应用农杆菌介导法获得转大麦黄矮病毒GPV株系复制酶基因ORF1的小麦植株

应用农杆菌介导法获得转大麦黄矮病毒GPV株系复制酶基因ORF1的小麦植株 应用农杆菌介导法获得转大麦黄矮病毒GPV株系复制酶 基因ORF1的小麦植株 植物病理学报: 应用农杆菌介导法获得转大麦黄矮病毒株系 复制酶基因 的小麦植株 张文蔚,吴茂森,刘太国,成卓敏 中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室,北京 摘要:以生产用 种基因型小麦为,利用农杆菌介导法将大麦黄矮病毒株系复制酶基因 分别转化愈龄 幼胚愈伤组织,经过筛选后,共再生出 株抗性植株,拓宽了小麦农杆菌转化的受体基因型。及杂交分析证实大麦黄矮病毒复制酶基因 已经整合到小麦基因组中,共获得 株转基因植株。抗病性初步检测结果显 示,转基因植株对 株系具有抗性。研究结果还表明,对于不同的基因型小麦进行转化时,需选择适合本基因型的菌株。 关键词:小麦;农杆菌转化;大麦黄矮病毒株系;复制酶基因 ;转基因植株 .,? , ?, ?,, ,, :?. ‘ ... . .: ; ? ; ; ; 中图分类号:. . 文献标识码: 文章编号: 由大麦黄矮病毒 , 矮病的化学防治效果不佳,并且在普通小麦中未发 现抗性基因,因此人工构建抗性基因的转基因小麦引起的小麦黄矮病是危害小麦生产的重要 病害。自 世纪 年代以来,该病在我国先后多 就成为防治小麦黄矮病的有 效途径之一。 植物的基因转化是植物基因工程的关键步骤 次流行,流行年份一般减产 %一 %,严重时可 达 %,给我国小麦生产造成严重的经济损失。 之一。近几年农杆菌介导法以其操作简单、转化效 率高、成本低、拷贝数少以及外源基因在转基因后 我国所分离到的株系为我国所特有的株系和 代中比较稳定等优点而得到人们关注。年 主流株系,与国外报道的 种株系 、、等 利用农杆菌介导法首次获得转基因小 、、 均无血清学反应。由于小麦黄 收稿日期: ;修回日期: ? 通讯作者:成卓敏,研究员,主要从事植物病毒学研究; ? : . 第一作者:张文蔚 一 ,女,北京人,助理研究员,硕士,主要从事分子植物病理学研究。植物病理学报卷 . 农杆菌介导的小麦遗传转化 麦植株。随后,许多实验室也展开了此方面的研究 并成功获得转基因小麦植株 。本研究利用大 剥取温室或大田开花左右的小麦幼胚, 麦黄矮病毒株系复制酶基因 转化 种 接种于 诱导培养基中, ?下黑暗培养, 生产用小麦品系,获得转基因植株,拓宽了小麦农 继代培养一次。取培养的幼胚愈伤组织用于 杆菌转化的基因型范围,现将结果如下。 农杆菌转化,转化时间为 ,然后转移到共培养培 养基中, ?下黑暗培养 。共培养结束后,将转 材料与方法 化受体转移到筛选培养基上,/ , 、 . 材料 . /、 / 、/ 抑菌剂, 其中 的抑菌剂为羧卞青霉素, 毒源为中国农业科学院植物保护 的抑菌剂为头孢霉素?光照条件下筛选培养 研究所分子病毒组保存, ?反转录酶购自 ? 周左右,再转入预分化培养基中 , 一 用量 公司;聚合酶和内切酶购自 降低至 ./ ,其它成分同筛选培养基 ,同样公司;连接酶和 ? ? 条件下筛选培养 周左右,再将它们转入分化培养试剂盒购自公司; 购 基, . / 玉米素、 ./、/ 自北京亚辉生物医学工程公司。供试材料为小麦品 中继续进行筛选分化, 分化出的抗性植 种晋麦 、鲁麦 、 和莱州的幼胚。 株,转入壮苗培养基, ./ 、 / . 植物表达载体的构建 中进行壮苗,培养生根。