贵州金丝桃部分化学成分的分离纯化及结构鉴定研究

贵州金丝桃部分化学成分的分离纯化及结构鉴定研究 贵州大学 硕士学位论文贵州金丝桃部分化学成分的分离纯化及结构鉴定研究 姓名:刘兴宽 申请学位级别:硕士 专业:生物化学与分子生物学 指导教师:郁建平 20020501 珍 惜 作 者 成 果——分 享 人 类 智 慧 摘要 贵州金丝桃(聃缸踟勋缈矗,凇,)乙醇提取物，去除叶绿素后，分别用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取。氯仿部过硅胶柱，石油醚一乙酸乙酯梯度洗脱，得,初品，,经结晶、重结晶纯化，得,纯品;乙酸乙酯部过硅胶柱，氯仿一甲醇梯度洗脱，得,、;初品，,、;经,,,,,,,,,,,,,纯化，得,、,纯品。用潞、，,、,,,、,,等现代分析测试手段测定其化学结构。通过波谱分析，结合理化常数及文献检索，确定分离的化合物,是五环三萜化合物，为齐墩果酸(,,,,,,,,; ,;,,):,是黄酮醇化合物，为槲皮素(？,,,;,,,);,是黄酮甙化合物，为槲皮素一,一,—,一鼠李糖甙(？,,,;,,,,一,一。;,,—,,,瑚,,,,,,)。经文献检索，这三种化合物为首次从该植物中分离得到。关键词:贵州金丝桃，化学成分，齐墩果酸，槲皮素，槲皮素一,,,一,一鼠李糖苷 ,本研究为贵州省教委科研基金资助课题。 珍 惜 作 者 成 果——分 享 人 类 智 慧 ,(引言 生物活性成分主要是指那些对生物体的生命活动过程能产生影响的有机化合物，生物活性物质是由动物、植物及海洋生物和微生物体内分离出来的生物二次代谢产物，以及生物体内源性生理活性化合物。生物活性物质与生物学、药物学、农艺学等学科密切相关“,。天然活性化合物的研究成果被广泛应用于食品、轻工、化工、医药、农药等各方面，为保障人类的健康提供许多高效低毒副作用的新型药物。 天然药物之所以能够防病治病，其物质基础在于所含的生物活性成分。研究中草药的活性成分，目的在于研究活性成分的化学结构、理化性质与生物活性之间的关系，逐步阐明其防病治病的原理;寻找新药物新药源或开发利用对国民经济有价值的资源;同时，探索中草药加工工艺，改进药物剂型，控制中药及其制剂的质量，提高临床疗效。由于天然药物往往含有结构、性质不同的多种成分，且生物活性成分的含量一般较低，因此研究和开发天然药物必须从复杂的中草药组成成分中提取、分离和鉴定出有活性的单体成分。有时，为了增强疗效，克服毒副作用，通过改变活性成分的结构，制备其类似物或衍生物，以创制出更好更新的药物。以中草药或其他动植物、微生物和海洋生物生物活性成分为主要研究目标的相关工作，已经成为寻找新药的重要研究途径“,。 的确，许多有效药剂或其母体的发现基本上源于天然产物。例如从植物中提取的抗疟疾药青篙素、金鸡纳霜，抗癌药紫杉醇、长春花碱、喜树碱、美登素，消炎药黄连素、穿心莲内酯，保肝药水飞蓟素、五味子酯，降压药利血平，避孕药天花粉，从微生物得到的抗生素青霉素、四环素等。由于生物活性成分研究所提供的活性物质结构新颖，疗效高、副作用小，所以它们始终是医药行业中新药的主要来源之一，在天然产物中寻找有生理活性的化合物，从中筛选生理活性强 , 珍 惜 作 者 成 果——分 享 人 类 智 慧的，有典型结构的化合物作为模型，并依此模型通过结构改造，合成出具有更好效果的药物或农药，这是药物研究和农药开发的思路之一。,。 中药是我国传统防治疾病的药物，近年来，随着人们回归自然的要求及趋势，中药现代化受到高度关注，中药有效成分的结构、性质及功能的研究对阐明中药的药理作用机制，提高疗效以及研究开发新的治疗药物，具有重要意义。