N^＋和Ti^＋离子注入井冈霉素生产菌诱变筛选高产菌株的研究

N^＋和Ti^＋离子注入井冈霉素生产菌诱变筛选高产菌株的研究 [标签:标题] 第25卷第6期 2007年12月 辐射研究与辐射工艺学报 J.Radiat.Res.Radiat.Process. Vo1.25,No.6 December2OO7 N+和Ti+离子注入井冈霉素 生产菌诱变筛选高产菌株的研究 虞龙安肖 (南京工业大学制药与生命科学学院南京210009) 摘要利用N+和离子注入对井冈霉素生产菌株进行诱变选育,比较了出发菌株经过两种离子 源注入后的诱 变效应.初步探索使用金属离子和气体离子交替注入诱变方法,得到了较高的正突变率和突 变增幅.用该方 法诱变得到一株高产菌株B1.3,其产井冈霉素A组分的效价为21514,比出发菌株提高 54.4%.经多次传代 实验明该菌株的遗传稳定性较好. 关键词离子注入,诱变,选育,井冈霉素 中图分类号Q937,Q31933,$435.111.42,TQ465.9+2 井冈霉素是一种主要用于防治水稻纹枯病的碱 性水溶性抗菌素?J,主要成分是井冈霉素A,B,E, F,井冈羟胺A,B以及少量的井冈霉素c,D,其 中含量最多,活性最强的是A组分【2’3】.作为一种绿 霉素的应用 色,低毒对人畜无害的生物农药,井冈 价值越来越得到认可. 目前我国井冈霉素的生产企业多达30多家,产 品严重供过于求,售价逐年下降,竞争十分激烈. 井冈霉素生产厂家所用的井冈霉素生产菌株几乎都 是经过紫外诱变【5’6】,微波诱变,6OCo辐射诱变等 方法得到的突变菌株.菌种对这些诱变手段产生了 不同程度的钝化现象,导致国内井冈霉素发酵生产 水平一直徘徊在10000---13000(单位pglmL,以A 组分计,下同)的水平上.我们通过N和Ti离子交 替注人诱变方法得到了发酵效价稳定的高产菌株 B1—3,其摇瓶发酵得到的A组分效价可达到21514, 比出发菌株(A组分效价13931)提高了54.4%,经多 次传代证明该菌株遗传稳定性良好. 1材料与方法 1.1菌种 吸水链霉菌井冈变种(Streptomyceshygroscu— picusvar.JingganggensisYen.),本实验室保藏. 1.2培养基 固体培养基(g?L-):葡萄糖10,L一天冬酰胺 0.5,K2HPO40.5,琼脂15,pH自然. 摇瓶发酵培养基(g?L-):大米粉90,黄豆粉20, 花生粉10,酵母粉10,KI-I2PO40.85,NaC11.5,pH 自然. 1.3培养方法 将实验室保存的吸水链霉菌井冈变种的孢子悬 液以不同的稀释度在平板培养基上进行涂布分散, 38~C培养三四天,挑选形态圆整的单菌落至斜面培 养二三天,接种至发酵培养基中培养92,96h,测 定井冈霉素A的效价.摇瓶装液量为40rnL,接种 量为一环孢子,培养温度38~C,摇床转速220r/min. 1.4筛选方法 1.4.1初筛据文献报道,形态为中心吸水状的单 菌落发酵生产抗生素水平比其它形态的高[5】.本实 验室经过长期多次实验证实了这一结论.选取诱变 平板上中心吸水型的单菌落进行摇瓶发酵. 1.4.2复筛将平板上筛选的单菌落接种斜面,培 养3d后接种人250mL摇瓶,培养92,96h进行 效价测定.效价高者作为下一轮诱变的出发菌株. 第一作者:虞龙,男,1970年2月出生,2002年6月于中国科学院等离子体物理研究所获理学 博士学位,生物工程专业, 南京工业大学副教授 收稿日期:初稿2007.04.11,修回2007.07.12 辐射研究与辐射工艺学报第25卷 1.5井冈霉素A效价测定 井冈霉素A效价测定采用高效液相色谱(HPLC) 法钔. 1.5.1发酵液处理方法培养92—96h的发酵瓶称 重后,将发酵液9000r/rnin离心,取上层清液1mL, 蒸馏水稀释定容至50mL,0.45prn微孔滤膜过滤后 用l{】LC测样. 1.5.2发酵效价计算方法井冈霉素效价定量计算 采用标准曲线法.HPLC测得井冈霉素A组分含量, 所得效价乘以50,再乘以摇瓶发酵失水系数即为 40mL发酵液的效价. 1.6离子注入与样品处理 取待诱变菌株斜面,倒入10mL无菌水,刮下 孢子及斜面培养物,用玻璃珠打散,双层纱布漏斗 过滤,得到孢子悬液,吸取0.1mL,均匀涂布于无 菌培养皿上,以无菌风吹干.镜检无细胞重叠者进 行离子注入. 1.7存活率的计算 将经过离子注入的培养皿以及未接受辐射的培 养皿中的孢子用1mL无菌水洗脱,再进行适当的 稀释后涂布到固体培养基中,置于38~C培养箱中培 养三四天.统计在不同的诱变能量和剂量下,接受 离子注入诱变的菌株的存活单菌落数与不接受注入 的对照菌株的存活单菌落数,两者的比值即为存活 率. 1.8突变率的计算 经过多次平行实验的结果统计,同一株吸水链 霉菌井冈变种的发酵效价变化幅度在?4%左右.