羊脂油对淫羊藿活性黄酮自组装胶束模拟形成的影响

羊脂油对淫羊藿活性黄酮自组装胶束模拟形成的影响 羊脂油对淫羊藿活性黄酮自组装胶束模拟形成的影响 宁津律师 [摘要]该文通过模拟人体内环境，研究羊脂油作用下淫羊藿活性黄酮自组装胶束的模拟形成，同时研究了不同产地(青海、江苏、安徽)、不同来源(山羊和绵羊)、不同部位(肚子油和尾巴油)的12批羊脂油以及羊脂油中主要脂肪酸类成分(硬脂酸、棕榈酸、油酸)对淫羊藿活性黄酮自组装胶束形成的影响。结果表明在羊脂油作用下，模拟形成的胶束呈分散状态，类球形且表面光滑。以粒径、电位、包封率、载药量等为指标对制得的胶束进行考察，发现产地为青海的绵羊制得的胶束较稳定，包封率较高。羊脂油中3种主要脂肪酸类成分能促进淫羊藿活性黄酮自组装胶束的形成，但羊脂油整体作用效果更好。以上研究证实羊脂油促进了淫羊藿活性黄酮自组装胶束的模拟形成，为进一步研究其作为淫羊藿炮制辅料的增效作用，促进淫羊藿活性黄酮的吸收奠定了基础。 [关键词]羊脂油;自组装胶束;炙淫羊藿;活性黄酮;脂肪酸类成分 淫羊藿为我国传统的补益中药，历代本草均有记载。药典记载其具有补肾阳、强筋骨、祛风湿的作用[1]。淫羊藿的有效成分主要是黄酮类化合物，如淫羊藿苷、宝藿苷?等。 传统炮制理论认为，淫羊藿经羊脂油炙后，可增强温肾助阳的作用[2]。本课组前期研究发现，羊脂油本身含有大量脂肪酸类成分，如油酸、硬脂酸、棕榈酸、甘油酯等，这些脂肪酸类成分具有脂肪长链以及表面活性，可以促进形成胶束、囊泡等多种药物载体的超分子自组装体结构。而人体内固有的胆汁酸或盐具有亲水面和疏水面，是一种天然的生物表面活性剂。胆汁酸盐可与脂类如磷脂、甘油酯、脂肪酸以及其他表面活性剂形成混合胶束作为药物载体，促进药物的吸收[3-5] 。因此，笔者提出炙淫羊藿中炮制辅料“羊脂油”的作用机制假说:炙淫羊藿口服进入体内，羊脂油促进了胶束的自组装形成，增加了活性黄酮的溶解度，提高了活性黄酮的肠吸收，从而发挥了其增效作用[6-9]。 因此，本文选择淫羊藿活性黄酮淫羊藿苷、宝藿苷?以及总黄酮为研究对象，通过模拟人体胃肠道内环境，研究在羊脂油作用下淫羊藿黄酮成分自组装胶束的形成，并选择不同来源、产地、部位的羊脂油以及羊脂油主要脂肪酸类成分考察其对淫羊藿黄酮自组装胶束模拟形成的影响，为进一步研究其作为淫羊藿炮制辅料的增效作用，促进淫羊藿活性黄酮的吸收奠定基础。 1 材料 Agilent 1200系列高效液相色谱仪，四元泵，DAD检测器(Agilent公司，美国);激光粒度分析仪 (Zetasizer-Nano-ZS型，英国Malvern公司);透射电子显微镜(JEM-1010，日本电子公司JEOL);METTLER AB135-S 型电子天平(1/10万，梅特勒-托利多仪器有限公司);85-2型恒温磁力搅拌器(上海司乐仪器厂);Milli-Q纯水机(Millipore，美国);KQ5200型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。 淫羊藿苷(西安小草植物科技有限公司，批号xc20130628，纯度>98%);宝藿苷?(自制，纯度>98%);淫羊藿总黄酮(西安小草植物科技有限公司，批号20130628，纯度>80%);羊脂油共12批(201201-201212)，分别采自安徽(4批)、江苏(4批)、青海(4批);油酸(上海凌峰化学试剂有限公司);硬脂酸(国药集团化学试剂有限公司);棕榈酸(成都市科龙化工试剂厂);乙腈为色谱纯，水为纯净水;其余试剂均为分析纯。 2 与结果 2.1 色谱条件 淫羊藿苷和宝藿苷?高效液相色谱条件:色谱柱为Phenomenex ODS C18(4.6 mm×250 mm，5 μm);流动相乙腈-水(30?70);柱温30 ?;流速1.0 mL?min-1;检测波长270 nm;进样体积20 μL。淫羊藿总黄酮紫外分光光度法条件:甲醇为空白对照，吸收波长为270 nm。 2.2 曲线的制备 2.2.1 淫羊藿苷标准曲线的制备 精密称取淫羊藿苷对照品10.15 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得质量浓度为406 mg?L-1的淫羊藿苷储备液。分别精密量取淫羊藿苷对照品储备液0.25，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得10.15，20.3，40.6，81.2，121.8，163.6，203.0 mg?L-1的系列对照品溶液。按2.1项下色谱条件进样测定，以淫羊藿苷峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标进行线性回归，得回归方程Y=13 728X-39.18，r=0.999 8，表明淫羊藿苷在10.15,203.00 mg?L-1与峰面积呈良好线性关系。 2.2.2 宝藿苷I标准曲线的制备 精密称取宝藿苷I对照品5.00 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得质量浓度为200 mg?L-1的淫羊藿苷储备液。