未培养微生物论文：未培养微生物 宏基因组 6-磷酸-β-葡萄糖苷酶 酶学性质 定点突变

未培养微生物：未培养微生物 宏基因组 6-磷酸-β-葡萄糖苷酶 酶学性质 定点突变 未培养微生物论文:未培养微生物 宏基因组 6-磷酸-β-葡萄糖苷酶 酶学性质 定点突变 【中文摘要】现今,由于世界范围内人口爆发、能源枯竭、环境恶化,寻找可再生资源已成为世界各国迫在眉睫的课题。天然纤维素因其可再生、产量高、环境友好,被认为是解决粮食和能源短缺以及环境污染等问题的希望所在。目前,纤维素的微生物降解问题得到了越来越多的关注,但是国内外报道的纤维素酶均存在酶活性低、种类相对较少等问题,因此寻找和开发高活性、广底物以及适应极端环境的新型纤维素酶已成为纤维素酶开发和利用的首要问题。纤维素酶系中,β-葡萄糖苷酶用于水解纤维二糖和短链纤维素寡糖生成葡萄糖,是纤维素彻底降解的关键酶,因此开发研究新型高效的p-葡萄糖苷酶对于整个纤维素酶产业都具有十分重要的意义。自然界中微生物种类繁多,但其中只有1-10%被人们所认识,开发利用明显不足。目前,国际上对微生物的研究已进入分子和基因水平,建立了一系列诸如宏基因组学的新研究途径。宏基因组学是指以环境中微生物群体基因组为研究对象,以功能基因筛选和测序分析为研究手段,以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性以及与环境之间关系为研究目标的微生物研究方法。本研究基于造纸黑液废水中存在的大量纤维素降解微生物以及β-葡萄糖苷酶的重要价值,采用宏基因组学研究手段,构建造纸黑液废水菌群的宏基因组文库,成功筛选得到一个新型的6-磷酸-β-葡萄糖苷酶基因,并对该酶进行克隆、达、纯化以及酶学性质 研究。本论文主要研究内容如下:一、造纸黑液废水菌群宏基因组文库的构建和筛选本研究从造纸黑液废水中提取微生物群体基因组DNA,然后送至华大基因公司构建宏基因组文库。文库DNA片段大小为6.0-8.0 kb,载体为pUC118,宿主为Escherichia coli DH5b。然后利用β-葡萄糖苷酶活性检测平板,从宏基因组文库中筛选得到一个6-磷酸-β-葡萄糖苷酶基因,编号为pbgl25-217,全长为1428bp。其编码的6-磷酸-p-葡萄糖苷酶Pbg125-217共含有476个氨基酸,预计分子量(MW)为54798.73 Da,等电点(pI)为5.14,是一种亲水性蛋白质。目前有关6-磷酸-p-葡萄糖苷酶的研究较少,且Pbg125-217与已报道6-磷酸-p-葡萄糖苷酶的氨基酸序列同源性较低,因此对pbg125-217进行研究存在较高的理论价值。二、6-磷酸-p-葡萄糖苷酶基因Pbg125-217的克隆与表达本研究从原始菌株25-217的质粒DNA上克隆得到6-磷酸-p-葡萄糖苷酶基因Pbg125-217,并插入到表达载体pETDuet-1中,得到重组质粒pbgl25-217-pETDuet。然后将重组质粒pbgl25-217-pETDuet转入表达宿主Escherichia coli Rosetta,最终成功异源表达出有活性的6-磷酸-β-葡萄糖苷酶Pbg125-217。三、6-磷酸-β-葡萄糖苷酶Pbg125-217的纯化与酶学性质研究本研究利用菌株E.coli Rosetta (pbg125-217-pETDuet)诱导表达Pbg125-217,并使用亲和层析和阴离子交换层析技术纯化得到较高纯度的Pbg125-217。初步研究Pbg125-217的基本酶学性质,发现该酶最适温度为37?,最适pH为7。该酶在低温下能保持较高的稳定性,随着温度升高其稳定性逐渐减弱;在pH 8时稳定性最高,pH 5-9时也能保 持较高的稳定性。金属离子Ca2+、Mg2+、Mn2+对该酶活性基本没有 影响;Ni2+、Fe2+对该酶活性有部分抑制作用;Zn2+、Cu2+、Fe3+ 对该酶活性则有很强的抑制作用。该酶Km值为4.80 mM, Vmax值为 5187.04U?mg1。四、6-磷酸-p-葡萄糖苷酶Pbg125-217的定点突变 研究本研究以6-磷酸-β-葡萄糖苷酶基因Pbgl25-217为进行定 点突变,并诱导表达得到E179A、E372A、Y311F、W420F、S427A、S427C、 S427D、S427E、K435L、Y437F等10种突变蛋白。与Pbg125-217相 比,S427A、S427C酶活性基本未改变;W420F、S427D、S427E、Y437F 酶活性降低很多;E179A、E372A、Y311F、K435L则完全丧失酶活性。 【英文摘要】Nowadays, with problem of population explosion, energy exhaustion and environmental degradation, searching for renewable resources has become an urgent issue around the world. Natural cellulose is considered to be the hope to solve problems of food, energy and environment. At present, cellulose microbial degradation has earned much more attention. However, cellulase which have been reported have common weakness of low activity and few species. Therefore, searching and developing novel cellulase with features of high activity, broad substrate and adaptability to extreme environment has been the most important issue. In the cellulase system, P-glucosidase which is used for hydrolysis cellobiose and short chain cellulose oligosaccharides, is the key enzyme in the