所 以,在诱变选育研究中,我们将突变株效价相比于 出发菌株变化幅度在?5%的菌株视为无义突变株或 实验误差,效价低于出发菌株5%以上的视为负突 变菌株,效价高于出发菌株5%以上的视为正突变 菌株. 负突变率是指负突变菌株占全部被考察菌株的 比率,正突变率是指正突变菌株占全部被考察菌株 的比率,总突变率是指正,负突变率之和. 2结果与讨论 2.1存活率曲线 选取同一出发菌株AN1(13931),分别用N+和 Ti离子注入诱变,在相同注入能量下,统计不同剂 量下的菌落存活个数.以0剂量下菌落成活个数为 对照,计算各注入剂量的菌落存活率,绘制存活率 曲线(见图1和图2). 离子注入微生物的剂量一效应曲线一般呈现 “马鞍”型,这是离子注入诱变所特有的诱变效应 的重要表现J.但是,由图1和图2发现,两种离 子注入井冈霉素生产菌株的存活率曲线均呈现近似 的”双马鞍”型,菌体的存活率分别出现了两次回 升.菌体存活率的两个回复峰的出现有可能是由于 注入离子与菌体内修复机制共同作用的结果,其机 理有待进一步探讨.我们推测,由于注入离子对菌 体的损伤是持续累积的,但是菌体自身的修复机制 是复杂多样的,其相互作用存在一定的激活和抑制 规律,从而导致了存活率的高低差异. Fig.1ThesurvivalrateofAN一1implantedbyionswith differentdoses Fig.2ThesurvivalrateofAN一1implantedbyTiionswith differentdoses 2.2两种诱变源对菌体突变率的影响 对井冈霉素生产菌株AN.1分别以15keV能量 的和进行离子注入,分别在不同剂量下随机 挑取一定量的单菌落进行摇瓶发酵,统计菌体的正 负突变率(见图3和图4). 第6期虞龙等:N+和Ti离子注入井冈霉素生产菌诱变筛选高产菌株的研究 Fig.3ThemutationrateofAN-1implantedbyNionswith differentdoses 510l52O253O Implantationdose,10el’1]一 Fig.4ThemutationrateofAN-1implantedbyTiionswith differentdoses 由图3和图4可见,在中间剂量下,正突变菌 体比例较高,注人剂量过高或过低都不利于菌体的 正向突变.经比较发现,两种离子注人剂量与菌体 正突变率变化的基本趋势相同.当注人剂量增加到 一 定程度之后所有菌体均为负突变,这可能是由于 在这一阶段注人离子对菌体结构的损伤是破坏性 的,菌体自身的修复机能无法弥补遗传基因的严重 改变,从而导致大量负突变甚至全负突变. 2.3N和Ti离子交替诱变与单一N诱变效果比 较 以离子注入诱变出发菌株AN一2(13973),得 到高产菌株A3—1,其产井冈霉素A的效价为16772, 传代后效价水平稳定.分别用Ti和对其进行下 一 轮诱变,各随机挑取50株诱变株,进行摇瓶发酵 测定效价.统计正突变率在5%以上的单菌落个数, 见表1. 结果发现,将第二轮诱变源换成金属Ti离子 后,菌体正突变率和突变幅度均高于继续用N离子 诱变的菌株.这可能是由于菌体对于多种离子注人 的敏感度高于单一离子.在长期使用N离子注人诱 变后,金属Ti离子的利用可以使离子改变细胞遗传 基因的效果增强,达到诱变产生高产突变株的目的. Table1ComparisonofthepositivemutantbetweenTiandNimplantation 实验表明,仅用Ti离子诱变会使菌株致死率逐 渐升高,这是因为在相同能量下,Ti相对于N有 更大的质量数,导致其LET效果大于后者,使得菌 株DNA实际吸收剂量更高,损伤也更大.而用N+ 和Ti交替诱变可有效地将致死率控制在一定的范 围内,便于进一步菌种选育.在N离子和Ti离子 交替注人诱变下,筛选出高产菌株Bl一3,其发酵效 价为21514~tg/mL,相对于出发菌株的效价增幅为 54.4%. 注人离子的种类不同,主要影响质量的沉积效 应I?.N离子作为一种活性粒子注人细胞活化后, 将与周围的移位原子,本底原子发生化学反应,产 生新的分子或基团而沉淀下来.而金属Ti离子,除 以各种无机离子的形式沉淀下来以外,还可以通过 与靶分子或自由基结合成络合物的形式沉淀.我们 推测,用两种离子交替注人菌体可以使细胞内的影 响复制,转录或修复的特定酶活性被不断地激活或 抑制,从而产生比单一离子注人更复杂,更有效的 突变株. 2.4突变菌株遗传稳定性研究 在N离子和Ti离子交替注人诱变下,筛选出 的高产菌株Bl一3,经过三次传代和摇瓶发酵试验, 测定其产井冈霉素A的效价(见表2),其平均产素 增幅为50.5%. Table2ThegeneticstabiUtyofmutantstrainB1—3im- plantedbyNandTi ?