,。 金丝桃属植物产于全国各地，许多种在国内外民间被广泛作为药用。在国内约有,,种为民间药用植物，金丝桃属植物多数种民 间用作治病良药，可用于治疗黄疽型肝炎、口腔癌等多种疾病，主要用于治疗抑郁症、抗菌消炎、镇静、肝炎、痢疾、收敛、止血生肌、调经活血等。近年来，对本属植物贯叶连翘的研究导致了对金丝桃素的多种生理活性的研究，研究发现，金丝桃素可用于艾滋病的治疗，因而对本属植物的研究正在深入。,。本文研究的目的意义: 金丝桃属植物多数种民间用作治病良药，具有抗爱滋病、抗忧郁、抗癌症、抗病毒、抗菌和疗伤、治疗黄疸型肝炎、增强免疫功能等多种生理活性。金丝桃属植物国产特有种多，本属植物中，约有,,种被记载为民间中草药，其中大部分未作化学研究，已进行过化学成分研究的国产金丝桃属植物种类中，迄今仅发现,,余种成分，约占本属植物成分的三分之一。…。目前国际上已对本属大多数植物进行了成分检测，对其中的,,余种进行了植化研究，共发现,,余种成分，这些成分绝大多数具多种药理作用。国内外研究涉及我国分布的植物仅十余种广布种，从中发现了,,余种成分。同时我国绝大部分特有种未作任何研究，进一步的研究将会有很多的发现。因而有较高的研究价值，可望发现新化合物及成分新分布。深入研究有效成分将对国产金丝桃属资源的开发与利用起到促进作用。 鉴于金丝桃属植物的研究现状，本课题作为天然产物化学研究的一个内容，旨在研究贵州金丝桃的化学成分，以期探索本植物中有药用和开发价值的生物活性成分。为研究和开发贵州金丝桃提供有意义的参考。 珍 惜 作 者 成 果——分 享 人 类 智 慧 ,(实验部分,(,材料,(,(,实验材料 实验用材料贵州金丝桃(磊功,，,;瓣幻秒,幽鲫,,)采自遵义市铁厂镇西花村瓮岩组，经贵州大学林学系兰开敏教授、廖海民副教授鉴定为藤黄科 (白,,,如,,, ,,,,()金丝桃属(坳,—;删,()植物贵州金丝桃(，咖盯,;姗,,,,,;,,,,曲。,(,(,主要试剂 石油醚 ,, 贵阳前锋化学试剂厂 苯 ,, 沈阳化学试剂厂 氯仿 ,, 重庆川江化学试剂厂 乙酸乙酯 ,, 天津市化学试剂一厂 正丁醇 ,, 重庆东方试剂厂 丙 酮 ,, 国营重庆无机化学试剂厂 乙 醇 ,, 遵义高等师专化学试剂厂 甲 醇 ,, 国营重庆无机化学试剂厂 四氢呋喃 ,, 天津市化学试剂三厂 二甲基亚砜 ,, 重庆东方试剂厂 氢氧化钠 ,, 广东西陇化工厂 盐 酸 ,, 广东廉江安铺化工厂 硅胶, 青岛海洋化工厂 硅胶, 青岛海洋化工厂 硅胶,,,,, 青岛海洋化工厂 羧甲基纤维素钠 上海三浦化工有限公司 珍 惜 作 者 成 果——分 享 人 类 智 慧 大孔吸附树脂(,,,,,) 天津农药厂 实验所用水均为蒸馏水 贵州大学生化所制备 其它试剂均为国产分析纯,(,(,主要仪器 电热鼓风干燥器 ,,,,卜,型 重庆试验设备厂 电热真空干燥箱 ,,一,,,型 上海市实验仪器总厂 紫外一荧光灯 ,,,一,,,型 上海顾村电光仪器厂 电冰箱 ,,,一,,,,,,型 国产 电子分析天平 ,,,,,,型 国产 旋转蒸发器 ,,一,,,型 国产 循环水式多用真空泵 ,,,一?型 国产 显微熔点测定仪 ,一,型 国产 紫外光谱仪 日立一,,,,型光谱仪 日本产 红外光谱仪 ,，,,,,,,，—，,,,,型 美国产 质谱仪 ,,,,,—,,型 美国产 核磁共振仪 ”…““’，,,,,一,,,型超导 脉冲付里叶变换核磁共振仪 美国产,(,方法,(,(,样品处理及提取 将三公斤贵卅,金丝桃植株(地上部分)切碎，日光下晒干，然后用,,,,,,乙醇浸泡于,,?