因子的表达，用PD98059抑制MEK的激活减少了小鼠局灶性脑缺血后的梗塞体积和减轻神经损害的程度，从而改善病理性损害的程度(Brain Res.2004;16,996(1):55-66;Chin Med Sci J.2004 Dec;19(4):270-5;Chin Med J (Engl). )。 2003;116(10):1497-503 作为传统生长信号通路—ERK1/2信号通路在组织损伤后的激活有何意义，而抑制ERK1/2通路产生的抑制凋亡等损伤保护作用的机制又如何,上述问题直接影响对脑缺血病程干预手段的选择，逐步阐明该机制对我们理解脑缺血损伤的病理过程非常有意义。 大量外来刺激，使MAPKs将信号从细胞膜转导到细胞核内(J. Cereb. Blood Flow )。MAPKs是丝氨酸—Metab. 2002;22:631–647;Bioessays. 2003;25:1085–1095 苏氨酸激酶。当它被激活时，就将特定的底物磷酸化，如磷脂酶、转录因子和细胞结构蛋白等。通过这一途径，被激活的蛋白质发挥一系列生理作用，如基因表达、有丝分裂、增生、移动、新陈代谢和凋亡(Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2004;68:320–344)。 目前的研究认为，MAPK家族包括五个组，分别是:(i)ERK1和ERK2;(ii)c-Jun NH2-末端激酶1，2和3(JNK1，JNK2，JNK3);(iii)p38MAPKsα，β，γ和δ;(iv)ERK3和ERK4;(V)ERK5。每个家族的成员都是通过一条连续激活的酶链来活化的:MAPKK激酶(MAPKKKs)，MAPK激酶(MAPKKs)，以及MAPKs。MAPKKKs在外部刺激下与Ras和Rho家族的三磷酸鸟苷(GTP)结合蛋白相互作用后被激活(磷酸化)。为活化ERK1/2，细胞膜表面的受体如酪氨酸激酶(Trks)或G蛋白(鸟嘌呤核苷结合蛋白三聚体)偶联受体作为中间者通过不同的GTP结合蛋白如RAS把激活的信号传递给Raf-Mek-ERK瀑布。激活的Raf(一个MAPKKK)结合体和磷酸化的MEK1或MEK2(即MAPKKS)进而将ERK1/2磷酸化。然后活化的ERK1/2再将其他各种各样的底物，包括细胞膜蛋白、核蛋白、转录因子以及几种MAPK激活蛋白激酶(MKs)等磷酸化(活化)(Science.2002;296:1648–1649) 传统观点认为ERK1/2是为了相应增殖或存活刺激而被激活的，即增殖或存活因子。而JNK和p38MAPK激酶则与应激反应有关，如细胞因子刺激、DNA损伤和氧化应激(Oncogene.2004;23:2838–2849; Science.2002;298:1911–1912; Microbiol. Mol. )。活化的JNK可以促使线粒体释放凋亡因子如细胞色素cBiol. Rev. 2004; 68:320–344 和SMAC(也叫做Diablo)。p38MAPK激酶在正常免疫和炎症反应中发挥重要作用，它们通过大量增加促凋亡(proapoptotic)蛋白如Bax和抑制存活蛋白信号途径来促进凋亡(Science.2000;288:870–874;Mol. Cell. Biol. 2002;22:4929–4942; Free Radic. Biol. )。 Med. 2001;30:213–221 ERK1/2在通常情况下是存活因子，它在生长因子的作用下活化并调节增殖、分化、长时程记忆和突触的可塑性(Curr. Opin. Neurobiol. 2004;14:311–317)。用NGF处理的PC12细胞分化成类交感神经元，阻止ERK1/2的激活就抑制了神经突形成，该过程依赖ERK1/2的长程激活。ERK1/2在类似的细胞系中也发挥促进生长作用。用EGF处理PC12后可促进其增殖，这个过程需要ERK1/2的瞬时激活(Cell.1995;80, 179–185)。与ERK1/2的抗凋亡作用一致，当生长因子丧失和应用细胞毒性物质时，ERK1/2活化就抑制凋亡(Science.1995;270:1326–1331)。 然而，最近对ERK1/2途径所做的研究向ERK1/2仅是一个存活因子这个观点提出了挑战，因为ERK1/2被认为涉及参与了神经退化(Eur. J. Biochem. 2004;271:2060–2066)。例如，在帕金森疾病中，ERK1/2在6-羟基多巴胺毒素复制后被激活。此时，由于MEK的抑制剂PD98059的存在，抑制了ERK1/2的活化，使细胞死亡减少。与ERK1/2促凋亡功能相一致的是，由MEK抑制剂引起的ERK1/2活化抑制可使局部脑组织免于缺血损害(Proc. Natl. Sci. U.S.A.1999;96:12866–12869;Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A. )。