complete degradation of cellulose. Therefore, development of novel and efficient P-glucosidase has great significance for the whole industry.There is a wide range of microorganism in nature, but only 1-10%of them have been known. At the present, research of microorganisms has entered in the molecular and genetic period, and a series approaches have been established, such as metagenomics. Metagenomics is a research method for microbial diversity, population structure, evolutionary relationship, functional activity and relation with the environment.This research is based on a large number of cellulose-degrading microorganisms in black liquor and the significant value ofβ-glucosidase. We constructed the library of genomic DNA isolated directly from black liquor, and got a novel 6-phospho-p-glucosidase gene. Then the putative 6-phospho-β-glucosidase was overexpressed and purified for characterization.The main contents of this research are as follows:1. Construction and screening of the metagenomic library from black liquorIn this study, to construct library, metagenomic DNA was directly isolated from black liquor. Transformation of Escherichia coli DH5b resulted in the metagenomic library with a average insert size of 6.0-8.0 kb by using the pUC118 vector. The library was screened forβ -glucosidase activity, and one clone showed high 6-phospho-β-glucosidase activity. The 6-phospho-β-glucosidase gene pbg125-217 has a length of 1428 bp, it encodes 6-phospho-β -glucosidase Pbg125-217, which contains 476 amino acids. The enzyme is a hydrophilic protein, its molecular weight (MW) and isoelectric point (pI) is 54798.73 Da and 5.14. Currently, there are few studies about 6-phospho-β-glucosidase, and amino acid sequence of Pbg125-217 has low homology with those reported 6-phospho-β-glucosidase. Therefore, the research of Pbg125-217 has theoretical value.2. Cloning and expression of 6-phospho-β-glucosidase gene pbgl25-217In this study,6-phospho-β-glucosidase gene pbg125-217 was cloned and inserted into pETDuet-1 vertor. Then transformation of Escherichia coli Rosetta resulted in the recombinant plasmid pbg125-217-pETDuet. Ultimately, heterologous 6-phospho-β -glucosidase Pbg125-217 was expressed successfully.3. Purification and characterization of 6-phospho-p-glucosidase Pbg125-217In this study, Pbg125-217 was purified by affinity chromatography and anion exchange chromatography. Optimal conditions for the enzyme activity of Pbg125-217 were 37?and pH 7, and stable conditions for the enzyme activity of Pbgl25-217 were<20?and pH 5-9. Ca2+, Mg2+, Mn2+stabilized the activity of Pbg125-217, and Ni2+, Fe2+, Zn2+, Cu2+, Fe3+inhibited the activity of Pbgl25-217. The Km and Vmax value