蛋白质提取

蛋白质提取 蛋白质的分离纯化 （一）材料 1、选材 2、破碎 3、混合物的分离 （二）粗分级 （三）细分级 （四）结晶 蛋白质的分离方法 根据蛋白质的溶解度差异分离 —沉淀技术 根据蛋白质分子大小的差异分离 根据蛋白质的荷电差异分离 根据蛋白质与某些物质的吸附差异—吸附分离 利用生物分子专一性结合的特性—亲和层析 蛋白质的分离方法 可逆沉淀：等电点沉淀、盐析法、有机溶剂沉淀 不可逆沉淀：热变性沉淀、重金属盐沉淀、有机酸沉淀 透析——只用于除盐类和小分子杂质 透析——只用于除盐类和小分子杂质 超过滤——除小分子杂质，分离、浓缩蛋白质 凝胶层析又叫分子筛层析。 分子筛是具有三维空间网状结构的物质，有天然的，也可人工合成。根据网孔不同可制成不 同规格。 具备条件：1惰性，2水不溶性，3能高度水化。 常用分子筛： 葡聚糖凝胶（Sephadex） 型号：G200、 G150、 G100、 G75、 G50、 G25、 G15 分离大蛋白质、小蛋白质，除盐 琼脂糖凝胶（瑞典Sepharose、美国Bio-GelA） 孔径大，用于分离大分子物质 聚丙烯酰胺凝胶（ Bio-GelP） 原理： 1、分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部，随洗脱液从凝胶粒子之间的空隙挤落下来， 所以大分子物质迁移速度快； 2、小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶粒子内部，所以小分子物质迁移速度慢。 电泳法 类型：1、区带电泳 纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、粉末电泳、细丝电泳、凝胶电泳。 凝胶电泳包括：琼脂糖凝胶、淀粉凝胶、硅胶凝胶、聚丙烯酰胺凝胶。 聚丙烯酰胺凝胶包括：垂直板电泳、盘状电泳、等电聚焦电泳、梯度电泳、免疫电 泳。 2、自由界面电泳：支持物为溶液，很少用。 垂直板电泳 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳 蛋白质在电场中的迁移率取决于它所带的净电荷以及分子大小和形状等因素。 加入SDS（十二烷基磺酸钠）和少量巯基乙醇，则蛋白质分子的迁移率主要取决于它的分 子量，而与原来所带电荷、分子形状无关。 SDS是变性剂，它能破裂蛋白质分子中的氢键和疏水作用。巯基乙醇打开二硫键，因此使 蛋白质分子处于伸展状态。此时SDS以其烃链与蛋白质分子的侧链结合成复合物，大约每 两个氨基酸残基结合一个SDS分子。 导致： 1、由于SDS是阴离子，使多肽表面覆盖的负电荷远远超过蛋白质分子原有的电荷量，消除 了原来的电荷差异。 2、改变了蛋白质单体分子的构象，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都相同，长轴长度随其分子量的大小成正比变化。 由于不同蛋白质的SDS复合物具有相同的荷质 比，并具有相似的构象，因而有如下公式： lgM=K1—K2μR （K1、K2为常数，μR为相对迁移率） 实际测定时，以几种单体蛋白质分子量的对数值对其μR作图，根据样品的μR值， 从标准曲线上就可查出其分子量。 等电聚焦（Isoelectric focusing） (1)以不同蛋白质的等电点的差异分离。 (2)凝胶中含有蛋白质样品和载体两性电解质。 (3)载体两性电解质： a 是一系列物质的混合物。此混合物各组分的等电点要互不相同，但又不能相差太大（小数 点后2位）；最常用为3.0-10.0范围，还有3.0-7.0、5.0-10.0。 b 混合物中各物质在等电点时要有足够大的电导，以保证能顺序排列； c 混合物中各物质在等电点时要有足够大的缓冲能力，构成组分为多氨基、多羧基的脂肪族 化合物； d 要求各组分分子量要小，易于与蛋白质分离。 通电后，在介质中由于H+与OH-的相向移动，形成了从3.0-10.0的一系列pH梯度。当载体两性电解质移动到各自的等电点时，就停止移动，不带电荷，并维持pH梯度（电导、缓冲能力）。 即：pH梯度由H+与OH-建立，而由载体两性电解质来维持。当蛋白质移动到相应的pH值 处，结束。 注意事项：1、时间相对长对分离有利； 2、也可用来测定蛋白质的等电点。 离子交换层析 可分为阳离子交换---与阴离子交换---。 1、树脂类：分离氨基酸，孔径小； 2、纤维素类：分离蛋白质，孔径大。 , 通过改变盐浓度，辅助改变pH值进行梯度洗脱 吸附本质：非共价连接 常用吸附剂：结晶磷酸钙、硅胶 脱附方式：1、改变蛋白质带电状态； 2、改变环境溶液的pH、离子强度等。 小 结 粗分级一般采用盐析、等电点沉淀、有机溶剂分级等方法； 细分级一般采用层析法，包括凝胶层析、离子交换层析、吸附层析、亲和层析等方法。必要 时，还可采用电泳法，包括等电聚焦等作为蛋白质的提纯步骤。 各种细分级的方法都可以用于纯度鉴定 常用各种电泳法，比较权威的有：等速电泳、梯度电泳、等电聚焦电泳、聚丙烯酰胺凝胶电 泳。 沉降分析和扩散分析 测定沉降系数和扩散系数。 溶解度恒定法 加入样品量为横坐标，样品溶解量为纵坐标，作图。如只有一个拐点则说明样品纯 最小分子量测定法 如Mb含Fe为0.335%，则 M=55.8/0.335%=16700。