ERK1/2也会在患有阿尔默茨病(AD)的病人和高表达β-淀粉2001;98:11569–11574 的AD模型小鼠的神经变性中被活化(Brain Res. Mol. Brain Res. 2002;109:45–55;J. )。但我们对ERK1/2怎样导致神经细胞死亡的机制还知之Neurosci.2002;21:4125–4133 甚少。 Subramanianm及其同事的研究认为，缺乏caspase-3的质膜损害可以使ERK1/2激活后产生促进神经元退化作用(J. Cell Biol. 2004;165:357–369)。该研究小组曾经报导，MEK抑制剂U0126对ERK1/2的抑制不会促进凋亡，相反却可以保护神经元抵抗由钾离子外流引起的细胞死亡。有关低浓度的钾离子(5mmol/L)介导的凋亡机制与发生在由神经营养因子缺乏导致的神经元死亡的机制很相似(Natl. Acad. Sci. U.S.A. )。在钾离子外流后观察活化ERK1/2 6小时，增加的活性可被1993;90:10989–10993 U0126完全抑制，进一步研究揭示了钾离子外流条件下ERK1/2介导的细胞死亡的机制。实验中用碘化钾来标记质膜的完整性时发现钾离子的外流引起了质膜的损害。抑制剂U0126可防止质膜的崩溃和核的浓缩，并可短暂地防止DNA退化，相反，抑制促凋亡作用的 p38激酶途径并不能提供有效的保护。这些实验揭示了在由钾离子外流诱导的神经细胞死亡中，ERK1/2扮演了明确的促凋亡作用角色。令人疑惑的是，抑制caspase-3并不能延迟ERK引起的质膜损害和DNA的退化，提示ERK1/2介导的细胞凋亡是在缺乏caspase-3时发生的。 综上所述,在某些特定条件下，ERK1/2可通过质膜完整性的缺失来诱导细胞死亡，而这个途径与caspase瀑布是截然不同的。 上述研究提出了一个新的问题，ERK1/2活化是怎样产生如此多样的细胞反应谱，从增生到分化再到凋亡。有些差异可能取决于细胞的类型以及细胞的发展成熟阶段。然而，ERK1/2活化的持续时间似乎也能影响ERK1/2的作用结果。在PC12个细胞中，通过NGF来延长ERK1/2的活化时间(从1.5小时到3小时)会增强分化，而通过EGF使ERK1/2 的活化时间变得较短(少于1小时)则会促进增生(Cell.1995;80:179–185)。而导致神经元死亡的ERK1/2活化时间则比上述的任何一个时程长得多(至少要24小时)(J. Biol. )，ERK1/2长程活化的结果使转录因子的不同部位或者是下Chem. 2003;278: 8904–8912 游的不同目标被活化从而产生多种结果。例如，位于ERK1/2下游的转录因子Fos，在EGF介导的增生时是不稳定的，然而它在NGF介导的分化时却变得稳定了(Nat. Cell Biol. )。 2002;4:556–564 对用NGF或EGF处理过的PC12细胞进行的研究也揭示了ERK1/2的不同调节水平。EGF刺激后活化的ERK短暂地出现在细胞质中，而NGF刺激后活化的ERK1/2主要在细胞核中(Bioessays.2003;25:1085–1095)。因而活化的ERK1/2的不同亚细胞定位将活化下游的不同底物，这些底物控制了细胞反应的类型(Mol. Cell. Biol. 1999;19:2435–2444)。 +前面提及的另一个重要的发现是，在K外流细胞中由ERK1/2介导的质膜损害和核固缩不需要caspase-3的参与。因为线粒体常常在凋亡中发挥很重要的作用，所以线粒体是否参与了由ERK1/2引起的质膜损害和核固缩显得非常重要。在缺乏caspase-3的情况下很多促凋亡因子能够调节凋亡。如凋亡诱导因子(AIF)是一个关键的缺乏caspase情况下的线粒体凋亡因子，在缺乏caspase作用的情况下AIF能引起神经元的死亡(Oncogene. )。因而活化ERK1/2后观察到的核固缩可能与AIF有关。另一个凋2004;23:2785–2796 亡因子是核酸内切酶G(Endo G)，人们认为它与AIF相互作用，在缺乏线粒体caspases时引起细胞死亡、核固缩，尤其是DNA降解(Science. 2002;298:1587–1592)。然而， +我们尚不知道AIF或Endo G在K外流引起的神经细胞死亡中所起的作用，或者它们与ERK1/2途径之间的联系。与前面的发现相反的是，人们报道活化的ERK1/2能抑制caspase-9的活性，进而抑制caspase-3，从而抑制凋亡(Nat. Cell Biol. +)。为了解释这个疑点，了解ERK抑制caspase-9是否也发生在由K外2003;5:647–654 流引起的凋亡过程中将很有意义，在这个凋亡模型中，细胞色素c可能并没有从线粒体中释放出来，因此caspase-9与凋亡的完成并无关系。 通过不同的调节水平和不同的作用底物，ERK1/2可以成为一个靶位。通过增加ERK1/2在增生和分化中的作用，同时抑制它的促凋亡作用，ERK1/2可能抑制细胞死亡并同时促进再生。进一步确定那些在上述过程中起中间作用的下游因子的不同，以及阐明ERK1/2调节的精确控制，将帮助我们制定这样一个策略。