跚加砷?蚰如加mO ,u?c0一lIl ?如舯加?如蚰如?O euo焉In苫 374辐射研究与辐射工艺学报第25卷 3结论 以N离子和Ti离子注入对井冈霉素生产菌株 进行诱变选育,筛选到一株高产突变菌株(A组分效 价为21514),与出发菌株相比,其产井冈霉素A效 价提高了54.4%,达到目前国内外先进水平.比较 了用两种离子源交替注入与单一离子源注入诱变的 效果,初步得出以不同种类离子源交替诱变的效果 优于单一离子源诱变的结论. 参考文献 2 3 4 5 6 7 上海农药研究所农用抗菌素组编.井冈霉素.上海:上 海人民出版社,1977.1-23 AgriculturalAntibioticGroup.ShanghaiPesticideRe- searchInstitute.Jinggangmycin.Shanghai:Shanghai People’sPress,1977.1-23 1wsaAntibiotics,1971,24(2):119—123 1wsaHigashideE,YamamotoH,eta1.Antibiotics, 1971,24(2):107.1131 沈寅初.植物保护,1996,22(4):44_45 SHENY’mchu.PlantProt,1996,22(4):44—45 邹坚.世界农药,2003,25(6):42.43 ZOUJian.WorldPestic,2003,2S(6):42-43 邹坚.现代农药,2003,2(2):27—28 ZOUJian.ModAgrochem,2003,2(2):27?28 陈力力,鲁迎新.生物技术,2003,13(5):14.15 C/TENLili,LUY’mgxi~.Biotechnology,2003,l3(5): 14.15 中华人民共和国国家质量技术监督局.GB厂r9553.93. 中华人民共和国国家标准.井冈霉素水剂.北京:中国 标准出版社 Statebureauofqualityandtechnicalsupervision.National StandardofPRC—validamycinaqueoussolution(GB/T 9553-93).Beijing:StandardPressofChina 宋道军,姚建铭,邵春林,等.核技术,1999,22(3): 129132 SoNGDaojun,YAOJianming,SHAOChunlin,eta1. NuclTech,1999,22(3):129132 余增亮.离子束生物技术引论.合肥:安徽科学技术出 版社,1998.176-190 YUZengliang.IntroductiontOionbeambiotechnology. Hefei:AnhuiSciTechPress,1998.176-190 Screeningonthehighyieldvalidamycinproducingstrainbyimplantation withandTiionsources YULongANXiao fCollegeofmlyeScienceandPharmaceuticalEngineering,NanfingUniversityofTechnology,Nanjing 210009,China, ABSTRACTInordertOcomparedthemutageniceffectsofthevalidamycinproducingthestrfin(Strepto myceshy- groscupicusVar.JingganggensisYen.,wasimplantedwi山 twokindsofionsources.Theresultsshowedthatwhen twokindsofionsourcesimplantedintotheswainbyturns,morepositivemutantsandhigheryieldwouldb eacquired. Usingthismethod,ahigh-yieldingstrainB1-3wasobtained,whichproducethetiterofvalidamycinAof2 1514,and was54.4%higherthanthatoftheoriginalstrain. KEYWORDSIonimplantation,Mutation,Validamycin,Jinggangmycin CLCQ937,Q31933,$435.111.4+2,TQ465.92