转基因鱼

什么是转基因鱼 　转基因鱼是生物技术的成果。生物技术是一项以生命科学为基础，利用生物体系和原理生产生物制品和创造新物种的综合性科学技术，又称生物工程。主要包括基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程四个领域。 我国成功的鱼类基因转移 转基因鱼的意义 鱼类是人类食物消费中比普通家畜更为偏好的重要蛋白质来源发展和完善鱼类基因转移技术,将有用的鱼类基因,如生长激素、干扰素、抗寒性、抗病性及抗盐性等基因导入鱼卵可改良鱼类性状,为培育高产、优质及抗逆的养殖鱼类新品系提供新途径。转基因鱼研究虽稍晚于哺乳类但由于鱼类基因工程育种本身所具有的潜在经济价值和作为转基因研究所具有的有利条件而取得重大进展,转基因鱼是目前国内外获得最成功的转基因动物之一80年代后期开始,国际上掀起了鱼类基因转移研究的高潮,20多个实验室以不同的鱼为对象,相继投入这一领域的研究,取得了不同的进展。转基因鱼首先产生于中国,之后英国、法国、加拿大、爱尔兰、德国、美国也先后进行了转基因鱼的研究,转基因鱼研究已成为鱼类品种改良的前沿生物技术。 转基因鱼的构建及检测 利用鱼类受精卵系统做基因转移比哺乳类动物的相应系统有无可比拟的优越性。鱼类怀卵量多,易获得大量基因转移受体;在室温下干净的水中即可完成胚胎体外发育,操作方便,易于培养、管理和观察;鱼类发育至幼鱼的时间短,可以用改变环境温度控制其发育速度,是研究发育过程中基因调控与达等生物学问题的理想材料。另外鱼类是脊椎动物系统发育较原始的类群,不同种属,甚至在不同科之间,容易亲和协调,因此鱼类在接受外源基因和外源基因表达方面较高等的种类更有利转基因鱼的构建及检测转基因鱼研究首先是构建外源基因。转基因鱼研究早期使用mMT、SV40和RSV等表达效率低而且存在安全性顾虑的外源基因启动子,及人、牛、羊和鼠的生长激素(GH)基因构建目的基因,之后克隆了鱼类自身的高效启动子和鱼类生长激素、抗冻蛋白基因(AFP)、珠蛋白(Globin)基因,并进行了全鱼基因的转基因鱼研究。GH基因和AFP基因为鱼类转基因研究的两个热点基因。转基因鱼中基因导入受体卵中的方法较多,有显微注射法、电穿孔法、精子载体法、基因枪法,其中最常用的是显微注射法。转基因鱼的检测依据基因整合及基因表达采用不同的检测方法,运用斑点杂交和PCR法可检测出含有外源基因的受体鱼;采用Southern杂交作进一步检测来确定外源基因是否真正整合入受体鱼基因组;Northern杂交或RT-PCR可用来检测外源基因的转录;采用组织提取液酶活性或标记特异性抗体与组织提取液或血清等进行免疫学反应可推断外源基因的表达水平。 鱼类转基因转移的主要方法 1、显微注射法 即在显微镜下借助显微操作将直径几微米的玻璃插入受精卵原核或核附近的细胞质中,注入一定量的外源基因,注射后的受精卵于室温下在生理盐水中发育成鱼苗。显微注射法(Microinjection)是目前广泛应用、效果较好的一种方法。现在常用的3种显微注射法:󰀁从受精孔将DNA溶液注入卵中,简称MP法;尸在受精卵刚受精后卵壳尚未变硬时直接注射,简称EI法;用金属针在卵壳上打一个孔,再进行显微注射,简称LI法结果表明:全鱼基因在鲫鱼基因组中的整合率为36.4%,对转基因阳性鱼的RBA样本进Northern印迹杂交检测,转录率为25%。