待长出一定数量 病毒的分离和病毒 纯化参照的实生根后,将幼苗移栽到花盆中, ?光照培 养 等 的方法进行。以 ?的病毒为 箱 光照, 黑暗 中培养。 ,合成 基因上游引物 ? . 转基因植株的检测邢 ,划线 . . 提取 用改进的 法 提取小 部分为酶切位点 和 下游引物麦叶片中的,叶片用量为 ? 。一 一 . . 及 检测 扩增反,划线部分为 酶切位点 ,通过 ? 应体积为 ,反应条件: ?热启动; 方法获得全长基因片段。回收后?, ,, 个循环; 与 . 载体相连,通过酶切鉴?延伸。将电泳结果转移到 膜 定,和序列测定得到中间表达载体 ? 上,以 标记转基因的目的基因片段作 ,再经过 酶切后插入到相同酶切的 根 为探针进行杂交,探针标记方法采用公司 癌农杆菌双元载体 上,通过插入方向的鉴 随机引物法进行。探针杂交利用杂交炉进行。杂 定,选取正向插入的 基因的植物表达载体, 交结束后放射自显影,对杂交结果进行分析。 构建成 一 图 。 . .杂交检测 将转基因小麦总 . 根癌农杆菌菌株 用 酶切后,电泳、洗胶、转膜、预杂交 后,以 选择标记基因做探针进行杂交,洗膜 菌株为 和 。通过冻融法将 后暗室中进行放射自显影。 . 导人和 中。 . .一 期 张文蔚,等:应用农杆菌介导法获得转大麦黄矮病毒株系复制酶基因 的小麦植株 . 室内抗病性初步鉴定 其转人农杆菌菌株 和 中,提取 质粒,经和 酶切鉴定,表明载体已成 将阳性的转基因材料 代种子和非转 功转入农杆菌菌株中。 基因小麦种子种于温室,待麦苗长到 叶片时,经 检测,选取 株阳性的转基因植株,接 . 转基因小麦植株的获得 种饲毒蚜虫,每株接种 头饲毒蚜虫。饲毒蚜虫 剥取开花的小麦幼胚,分别将它们接种 为人工饲养的无毒二叉蚜在毒源上饲毒 于 培养基中, ?条件下黑暗培养,后观 的蚜虫。接毒后,杀虫剂去除蚜虫,放人人工 察幼胚愈伤组织生长情况,幼胚愈伤组织诱导率为 强光照控温生长室中观察发病情况。%一%。其中,鲁麦 为 %,晋麦 为%, 为 %,莱州 为 %。 结果与分析 选用培养 的幼胚愈伤组织 图为受 . 株系复制酶基因 的体感染农杆菌,共培养后将愈伤组织转到含有 扩增及植物表达载体 一 的构建 和相应抑菌剂的培养基上进行筛选培养。经 以株系病毒为模板进行 . 过筛选培养和预分化培养后,可出现较明显的抗性 扩增,得到了大小为 个核苷酸的特异片段 愈伤组织 图 . ,并产生抗性再生芽。将它们转 。将 ?产物回收后与 . 载 移至分化培养基中,可分化出抗性植株 图 一 体相连,得到中间表达载体 .。通过,但有部分抗性愈伤组织在分化培养基上 ? 酶切鉴定,和序列测定,表明所得到 后产生一些绿芽 图 一 ,最终并不形成植株,还有 的片段序列与已知序列相同,为所需要的目的片 部分假阳性植株在筛选过程中白化死亡 图。 段 。 ?再经过 酶切后插入 不同基因型小麦所获的抗性愈伤组织获得率 到相同酶切的根癌农杆菌双元载体 上。由 不同,在 . %~ . %之间 表 。其中,鲁麦 于质粒构建过程中采用单酶切方式进行连接,因此、莱州的抗性愈伤获得率较高,晋麦 和 插入片段的方向正反都有,需要进行片段插人方向 的抗性愈伤获得率则较低。虽然抗性愈 的确定。根据序列和酶切位点分析,在载体 伤的获得情况很好,但是抗性愈伤分化则较为困 的 碱基处有一个酶切位点,在 难。相比之下,和莱州的再生能力要 中的碱基处有一个 酶切位点。可 强于鲁麦 和晋麦 。 以用对筛选出的重组质粒进行酶切分析,切 不同基因型小麦对菌株的反应也不相同。鲁 下长度为 碱基的片段,为正向插入;切下长 麦 和均是 的转化效果好于 度为碱基的片段为反向插入。