内参基因的概念

内参基因的概念 内参即是内部参照，它们在各组织和细胞中的达相对恒定，在检测基因的表达水平变化时常用它来做参照物。其作用是校正上样量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样半定量的结果才更为可信。一般要选择一个在处理因素作用的条件下不会发生表达改变的基因作内参。 在进行基因研究的过程中,实时反转录 PCR也和传统的mRNA定量方法如 Northern b lot技术等一样, 要求使用参照基因以校正转录效率和 cDNA用量, 弥补制备过程中样本纯度和浓度的差别, 使不同样本之间目的基因的比较成为可能,以期获得真实可靠的结果。大多数方法中这些差别可通过与内参照比较处理消除。最普通的内参照是内源性参照基因,也叫管家基因。 管家基因:又称持家基因(house-keeping genes)生物体各类细胞中都表达，其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的蛋白质编码的基因。如微管蛋白基因、糖酵解酶系基因与核糖体蛋白基因等。是 为维持细胞基本生命活动所需而时刻都在表达的基因。 管家基因表达水平受环境因素影响较小，而是在个体各个生长阶段的大多数、或几乎全部组织中持续表达，或变化很小。它的表达只受启动序列或启动子与RNA聚合酶相互作用的影响，而不受其他机制调节。 管家基因高度保守并且在大多数情况下持续表达，因此管家基因常被用于分子技术--多位点基因分析。 内参基因通常是各种看家基因，在细胞内组成稳定性表达，有助于保持细胞的功能。理想的内参基因应该满足以下条件:1, 不存在假基因(Pseudogene)，以避免基因 DNA的扩增; 2,高度或中度表达，排除低表达; 3,稳定表达于不同类型的细胞和组织(如正常细胞和癌细胞)，而且其表达量是近似的，无显着性差别; 4,表达水平与细胞周期以及细胞是否活化无关;5, 其稳定的表达水平与目标基因相似;6, 不受任何内源性或外源性因素的影响，如不受任何实验处理措施的影响. 近年来的研究发现:这些常用内参基因均存在缺陷，在不同类型的细胞和组织 细胞增殖和器官发育的不同阶段 体外培养 各种实验条件等情况下它们的表达量通常变异较大。正确的选择内参基因, 很大程度上依赖所研究的细胞或组织, 不同的试验需要寻找适合各自试验体系的特异性稳定表达的内参基因。然而,合适内参基因的选择,需要在各种类型的细胞或组织和各种试验条件下进行比较选择。理想的内参基因应在各种试验条件下,各种类型的组织和细胞中均恒定表达,而且其表达量是近似的,无显着性差别。另外要求不存在假基因以避免基因组的扩增。 常用的内参基因包括GAPDH 、β- actin(BETA-actin) 、18sRNA、28sRNA 、B2M、ACTB、SDHA、HPRT1、ARBP内参基因 等。 1，在血清刺激条件下的基因表达定量研究中, B 22MG 和 18SrRNA 作为内参基因是合适的, 而 B 2act in 和GAP 2DH 则不适合。 2，大鼠是常用实验动物, 老年大鼠在阿尔茨海默症等模型研究中常用。我们针对老年大鼠组织实时老年大鼠肾组织中相对表达最稳定的管家基因是ACTB; 心脏和肺组织中表达最稳定的内参基因是G3pd 3，内参基因sdha和hprt1适合用于校正目标基因的表达量，为研究幼龄小鼠小肠组织基因表达奠定基础。 4，对于枣树基因表达研究的内参基因,组蛋白 ZH j 3基因在不同器官、 不同生长时 期的结果枝及其顶端组织中有表达, 表达最稳定,最适宜用于枣树基因表达研究的内参基因。 5，HSV感染下用作标化内参基因排序 其研究发现，在应用 pcDNA3.1 载体进行表达研究时，相比之下 GAPDH 作为内参效果更好更为适合和稳定 6，RT-PCR方法，检测乳腺肿瘤及其邻近乳腺组织中的IL-8mRNA及内参GAPDH的表达水平知乳腺癌组织 高表达IL-8,可作为评价乳腺癌进展 及判断预后 的指标 7，H MBS 和 C- TBP两个看家基因适用于校正目标基因的表达量,为研究男性乙肝相关肝癌组织中目标基因的表达奠定基础 实时反转录 PCR研究应使用至少两个内参基因以确保结论可靠: 其一可以是某种核糖体 RNA(例如 18S r RNA), 用来对 RNA总量和转录步骤中可能发生的降解进行必要校正; 第二个内参基因应和目的基因 mRNA表达水平接近。Arb p 细胞丰度相对最低、 表达相对最稳定且在不同组织间差异最小,相对较适用于老年大鼠组织间 mRNA表达变化分析。