分别精密量取宝藿苷I对照品储备液0.25，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得5.00，10.00，20.00，40.00，60.00，80.00，100.00 mg?L-1的系列对照品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，以宝藿苷I峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标进行线性回归，得回归方程Y=32 369X-2.895 5，r=0.999 8，淫羊藿苷在5.00,100.00 mg?L-1与峰面积呈良好线性关系。 2.2.3 淫羊藿总黄酮标准曲线的制备 按照药典方法，选取淫羊藿苷为对照品。精密称取淫羊藿苷对照品3 mg，置 于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得质量浓度为0.12 g?L-1的淫羊藿苷储备液。分别精密量取淫羊藿苷对照品储备液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 mL置10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得0.006，0.012，0.018，0.024，0.030，0.036，0.042 g?L-1的系列对照品溶液，以甲醇为空白，用紫外分光光度计在270 nm处测定吸光度，以浓度C与吸光度A进行线性回归，得回归方程A=6.922 6C+0.024 9，r=0.999 7。 2.3 自组装胶束的模拟形成 称取脱氧胆酸钠0.033 g溶解于80 mL的HBSS(pH 7.4)溶液中，缓慢搅拌30 min让脱氧胆酸钠充分溶解。精密称取适量的羊脂油和淫羊藿活性黄酮溶解于10 mL无水乙醇中，然后将该乙醇溶液缓慢注入到上述脱氧胆酸钠溶液中，均匀持续搅拌2.5 h，即得加羊脂油的自组装胶束。同法制备不加羊脂油的活性黄酮自组装胶束。 2.4 胶束的形态观察及粒径测定 取制备好的胶束上清液稀释至合适浓度，滴加至铜网上，用2%磷钨酸钠溶液复染，在透射电镜下观察拍照，胶束粒子形态，结果见图1。从电镜图片中可以看到，加入羊脂油后，胶束呈圆球形均匀分布，表面光滑无粘连，粒径分布也较均匀。而不加羊脂油虽然也能形成胶束，但是胶束互相粘连，粒径分布不均匀且呈不规则形状。 〖JZ〗〖XC李杰-1.TIF〗 A1.淫羊藿苷+脱氧胆酸钠+羊脂油;A2.淫羊藿苷+脱氧胆酸钠;B1.宝藿苷?+脱氧胆酸钠+羊脂油;B2.宝藿苷?+脱氧胆酸钠;C1.总黄酮+脱氧胆酸钠+羊脂油;C2.总黄酮+脱氧胆酸钠。 图1 淫羊藿黄酮自组装胶束透射电镜图 Fig.1 TEM images of Epimedium flavonoids self-assembled micelles 另取制备好的胶束溶液，用马尔文激光粒度仪测定胶束粒子的粒径、多分散系数(PDI)以及Zeta电位，结果见表1。加羊脂油组胶束与不加羊脂油组相比，粒径明显较小，Zeta电位绝对值较大，说明加羊脂油后，胶束稳定性较好。 2.5 胶束包封率及载药量的测定 包封率(EE)的测定采用超滤离心法[10]。分别取制备好的加羊脂油和不加羊脂油的胶束，精密量取2 mL置超滤离心管中(截留相对分子质量为1万)， 3 500 r?min-1离心30 min，超滤液经0.45 μm微孔滤膜过滤后，取续滤液20 μL进样，用HPLC测定游离淫羊藿苷和宝藿苷?的含量，用紫外分光光度计测定游离总黄酮的含量，即Wfree。另取同一批次自组装胶束2 mL，加入甲醇2 mL破乳，同法处理得胶束中药物总含量，即Wtotle。平行测定3次，按下式计算胶束药物包封率和载药量，结果见表1。从结果可以看出 加入羊脂油后，淫羊藿活性黄酮类成分自组装形成的胶束包封率明显增大，均能达到90%以上。包封率(EE)=(Wtotle-Wfree)/Wtotle×100%;载药量(DL)=(Wtotle-Wfree)/W×100%。Wtotle，Wfree，W分别为胶束中总药量、游离药物量、药物及辅料总量。 2.6 不同产地、来源、部位羊脂油对自组装胶束形成的影响 为了进一步考察不同羊脂油对淫羊藿活性黄酮类成分自组装胶束形成的影响，选取产地为青海、江苏、安徽的山羊和绵羊2个品种、羊尾油和羊肚油2个部位共计12个批次的羊脂油，考察其对淫羊藿总黄酮自组装胶束形成的影响。按2.3项下胶束的制备方法，制备了12个批次的淫羊藿总黄酮自组装胶束。通过测定胶束的粒径、电位、包封率、载药量等指标，评价不同产地品种及部位的羊脂油对胶束自组装形成的影响，结果见表2。所有12个批次的羊脂油制备的胶束粒径大多数都在200 nm以内，而Zeta电位绝对值均大于20 mV，表明制备得到的胶束处于稳定状态。因此选取差异较大的包封率为主要评价指标，结果产地为青海的绵羊羊脂油制得的胶束包封率较大，与产地为安徽和江苏的山羊组相比，包封率显著提高。而来自青海绵羊不同部位的羊脂油对形成的胶束的包封率影响不大，包封率均在94%左右。 2.7 羊脂油中主要脂肪酸类成分对自组装胶束形成的 影响 研究发现[11]，羊脂油的主要成分为25种脂肪酸类成分，占羊脂油总成分的90.89%，而其中3种主要成分为硬脂酸、棕榈酸、油酸。