烘箱中，分四次提取，每次浸泡时间为一天，滤液减压浓缩，浓缩物放在一起。残渣再用,,, ,,,乙醇浸泡于,,?烘箱中，分四次提取，每次浸泡时间为一天，滤液减压浓缩，浓缩 物与,,,乙醇浸提液浓缩物放在一起，最后的残渣弃之。 去除叶绿素:向浓缩物中加入,,,乙醇(,,?)，使之溶解，再向稀释液中 珍 惜 作 者 成 果——分 享 人 类 智 慧加入适量的水，使,,,的乙醇稀释成,,,的浓度，摇匀后，倒入分液漏斗，再加入等体积的石油醚振摇，使叶绿素转移到上层石油醚溶液中，分出下层,,,乙醇样品液，浓缩。,(,(,分离与纯化 分别用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取浓缩物，获得氯仿部、乙酸乙酯部、正丁醇部和水部。氯仿部过硅胶柱，石油醚一乙酸乙酯梯度洗脱，得,初品，,经,,,,纯化，得,纯品:乙酸乙酯部过硅胶柱，氯仿一甲醇梯度洗脱，得,、,初品，,、;经,,,,,,,,纯化，得,、;纯品。正丁醇部和水部用大孔吸附树脂分离、纯化，效果不理想，将大孔吸附树脂、葡聚糖凝胶以及制备型高效液相色谱结合起来分离、纯化极性较大的物质，效果或许会好些。 贵州金丝桃化学成分的提取、分离、纯化工艺流程见下页图。,(,(,单体的结构鉴定 经提取、分离、纯化、精制，并以高效,,,、,,,,等检测分离化合物的纯度，确定得到的化合物是否单体，测定各单体化合物的熔点以及测定各单体化合物的,,、，,、,,,躲、”,嘲,及,,等谱学数据，通过熔点对照结合文献检索及查阅《分析化学手册》(第七分册)，确定各单体化合物的结构。各单体化合物的谱图见附图,,图,,。 珍 惜 作 者 成 果——分 享 人 类 智 慧 贵州金丝桃成分提取、分离、纯化流程图: 厂———止竺, 贵州金丝桃植株(地上部分)干燥、粉碎(,虹) ,,钇黻， 滤液 残渣 ,浓缩 浓缩物 厂〕 ,,曼兰 葛了海勉’ 广—————丁——不氯仿部(,,,) 多次硅胶柱层析 乙酸乙酯部(,,,) 正丁醇部(,,,) 水部(,,,,) 石油醚一乙酸乙酯梯 一 石(乙,:,组分 , 黼〕 (甲,:,组分 ， ,,,;多次层离制各乙 ,,,乙醇 ,,曲,,,,,,(,, 反复结晶 纯化 ， ， 酸乙酯?丙酮,甲醇?水 ,:,:,(,:, ? ,,,,,,,)【,,,,, 纯化 图, 贵州金丝桃成分提取、分离、纯化流程图 ,培, ,,,, ,,, ;,脚, ,,,均,理,池册幻妙纠蝴孵 , 珍 惜 作 者 成 果——分 享 人 类 智 慧 ,(结果与讨论,(,生物活性成分的提取,(,(,提取方法的选择 中草药的提取分离方法很多，主要有溶剂提取法、水蒸气蒸馏法、升华法，溶剂提取法中又有浸渍法、渗漉法，煎煮法、回流提取法、连续提取法等等，全面考虑各种方法的优缺点、可行性、有效性以及实验目的 (本课题对贵州金丝桃进行全成分分析)，本课题采用溶剂提取法中的浸溃法。,(,(,提取溶剂的选择 用于提取中草药的溶剂很多，常见的有甲醇、乙醇、水等等;若要提取某种已知的成分，还可以用石油醚、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇或它们的一定配比的混合物进行提取。本课题进行全成分分析，很多成分是未知的，故只能用甲醇、乙醇或水提取。甲醇可以较全面地浸出药材中的有生理活性的成分，但甲醇价格较贵，而且毒性也大。