Fernandez报道,将RSV  TR启动子与鳝生长激素GHcDNA由受精孔显微注射入斑马鱼(Daniorerio)受精卵中,胚胎孵化率平均达32%。处理主要用于生长研究与整合分析,通过点印迹与Southern印迹发现信号呈阳性反应,进一步证实外源基因与鱼体基因组的整合。显微注射法的优点很多,转化频率高达20%。通过显微注射获得转基因鱼不是很困难,但由于人工操作受实验者技术和熟练程度的影响很大,一次能够处理的卵很少,对细胞损伤很大,死亡率较高,而且耗时费力。 2.精子载体法 以精子作为外源基因的载体,通过人工受精将外源基因导入动物胚胎,从而将外源基因带入子代基因组中而实现基因转移。在受精过程中,精原核能自动找到卵子中的卵原核,其准确性之高远非至今任何精密仪器所能比拟。这种方法非常简便、成本低廉、便于筛选,成为近年来转基因动物研究的一个热点。目前,精子载体制作转基因鱼主要有3种方法: 2.1直接混合法。在受精前将精子直接加入事先配好的保存液中,然后与外源基因混匀,温育半小时后按常规方法受精。 2.2脂质体法。将外源DNA与精子混合培养之前用脂质体包裹,脂质体自发地与DNA形成脂质体-DNA复合体。这种复合体比较容易和精子细胞质融合,从而进入细胞内部,同时脂质体的包裹还可防止核苷酸酶的降解以及防止DNA被稀释。 2. 3电穿孔法。又叫电脉冲。该方法的基本原理是利用外部高电压短脉冲使细胞膜的结构改变,使之产生可逆的孔隙或孔洞,一定大小的分子包括DNA可通过孔隙或孔洞进入细胞。电穿孔法已经在微生物、哺乳动物和植物原生质体基因转移中得到广泛应用,现在又开始用于鱼类基因转移。钟家玉等将稀有鲫(Gobioprisrarus)精子与重组质粒PGAHLFc线性DNA混合温育,经电脉冲处理后卵子受精,孵化出苗,从鱼苗中提取DNA经PCR检测,25.5%~66.7%的鱼带有外源基因。谢岳峰等以泥鳅脱膜受精卵为材料,电穿孔转移外源基因,获得了10%的转基因泥鳅。电穿孔法的优点是操作简便,一次可以处理大批受精卵。缺点是外源基因的导入是随机的,且转移的频率较低。然而,最近的表明,该方法所获得的转基因鱼存活率及外源基因整合率均达到显微注射法的水平。 3．基因枪法 又名高速钨微粒子轰击法或粒子枪法(Particlegun)。基因枪法是利用DNA包裹在钨微粒子上面,通过高速轰击受体细胞以达到把外源DNA转移的目的。该方法在植物细胞中使用得较多,鱼类也有成功的报道,如Zelenin等用半乳糖苷酶和新霉素磷酸转移酶基因序列的质粒DNA包裹钨微粒子,高速轰击欧洲泥鳅(Misgurnusfossilis)、虹鳟鱼和斑马鱼受精卵,有70%的卵受轰击后存活。PCR扩增和Southern杂交结果,在G418处理后存活的斑马鱼总DNA中检测到了新霉素磷酸转移酶基因序列。中科院海洋所的刘志毅等用基因枪法将外源GFP基因成功地导入中国对虾(PenaeusChinensis)体内并有相应基因产物表达,获得了转基因对虾。 4．逆转录病毒感染法 此类病毒是RNA病毒的一种,进入宿主后从RNA逆转录成DNA,并结合到宿主细胞的染色体上,这种纳入病毒基因的细胞染色体内就存在了病毒基因。如果把目的基因整合到病毒染色体上,用改造的病毒侵染宿主细胞就有可能向细胞内导入外源基因。这种方法已广泛应用于转基因动物模型的基因表达机制、基因产物、细胞缺陷校正和遗传病基因治疗研究等诸多领域。Elwood等将e基因插入逆转录病毒LTR区,构建了可以进行荧光蛋白表达的逆转录病毒载体。