选取这3种羊脂油主要成分进一步探究羊脂油对淫羊藿活性黄酮自组装胶束模拟形成的影响。按2.3项下方法制备自组装胶束，并按2.5项下方法测定其包封率和载药量，结果见表3。通过对粒径、电位、包封率等指标的考察表明，单独的羊脂油脂肪酸类成分如硬脂酸、棕榈酸、油酸等也能促进活性黄酮胶束自组装形成，但是与羊脂油整体作用下形成的自组装胶束相比，粒径变大，电位绝对值变小，包封率也有所下降，显示模拟形成的胶束稳定性相对于羊脂油整体作用下的胶束有所下降。结果提示羊脂油中主要脂肪酸类成分与胆酸盐作用，促进了淫羊藿活性黄酮类成分自组装胶束的形成。同时结果说明在羊脂油整体作用下形成的自组装胶束更加稳定，推断形成稳定的自组装胶束可能是羊脂油整体脂肪酸类成分作用的结果。 3 讨论 羊脂油是一种常用的中药炮制辅料，味甘、性温，具有补肾助阳、润燥、祛风解毒之功效。传统炮制理论认为，淫羊藿经羊脂油制后可增强温肾助阳的作用。本文着重研究了羊脂油对淫羊藿活性黄酮自组装胶束在模拟人体内环境中形成的影响。 本研究通过对比加羊脂油和不加羊脂油模拟形成的胶束发现，加入羊脂油后模拟形成的胶束粒径更小，电位稳定，包封率也显著增加，表明羊脂油可以促进淫羊藿活性黄酮自组装胶束的形成。 本研究考察了不同品种、产地、部位的羊脂油对胶束模拟形成的影响，结果发现产地为青海的绵羊油所形成的胶束粒径较小，包封率较高，而青海绵羊不同部位的羊脂油则对胶束的模拟形成无明显影响。 本文进一步研究了羊脂油中主要脂肪酸类成分硬脂酸、棕榈酸、油酸对自组装胶束形成的影响，结果发现各脂肪酸类成分能促进自组装胶束的形成，但在羊脂油整体作用下，形成的胶束更加稳定。通过系统研究表明，羊脂油中主要脂肪酸类成分与体内胆酸盐共同作用，形成自组装胶束。这种胶束可以作为淫羊藿活性黄酮类成分的载体，提高黄酮类成分的包封率，从而改善黄酮类成分的溶解度。而进一步的研究发现，产地为青海的绵羊油对自组装胶束的模拟形成作用最佳。同时虽然羊脂油中的某一脂肪酸类成分能促进自组装胶束的形成，但形成的胶束稳定性不如羊脂油整体效果，说明可能是羊脂油整体脂肪酸类成分在促进自组装胶束的形成。此外不同产地、品种、部位的羊脂油主要成分构成有所差异，下一步将模拟天然羊脂油中各种成分的不同配比，进一步研究羊脂油对淫羊藿活性黄酮自组装胶束形成的影响。 本文在模拟人体内环境的条件下，制备了淫羊藿活性黄酮自 组装胶束，这种胶束可以作为新型的药物载体促进药物在体 内的吸收[4-5]。胶束的模拟形成为进一步研究其改善药物 的溶解度、促吸收及其增效作用奠定了基础，为淫羊藿炮制 辅料羊脂油的作用机制研究提供了依据。 [参考文献] [1] 中国药典.一部[S]. 2010: 306. 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Then the effects of the fatty acids in suet oil on the preparation of self-assembled micelles were studied furthermore. The results showed that the micelles had a dispersed state and spherical smooth surface. To compare the diameter， potential， encapsulation efficiency and drug loading of the 12 batches micelles， the micelles prepared by the suet oil from Qinghai were more stable and had a higher encapsulation efficiency. The fatty acids in suet oil could promote the formation of self-assembled micelles， but the whole suet oil had a better effect. Above all the study， we confirmed that the suet oil promoted the formation of self-assembled micelles of the flavonoids in Epimedium， it laid foundation for further research about increasing the efficacy of Epimedium and improved the absorption of the active flavonoids in Epimedium. [Key words]suet oil; self-assembled micelles; Epimedium fried with suet oil; active flavonoids; fatty acids doi:10.4268/cjcmm20141713 [责任编辑 马超一]