可以用乙醇代替甲醇，只要方法得当，两者的效果是一样的。用水浸提，则亲脂性成分(极性小的成分)溶出较少，提取不全面，提取液中不含小极性成分，而且蛋白质、多糖等成分溶出，杂质太多。提取液容易长霉腐败，导致活性成分发生变化。本课题选用乙醇作为浸提液。,(,生物活性成分的分离及纯化,(,(,生物活性成分混合物的预处理 由于实验材料是植物，浸提液含有大量的叶绿素，在进一步分离纯化过程中，严重影响操作和实验结果，故必须将叶绿素除去。将中药材用,,,乙醇(,,?)浸提后，向浸提液中加入适量的水，使,,,的乙醇稀释成,,,的 浓度，摇匀后，倒入分液漏斗，再加入等体积的石油醚振摇，使叶绿素转移到上层石油醚溶液中，分出下层,,,乙醇提取液，就可以进行初步的分离纯化。 对于石油醚萃取的部分，可能含有一些极性较小的物质，可用活性碳进行脱色，然后再对脱色的部分过硅胶柱;或将脱色部分减压浓缩干后，再依次用石油 ,, 珍 惜 作 者 成 果——分 享 人 类 智 慧醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇洗涤脱色部分，各部分分别过硅胶柱。不论何种方式，其问注意结合使用结晶和重结晶法，会收到意想不到的效果。本课题研究中，曾获得少量的晶体，但由于所用的实验材料太少，晶体的量不够打谱。,(,(,生物活性成分的初步分离及纯化,(,(,(,萃取法 利用混合物中各成分在两种互不相溶的溶剂中分配系数的不同而达到分离的目的。混合物中各成分在两相溶剂中分配系数相差越大，则分离效率越高。如果提取液中有效成分是亲脂性物质，一般多采用亲脂性有机溶剂，如苯、氯仿或乙醚进行萃取;如果有效成分偏于亲水性的物质，在亲脂性溶剂中难溶解，就需要改用与水不相混溶而具有一定程度亲水性的有机溶剂，如乙酸乙酯、丁醇等萃取。例如提取黄酮类成分，多用乙酸乙酯与水作两相萃取;提取皂甙则多选用正丁醇、异戊醇与水作两相萃取。不过，有机溶剂的亲水性越大，与水作两相萃取的效果就越差，因为能使较多的亲水性杂质伴随而出，对有效成分进一步精制影响较大。由于中药成分复杂，往往采用极性由低到高的几种溶剂依次进行液一液萃取。此外，用极性溶剂水洗涤亲脂性溶剂提取液以除去混入的极性杂质和以亲脂性溶剂洗涤水提取液中的亲脂性杂质也是分离纯化过程中常用的方法。本课题采用了五部萃取分离法，即用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取浸提液，最后获得了石油醚部、氯仿部、乙酸乙酯部、正丁醇部和水部，然后再对各部分别处理。,(,(,(,硅胶柱层析法 本课题的进行主要是利用硅胶柱层析法，是利用混合物中各成分对吸附剂 (固定相)的吸附能力不同，根据“相似相溶”原理，用不同极性的流动相(洗脱剂)流经吸附剂，从而达到对混合物的分离。硅胶是最广泛应用的吸附剂，它具有中等程度的吸附能力，化学稳定性较强，属于亲水性吸附剂，对极性化合物吸附力强，主要适用于正相层析法，分离非极性化合物(亲脂性物质)，也可用于分离极性化合物。硅胶柱是一种正相柱，即流动相(洗脱剂)的极性是从小依次增大。 珍 惜 作 者 成 果——分 享 人 类 智 慧,(,(,(,(,硅胶的选择 硅胶的种类较多。从生产厂家方面，有青岛海洋化工厂、上海五四化学试剂厂、浙江雁荡山试剂厂等等;从硅胶颗粒大小方面，有,,,一,,,目、 ,,,一,,,目、,,,—,,,目、,型(,,型)、,,。,,等等。究竞选用哪个厂家的、何种型号的硅胶，要根据一定的经验和实际的分离目的。