这就是最小分子量。 其实，真实分子量是最小分子量的n倍，n指Fe的数目，Mb的n=1，所以M=16700；而Hb用其他方法测得分子量为68000，则说Hb含4个Fe原子。 渗透压法 超离心法 凝胶过滤法 经验公式：lgM=K1-K2Ve（ K1、K2为常数） 用几种已知蛋白质，测其Ve，再对lgM作图得标准曲线。再测定未知蛋白质的Ve，可 得M。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 lgM=K1—K2μR （K1、K2为常数，μR为相对迁移率） 凯氏定氮法 Folin-酚试剂反应 紫外吸收法 考马斯亮蓝法 双缩脲反应 一、样品的浓缩 生物大分子在制备过程中由于过柱纯化而样品变得很稀，为了保存和鉴定的目的，往往 需要进行浓缩。常用的浓缩方法的： 1. 减压加温蒸发浓缩 通过降低液面压力使液体沸点降低，减压的真空度愈高，液体沸点降得愈低，蒸发愈快，此 法适用于一些不耐热的生物大分子的浓缩。 2. 空气流动蒸发浓缩 空气的流动可使液体加速蒸发,铺成薄层的溶液，表面不 断通过空气流；或将生物大分子溶液装入透析袋内置于冷室，用电扇对准吹风，使透过膜外 的溶剂不沁蒸发，而达到浓缩目的，此法浓缩速度慢，不适于大量溶液的浓缩。 3. 冰冻法 生物大分子在低温结成冰，盐类及生物大分子不进入冰内而留在液 相中，操作时先将待浓缩的溶液冷却使之变成固体，然后缓慢地融解，利用溶剂与溶质融点 介点的差别而达到除去大部分溶剂的目的。如蛋白质和酶的盐溶液用此法浓缩时，不含蛋白 质和酶的纯冰结晶浮于液面，蛋白质和酶则集中于下层溶液中，移去上层冰块，可得蛋白质 和酶的浓缩液。 4. 吸收法 通过吸收剂直接收除去溶液中溶液分子使之浓缩。所用的吸收剂必 需与溶液不起化学反应，对生物大分子不吸附，易与溶液分开。常用的吸收剂有聚乙二醇， 聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝胶等，使用聚乙二醇吸收剂时，先将生物大分子溶液装入半透膜的 袋里，外加聚乙二醇复盖置于4度下，袋内溶剂渗出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被 水饱和后要更换新的直至达到所需要的体积。 5. 超滤法 超滤法是使用一种特别的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过 滤的方法，不液体在一定压力下（氮气压或真空泵压）通过膜时，溶剂和小分子透过，大分 子受阻保留，这是近年来发展起来的新方法，最适于生物大分子尤其是蛋白质和酶的浓缩或 脱盐，并具有成本低，操作方便，条件温和，能较好地保持生物大分子的活性，回收率高等 优点。应用超滤法关键在于膜的选择，不同类型和规格的膜，水的流速，分子量截止值（即 大体上能被膜保留分子最小分子量值）等参数均不同，必须根据工作需要来选用。另外，超 滤装置形式，溶质成份及性质、溶液浓度等都对超滤效果的一定影响。Diaflo 超滤膜的分 子量截留值 膜名称 分子量截留值 孔的大的平均直径 XM －300 300，000 140 XM－200 100，000 55 XM－50 50，000 30 PM－30 30，000 22 UM－20 20，000 18 PM－10 10，000 15 UM－2 1，000 12 UM05 500 10 用上面的超滤膜制成空心的纤维管，将很多根这样的管拢成一束，管的两端与低离子强 度的缓冲液相连，使缓冲液不断地在管中流动。然后将纤维管浸入待透析的蛋白质溶液中。 当缓冲液流过纤维管时，则小分子很易透过膜而扩散，大分子则不能。这就是纤维过滤秀析 法，由于透析面积增大，因而使透析时间缩短10倍。 二、干燥 生物大分子制备得到产品，为防止变质，易于保存，常需要干燥处理，最常用的方法 是冷冻干燥和真空干燥。真空干燥适用于不耐高温，易于氧化物质的干燥和保存，整个装置 包括干燥器、冷凝器及真空干燥原理外，同时增加了温度因素。在相同压力下，水蒸汽压随 温度下降而下降，故在低温低压下，冰很易升华为气体。操作时一般先将待干燥的液体冷冻 到冰点以下使之变成固体，然后在低温低压下将溶剂变成气体而除去。此法干后的产品具有 疏松、溶解度好、保持天然结构等优点，适用于各类生物大分子的干燥保存。 三、贮存 生物大分子的稳定性与保存方法的很大关系。干燥的制品一般比较稳定，在低温情况 下其活性可在数日甚至数年无明显变化，贮藏要求简单，只要将干燥的样品置于干燥器内（内 装有干燥剂）密封，保持0－4度冰箱即可，液态贮藏时应注意以下几点。 6. 样品不能太稀，必须浓缩到一定浓度才能封装贮藏，样品太稀易使生物大分 子变性。 7. 一般需加入防腐剂和稳定剂，常用的防腐剂有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚 等。蛋白质和酶常用的稳定剂有硫酸铵糊、蔗糖、甘油等，如酶也可加入底物和辅酶以提高 其稳定性。此外，钙、锌、硼酸等溶液对某些酶也有一定保护作用。核酸大分子一般保存在 氯化钠或柠檬酸钠的标准缓冲液中。 8. 贮藏温度要求低，大多数在0度左右冰箱保存，有的则要求更低，应视不同 物质而定。