小尾寒羊骚痒病单抗制备及免疫组化检测方法的初步建立

小尾寒羊骚痒病单抗制备及免疫组化检测的初步建立 小尾寒羊骚痒病单抗制备及免疫组化检测 方法的初步建立 中国农业科学2006,39(4):819—824 ScientiaAgriculturaSinica—— 小尾寒羊骚痒病单抗制备及免疫组化检测方法的初步建立 张永强1..,吴晓东2刘雨田2张海涛,,王志亮2鲍恩东 ('南京农业大学动物医学院,南京210095:农业部动物检疫所/国家外来动物疾病诊断中心,青岛266032) 摘要:【目的】通过达羊PrP核心片段,单抗制备,最后建立免疫组织化学检测羊痒病方法.【方法】用PCR 方法从小尾寒羊基因组DNA中扩增编码PrP核心片段DNA,并克隆到硫氧还原蛋白融合表达载体pET一32a(+)上, 转化至EcoliBL21,IPTG诱导融合表达.以纯化的重组小尾寒羊PrP核心片段免疫PrP基因敲除小鼠,利用淋 巴细胞杂交瘤技术,制备羊核心片段单克隆抗体.【结果】通过上述方法,得到相对分子质量约为35kD的重组小 尾寒羊PrP核心片段,筛选出六株能稳定分泌针对小尾寒羊PrP核心片段特异单抗的杂交瘤细胞株.免疫组化试 验表明,其中4株可特异性识别羊痒病脑组织切片中耐PK酶消化的PrP,经5次重复试验表明:所制备单抗与对 照单抗F89结果完全一致.【结论】利用原核表达,单抗制备等技术制备出PrP特异性单克隆抗体,用笔者自己研 制的单抗作为核心试剂初步建立了羊痒病免疫组化检测方法. 关键词:小尾寒羊;痒病;单抗;免疫组化 EstablishmentoftheMethodofImmunohistochemistryAssayforthe DetectionofScrapiebyMonoclonalAntibody ZHANGYong.qiangl?, WUXiao.dong,LIUYu.tian,ZHANGHai.taol', WANGZhi.1iang,BAOEn.dongl (CollegeofVeterinaryMedicine,NanjingAgriculturalUniversity,Nanfing210095;2NationalDiagnosticCenterforExoticAnimal Disease/NationalAnimalQuarantineInstituteofMinistryofAgriculture,Qingdao266032) Abstract:[Objective]ThemethodofimmunohistochemistryassayforthedetectionofScrapiebymonoclonalantibodyWas established.[Method]GenomicDNAwasisolatedfromtheovinewholeblood.Usingthepolymerasechainreactiontoamplifythe corepartofPrPfromtheovineGenomicDNA.ByusingtherecombinantDNAtechnology,therecombinantproteinofcorepartof PrPWasobtained.Thenusingstandardmethodologyofmyelomacellfusion,monoclonalantibodieswereobtainedtodetectScrapie byimmunohistochemistry.[Result]耵 lerecombinantproteinofCOrepartofovinePrPWas0btainedandapanelofsixhybridomacell linessecretingspecificantibodiestocorepartofPrPrelatedtoScrapiewereestablishedfromonefusionbetweenmyelomaSp2/0 andspleencellsfrommiceimmunizedwiththepurifiedrecombinantprotein.FourhybridomaeellfinesCanbeUSedin immunohistochemistryassayforthedetectionofScrapie.