一般地讲，混合物的成分较多，进行初次分离时，用颗粒比较大(目数较小)的硅胶效果较好;混合物的成分较少 (,—,种)，或精制纯化样品，宜选用颗粒较小(目数较大)的硅胶。,(,(,(,(,硅胶的处理 有些厂家生产的硅胶质量较好，颗粒均匀而且几乎不含有其他杂质;有些厂家生产的硅胶质量较差，颗粒大小不均而且含有较多的杂质。此外，有些硅胶在储藏和运输过程中，由于保管不善而导致硅胶吸水而失活。所以，硅胶在使用之前要进行处理。 硅胶的结构是由聚硅醇分子经过不同程度脱水形成的干燥凝胶。硅胶分子以多空性、错综排列的硅氧烷为骨架，其表面有硅醇基。硅胶的吸附作用，是由硅醇基产生的，是亲水性吸附剂，吸附作用的强弱取决于游离硅醇基的数目。硅醇基通过氢键可以吸附水。吸附水的硅胶，对被分离的物质吸附力降低。当硅胶 含水量达,,,以上时，失去吸附性，不能作吸附剂用。将硅醇基上的水分子除去，硅胶恢复吸附能力，称为硅胶活化，具体做法是加热除去水分。降低吸附力称为去活化。硅胶活化温度为,,,一儿,?，时间,,分钟。若超过,,,?，硅醇基即开始与邻近的硅醇基脱水，形成硅氧醚结构，这种脱水作用是不可逆的，从而使它丧失吸附能力。所以，购回的硅胶，要先用四氢呋喃一甲醇一氯仿的混合物淋洗，以除去杂质，然后再活化，经过这样处理的硅胶几乎不含有杂质。,(,(,(,(,洗脱剂的选择 选择的洗脱剂要不与被分离物质、 吸附剂发生化学反应(即不造成对被分离物质、吸附剂的破坏);洗脱效率高 易除去(即易挥发、低沸点):对被分离成分有一定的溶解度:成本较低。同时， 洗脱剂的选择还要根据吸附剂类型而定。对硅胶而言，由于是亲水性吸附剂， 在非极性溶剂中对极性物质吸附力最 珍 惜 作 者 成 果——分 享 人 类 智 慧强，故用硅胶作层析时，洗脱剂用亲脂性有机溶剂，洗脱剂的极性宜渐次增加，使被吸附的物质依极性递增渐次解吸附，逐步达到分离目的。,(,(,(,大孔吸附树脂柱层析法,(,(,(,(,大孔吸附树脂的选择 大孔吸附树脂具有稳定性高，吸附容量大，选择性好和容易再生等特性，作用十分广泛。但考虑到不同生产厂家、不同型号的树脂对黄酮类提取物的选择吸附性能差异较大，即使同一型号、同一厂家的产品，吸附性能也有一定差异。在本研究中，选用天津农药厂生产的,,,,,型大孔吸附树脂作为本课题的柱填料。,(,(,(,(,大孔吸附树脂的处理 由于存在多种杂质(特别是用过的树脂)，因此必须对树脂进行处理。一般将供实验用的树脂用蒸馏水浸泡,,,充分溶涨，然后用,,,目筛过滤，滤去水及浮游物和破碎树脂后，水洗至澄清:再用,,,,,,,,,,浸泡,一,,,并不时搅拌，除去碱液，水洗至中性:再经,,,,几,;,浸泡,—,,,并不时搅拌以除去树脂中的各种杂质，除去酸液后水洗至中性，再以,,,以上乙醇或丙酮浸泡,—,,并不时搅拌，除去溶剂后继续用同一溶剂洗至洗出液滴入水中不呈乳白色混浊为止，再用蒸馏水洗后装柱备用。由于大孔吸附树脂颗粒很脆、易破裂，故操作中一定要轻缓。,(,(,(,(,洗脱剂的选择: 脱剂选择原则同硅胶柱层析的洗脱剂的选择，但也有不同的地方。对大孔吸附树脂而言，由于是憎水性吸附剂，对极性物质的吸附性较弱;同时，又是反相柱层析，即洗脱剂的极性依次递减，故洗脱剂顺序为: 水—，乙醇(或甲醇):醇浓度递增?乙醇(或甲醇)，极性宜渐次递减，逐步达到分离目的。,(,(,(,薄板制备法(,,,;法) 当初品中有,—,种成分，需进一步分离纯化，薄板制备法也是一种行之有效的方法。,,,;法可以用来分离克量级的样品，但在绝大多数情况下用它.