取反向插人 ,莱州和晋麦 则是 的转 的重组质粒命名为。利用冻融法将 化效果好于。 : ; : ; :; :. 期 张文蔚,等:应用农杆菌介导法获得转大麦黄矮病毒株 系复制酶基因 的小麦植株获得高抗的转基因植株 ~ 。 等 利用花粉 . 室内抗病性鉴定 管通道法将 .株系复制酶基因 和 对转基因植株进行了抗病性初步鉴定。接毒 分别转化到晋麦 和陇鉴 中, 但只获得 后,对照即未转基因小麦植株的叶片变黄,全 了 的转基因系, 基因的转化后代没有 部表现感病症状。而转基因的只有 株的叶尖有 检测到 阳性的转化株。 等 利用花 褪绿症状,其余则未发病。抗病性初步鉴定结果显 粉管通道法将 ?株系缺失复制酶基因 示,转基因植株对 .具有抗性,后续实 转化到晋麦 中,获得了阳性的转基 验尚在进行中。 因植株。将利用花粉管通道法获得的转基因后代 讨论 进行田间抗病性鉴定发现,有些转基因系具有高度 的抗性,在对照植株严重发病时不表现症状或仅出 本研究使用的农杆菌介导的小麦遗传转化近 现轻微的叶尖发黄症状;有些转基因系则表现为症 年来有了较大的进展,但小麦再生困难仍是限制基 状减轻,在对照植株叶片全部黄化时,仍能保持旗 因转化的主要因素。由于品种的再生问题,转基因 叶不发病或发病面积小于/ 。本研究利用农杆 小麦在世界范围内都集中在少数几个基因型,而这 菌介导法分别将 ?株系复制酶基因 些基因型并非生产实践所需或在生产实践中应用 和 转入到鲁麦 、晋 麦 、莱州 有限,尤其是农杆菌介导的小麦转化多为模式植株 和以及扬麦、花和京东 号中 ,因此筛选优良的受体基因型势在必行。 转化 基因另文发表 。抗病性的初步鉴 本研究采用 种基因型小麦作为受体,均为生产中 定得到了与利用花粉管通道法获得的转基因植 应用的品种, 株转基因植株的获得,拓宽了小麦 株相似的结果。在大麦黄矮病毒中,由 和 农杆菌转化的受体基因型。个框架所编码的蛋白 和 总被一起 另外,农杆菌菌株也是影响小麦遗传转化的 进行研究,因为表达 蛋白的 没有自己的 一 个重要因素。 等?采用菌系 起始密码子, 蛋白的表达必需通过 蛋白翻 获得; 等 采用 转化小麦获得了小麦 译完成时经由核糖体移码翻译出一个 ? 融合 转基因植株; 等 利用、 未 蛋白。所以 应该具有单独表达和与 融合 获得转基因植株;而等 认为 是最 表达 种方式,也就是说它应该具有 种功能。 为有效的。本研究利用和 均 已有证据表明 . 融合蛋白与依赖的 得到了转基因植株,鲁麦和均是 聚合酶有关,而单独表达的 蛋白的功能 的转化效果好于 ;莱州和 仍不清楚 。本研究通过分子检测及抗病性的 晋麦则是 的转 化效果 好 于 初步检测,获得了对 ?具有抗性的转。由于目前的研究结果不尽相同,有的 基因植株。转基因小麦的病毒抗性,在后 甚至相互抵触,究其原因,可能与采用的受体基 代植株中是否能稳定遗传,以及 蛋白的功能, 因型不同有关,也可能与试验操作有关,因此有 将有待进行深入研究。 必要进行系统的研究和比较,对于不同的基因型 小麦进行转化时,需选择适合于本基因型的 参考文献 菌株。, , ,.? 由于普通小麦品种中尚未发现抗大麦黄矮病 ? . ., , : ? . 毒的抗性基因,因此构建病毒来源的抗性基因,并 , , ,.? 进行转基因小麦的研究是植物抗病毒育种的重要 . ? 途径之一。采用的外源基因包括病毒的 基因、 . 复制酶基因、运动蛋白基因、反义、 等。 植物生理学报 , 目前已有多种利用病毒复制酶基因转化寄主植物 。 : ? .