[ConclusionI111erecombinantcorepartofPrPandspecialMabsWas obtainedbyusingrecombinantDNAandmyelomacellfusiontechnology.Sothespecialmonoclonalantibodydevelopedinauthors universitycanbeusedtodetectofScrapiebyimmunohistochemistry. KeyWOrds:Ovine;Scrapie;Monoclonalantibody;Immunohistochemistry 0引言 【本研究的重要意义】传染性海绵状脑病 (transmissiblespongiformencephalopathies,TSE)是 存在于人类和动物界的一类中枢神经系统慢性退化性 致死性疾病,又称朊毒体病.羊痒病(scrapie)的发现 已有二百多年的历史,是最先(1936年)被认识的 TSE.,.免疫组化(immunohistochemistry,IHC)检 收稿日期:2005—10一O5;接受日期:2006—02—15 基金项目:国家自然科学基金项目(C02030606)和农业部948项目(2001—366)资助 作者简介:张永强(1977一)男,山东邹平人,博士研究生,研究方向为羊痒病的研究.通讯作者王志亮(1966一),男,山东莱阳人,研究员,博士, 研究方向为动物传染病研究与检测工作.Tel,Fax:0532—7839922;E—mail:Zlwang111@yahoo.tom.cn.通讯作者鲍恩东(1963一),男,内蒙 古赤峰人,教授,博士,研究方向为动物病理解剖和免疫病理学的教学和研究.Tel:025—84395316;E—mail:bendong@njau.edu.cn (注:l,2同为第一合作单位,不分先后,共同享有知识产权) 中国农业科学39卷 测为目前最有效的检测方法,其原理是:组织切片经 PK酶消化以后prpc被全部消化,而PrPsc中耐PK酶 消化的部分(PrP27—30)保留下来『2】.由于PrW核心 片段与PrPs具有相同的蛋白序列,制备PrW核心片 段的单克隆抗体,可用于痒病的免疫组化检测.而中 国没有自主知识产权的羊prpc核心片段的单克隆抗 体,常规检测需要购买国外昂贵的核心试剂,成本较 高.本研究目的在于研制羊核心片段单克隆抗体取代 进口昂贵单抗作为核心试剂,进行普查.【前人研究进 展】引起TSE的蛋白质称为朊蛋白或朊毒体(pfion), 分为细胞型(PrW)和致病型(PrP)Ill~TSE是由于 prpc转变成PrPs,PrP在中枢神经系统沉积所致.PrW 作用于中枢神经系统,引起神经元的细胞调亡,导致 朊毒体病.王志亮等『4】通过将牛PrP重组蛋白免疫PrP 基因敲除小鼠得到单抗4C11,并且建立了中国牛海绵 状脑病免疫组化检测方法;赵丽,王健伟等l5研究PrP 多肽的抗原性以及不同偶联方法对多肽免疫原性的影 响,认为PrP多肽可作为半抗原刺激小鼠强烈的免疫 反应,不同偶联方法.不同肽段抗原性不同.李运敏 等『6】用大肠杆菌表达的牛朊病毒成熟蛋白免疫新西兰 白兔,获得了抗体T1,可检出羊搔痒因子263K毒株 感染金黄地鼠的鼠脑中PrPsc蛋白.【本研究切入点】 农业部动物检疫所王志亮等已经用自己制备的单抗建 立了BSE检测方法,但羊痒病检测方法中国还没有自 己的核心试剂.本研究正是此基础上在王志亮,鲍恩 东,吴晓东等人的指导下进行此项研究的.【拟解决的 关键问题】通过PCR从小尾寒羊基因组中扩增PrP核 心片段基因,构建小尾寒羊prpc核心片段表达重组质 粒PrP-pET-32a(+),在大肠杆菌中原核表达,分离纯 化融合蛋白,以纯化的重组小尾寒羊prpc核心片段免 疫PrPc基因敲除小鼠(PrPc.nullmice),利用淋巴细 胞杂交瘤技术,制备针对小尾寒羊PrPc核心片段的单 克隆抗体,并用Western—blot检测羊脑组织中的PrPc 以及免疫组化方法检测羊痒病阳性脑组织切片中的 PrP,为建立羊痒病免疫组化检测提供实践依据. 1与方法 1.1PrP.核心片段在大肠杆菌中的表达 1.1.1菌种和试剂菌株E,coliDH5Q,EcoliBL2l (DE3),质粒pET-32a(+)为农业部动物检疫所外 来病检测中心实验室保存;TaqDNA聚合酶,T4DNA 连接酶以及限制性内切酶购自大连宝生物公司.DNA 纯化试剂盒(SpinPrepGelDNAKit),Ni+离子柱亲和 层析纯化试剂盒(Ni—NTAHiBindPurificationKit),测 序通用引物(1_7promoter)均为Novagen公司产品. 鼠抗羊朊蛋白单克隆抗体F89由农业部动物检疫所外 来病检测中心刘雨田提供;辣根过氧化物酶标记羊抗 鼠IgG+IgM为SIGMA公司产品.