逆转录病毒感染法的优点是无论在体外还是在体内,其宿主的范围十分广泛。逆转录病毒为直接保持宿主基因组中一定结构的原病毒,可被整合并与染色体上其他基因一起活动。插入的外源DNA可达10kb,适用超长基因转移。逆转录病毒通过感染在受体细胞中进行外源基因的高效转移和筛选。该方法的缺陷在于载体病毒DNA序列有时会影响外源基因在受体动物中的表达,特别是载体病毒导入受体动物细胞后的安全性令人。 5.胚胎干细胞介导法 6.染色体片段显微注射法 7.其他方法 转基因鱼的检测 外源基因导入受精卵后，接下去的任务就是检测外源基因是否在受体鱼中得到整合和表达，这是转基因工作中非常重要的一部分。当外援基因注入受体鱼受精卵后，通常会进入核中或没有进入核中。进入核中又存在几种情况：一是外援基因游离于核染色体之外；二是外源基因部分同源序列插入核DNA中；三是外援基因全部插入核DNA中。因此这项工作又可分为四个层次进行：首先采用PCR和斑点杂交初步筛选出整合了外源基因的实验鱼。然后用souten杂交法确认真正整合的转基因鱼；再用Northen杂交法和反转录PCR法（RT-PCR）来检测外援基因的转录；最后用酶反应法和抗体标记法（免疫荧光法、放射免疫法、酶联免疫法等）确定其表达情况。 应用前景 3转基因鱼的安全性及遗传稳定性 转基因鱼的安全性主要是指食用安全和生态安全两方面。转基因鱼引发的有关潜在性风险,即食品安全、遗传以及生态安全性已越来越受到各国政府和人民的关注。由于转基因鱼尚处于试验性研究,还没有形成商品化规模,因此,对于食品安全性问题的报道还不是很多。朱作言以国际上拟定的基因工程食品安全性评价原则为标准,率先对全鱼基因CAgcGH基因的食品进行了评价,认为转基因全鱼CAgcGH基因的食品安全性等级可归于一级。闫学春等对转牛(羊)生长激素基因的工程鲤的安全性问题也进行了试验论证,其结果是对食用动物猫无副作用。 随着转基因技术进入实用化阶段，其负面影响也逐渐显露出来，这主要是指转基因品种对人类健康、生态环境等的安全性问题，这已引起全世界对转基因技术的广泛争论。在转基因植物中，已发现了一些问题，如美国康奈尔大学罗西发现转抗基因玉米虽可产生抗虫害能力，但同时也具有毒性，可能对生态环境产生不利影响。丹麦学者也发现转基因植物可将外源基因转移给杂草，即发生了转基因的非正常扩散。另外，到目前为止，以转基因品种为原料制造的食品对人类健康的影响也尚无定论。这些情况都迫使人们在进行转基因研究时必须慎重。鱼类能在各种水体中间游动，活动的地域相当广泛，一旦转基因鱼被释放到开放水体中，又不像植物或陆生动物那样可以较方便地回收，所以它们对生态环境可能产生的影响将比转基因农作物更为严重，而且污染源几乎不可能消除。 展望 鱼类基因转移不仅利于研究,且具有重要的经济价值。提高渔业经济效益,包括增加生长速度、商品重、净肉率,提高饵料转化率,改善鱼抗病和抵御恶劣环境条件的能力等。改善品质包括外表、肉色、肉味和脂肪酸成分等。用作生物反应器生产药品。作为实验模型进行基础研究探讨发育、生长、繁殖等机理。所以,鱼类转基因研究具有重要的意义和广阔的前景。我国是世界水产大国将转基因等现代生物技术引入传统的水产养殖已成为必然的发展趋势。快速生长转基因鱼的成功研制,展示了转基因技术在水产养殖中的广阔前景,更重要的是转基因技术将为日益频发的养殖病害防治提供有力的支持。 转基因鱼是目前国内外获得最成功的转基因动物之一。 文档已经阅读完毕，请返回上一页！