of Pbg125-217 were 4.80 mM and 5187.04 U?mg-1.4. Site-directed mutagenesis of 6-phospho-β-glucosidase Pbgl25-217In this study, base changes effected by site-directed mutagenesis were confirmed by sequence analysis. There are ten mutant forms of Pbgl25-217, S427A, S427C contained measurable activity of 6-phospho-β-glucosidase; W420F, S427D, S427E, Y437F contained partial activity; and E179A, E372A, Y311F, K435L contained no activity. 【关键词】未培养微生物 宏基因组 6-磷酸-β-葡萄糖苷酶 酶 学性质 定点突变 【采买全文】 1.3.9.9.38.8.4.8 1.3.8.1.13.7.2.1 同时提供论文写作定制和论文发表服务.保过包发. 【说明】本文仅为中国学术文献总库合作提供，无涉版权。作者如有异议请与总库或学校联系。 【英文关键词】uncultured microorganism metagenome 6-phospho-β-glucosidase enzyme properties site-directed mutagenesis 【目录】6-磷酸-β-葡萄糖苷酶Pbgl25-217的克隆、表达与酶 学性质研究 摘要 7-9 Abstract 9-10 第一章 绪论 12-24 1.1 未培养微生物的研究现状与发展前景 13-14 1.1.1 未培养微生物的研究现状 13-14 1.1.2 未培养微生物的发展前景 14 1.2 宏基因组学的研究进展及其应用 14-16 1.2.1 宏基因组学的概念 14-15 1.2.2 宏基因组学的研究方法 15 1.2.3 宏基因组学的应用 15-16 1.3 纤维素酶简介 16-18 1.3.1 纤维素酶的组成 16-17 1.3.2 纤维素酶的降解机理 17 1.3.3 纤维素酶的产生菌株 17-18 1.4 β-葡萄糖苷酶概述 18-21 1.4.1 β-葡萄糖苷酶的理化性质 18-19 1.4.2 β-葡萄糖苷酶的催化机制 19 1.4.3 β-葡萄糖苷酶的酶活测定方法 19-20 1.4.4 β-葡萄糖苷酶的应用 20-21 1.5 6-磷酸-β-葡萄糖苷酶简介 21 1.6 本论文的目的及意义 21-24 第二章 造纸黑液废水菌群宏基因组文库的构建和筛选 24-36 2.1 材料与方法 24-27 2.1.1 造纸黑液废水样品 24 2.1.2 菌株及质粒 24-25 2.1.3 培养基和缓冲液 25 2.1.4 主要仪器及生化试剂 25-26 2.1.5 造纸黑液废水菌群基因组总DNA的大量提取 26 2.1.6 造纸黑液废水菌群宏基因组文库的构建与筛选 26-27 2.2 结果与分析 27-34 2.2.1 造纸黑液废水菌群基因组总DNA的提取 27-28 2.2.2 β-葡萄糖苷酶基因的筛选 28-29 2.2.3 菌株25-217基因片段序列分析 29-34 2.3 本章小结 34-36 第三章 6-磷酸-β-葡萄糖苷酶基因pbgl25-217的克隆与表达 36-48 3.1 材料与方法 36-41 3.1.1 菌株和质粒 36-37 3.1.2 培养基和缓冲液 37 3.1.3 主要仪器 及生化试剂 37 3.1.4 E.coli DH5α和E.coli Rosetta感受态 细胞的制备 37-38 3.1.5 引物设计 38 3.1.6 基因片段 pbgl25-217的克隆 38-39 3.1.7 基因片段pbgl25-217的表达 39-41 3.2 结果与分析 41-47 3.2.1 基因片段 pbgl25-217的克隆 41-42 3.2.2 重组质粒 pbgl25-217-pETDuet的构建及验证 42-45 3.2.3 Pbgl25-217的诱导表达 45-46 3.2.4 pNP标准曲线的测定结果 46-47 3.2.5 Pbgl25-217酶活性的检测 47 3.3 本章小 结 47-48 第四章 6-磷酸-β-葡萄糖苷酶Pbgl25-217的纯化 与酶学性质研究 48-60 4.1 材料与方法 48-52 4.1.1 菌株 48 4.1.2 培养基和缓冲液 48-49 4.1.3 主要仪器 及生化试剂 49 4.1.4 Pbgl25-217最佳诱导表达条件的确定 49-50 4.1.5 Pbgl25-217的纯化 50 4.1.6 Pbgl25-217的基本酶学性质研究 50-52 4.2 结果与分析 52-58 4.2.1 Pbgl25-217的最适诱导表达条件 52-54 4.2.2 Pbgl25-217的纯化结果 54-55 4.2.3 Pbgl25-217的基本酶学性质 55-58 4.3 本章小结 58-60 第五章 6-磷酸-β-葡萄糖苷酶Pbgl25-217的定点突 变 60-74 5.1 材料与方法 60-66 5.1.1 菌株 60-61 5.1.2 培养基和缓冲液 61 5.1.3 主要仪器及生 化试剂 61-62 5.1.4 引物设计 62 5.1.5 基因片段 pbgl25-217定点突变预处理 62-63 5.1.6 基因片段 pbgl25-217的定点突变 63-64 5.1.7 pbgl25-217定点突变基因片段的表达 64-66 5.1.8 E179A等突变蛋白与Pbgl25-217动力学常数的比较 66 5.2 结果与分析 66-73 5.2.1 Pbgl25-217关键催化位点分析 66-67 5.2.2 基因片段 Pbgl25-217的定点突变 67-69 5.2.3 重组质粒 E179A-pETDuet等的构建及验证 69-70 5.2.4 E179A等突变蛋白的诱导表达 70-71 5.2.5 各突变蛋白与Pbgl25-217动力学常数的比较 71-73 5.3 本章小结 73-74 参考文献 74-84 致谢 84-85 学位论文评阅及答辩情况表 85