显色底物DAB为 华美公司进口分装;其余常规试剂为国产分析纯试剂. 1.1.2引物根据已报道小尾寒羊PrPc基因序列rjJ, 用PrimerPremier5.O0软件设计引物,并分别在基因 的5端和3端引入EcoRI和HindHI位点,下游引物将 原序列TATrAC突变为TAATAA,产生两个终止密码 子: 上游引物5'-TCGGAATI'CGGTCAAGGTGGT. AGC.3EcoRI 下游引物5,-GGCAAGC1TrGTI'ATI~AAGCCT- GGGA13HindIII 1.1.3小尾寒羊PrPc核心片段表达质粒PrP-pET-32a (+)的构建取新鲜的小尾寒羊血液20rnl,提取基 因组DNA.用PCR方法扩增小尾寒羊prpc核心片段 基因.扩增反应条件为:94?,7min;94?,1min; 55?,0.5min;72?,0.5min,30个循环;72?,10 min.碱裂解法提取质粒pET-32a(+).用限制性内切 酶EcoRI和HindIII酶切pET-32a(+)和PCR产物, 试剂盒SpinPrepGelDNAKit纯化酶切产物.按载体 与插入片段比为l3混合,T4DNA连接酶连接,构 建表达质粒PrP-pET-32a(+),TSS法转化E,coliDH5tz. 使用测序通用引物T7promoter菌落PCR筛选 PrP-pET-32a(+)阳性克隆,序列分析. 1.1.4小尾寒羊prpc核心片段Trx—PrP27—30的诱导 表达PrP-pET-32a(+)转化表达菌E.coliBL21 (DE3),挑取10个菌落接种LB培养基(100g.ml. 氨苄青霉素),37~C活化过夜,按1:10的比例接种新 鲜TB培养基(100lag,ml氨苄青霉素),25"C培养至 OD600约为1.5.加入IPTG诱导1h,3h,4h,5h 和过夜,分别取菌液8Hl进行12%SDS—PAGE电泳鉴 定. 取1rnlE,coliBL21表达菌超声波裂解,按 Novagen公司((pETSys~mManua1))提供的方法,研 究融合蛋白Trx—PrP27—30在细胞周质,细胞质和包涵 体中的分布.12%SDS—PAGE电泳分析,Quantity One一4.40软件灰度扫描,计算融合蛋白Trx—PrP27—30 占总蛋白的相对含量. 1.1.5重组融合蛋白的纯化及蛋白切割,回收按 1.1.4方法用100ml菌体,诱导4h,收集菌体,M 4期张永强等:小尾寒羊骚痒病单抗制备及免疫组化检垦生垄! 离子亲和层析纯化试剂盒裂解菌体,提取包涵体蛋白, 裂解包涵体,纯化,回收融合蛋白Trx?PrP27—30,冻 干保存.12%SDS.PAGE凝胶电泳分析. 1.1.6Western—Blot鉴定融合蛋白Trx.PrP27?30参 照文献[6】的方法将融合蛋白Trx.PrP27—3O进行 SDS—PAGE电泳,转移蛋白至NC膜,5%脱脂奶封闭, 与F89单抗一起40C孵育2h,洗涤,加入兔抗鼠酶标 二抗进行反应,DAB显色. 1.2PrW核心片段单克隆抗体及腹水单抗的制备 1.2.1实验动物PrW一基因敲除小鼠引自瑞士L5J; Balb/c小鼠购自山东中医药大学实验动物中心. 1.2.2试剂弗氏完全佐剂,弗氏不完全佐剂,高糖 型DMEM粉,融合用PEG(MW4000)均为sIGMA 公司产品;次黄嘌呤,胸腺嘧啶核苷和氨基喋呤为 Gibco公司产品;其余常规试剂为国产分析纯试剂. 1.2.3骨髓瘤细胞SP2/0的准备细胞融合前一周 复苏冻存于液氮中的SP2/0,在20%IJ~牛血清HT培 养基和5%co~培养箱中培养,每天观察生长状况,融 合前调整至对数生长期. 1.2.4动物免疫与细胞融合将纯化的重组小尾寒 羊PrPc核心片段与等量弗氏完全佐剂充分乳化后,腹 部皮下多点注射6周龄PrP基因敲除小鼠,20g/只; 2周后腹部皮下多点注射相同剂量弗氏不完全佐剂充 分乳化的纯化重组蛋白;14d后腹腔追加注射5g纯 化重组蛋白,3d后无菌取脾脏进行细胞融合I7】. 1.2.5阳性杂交瘤细胞的筛选与腹水单抗制备参 照文献【8],采用间接ELISA方法对长有杂交瘤细胞的 孔进行筛选,纯化的重组小尾寒羊Pr]Pc核心片段为包 被抗原.初步检测为阳性的孔,进行24孔板扩大培养; 检测仍为阳性的孔,采用有限稀释法进行2次亚克隆; 取形态良好,生长旺盛的单克隆细胞6孔板扩大培养, 一 部分用于液氮冻存,另一部分用于单抗腹水的生产. 取青壮年Balb/c小鼠,制备腹水单抗. 1.2.6单抗特异性鉴定Western—Blot参照文献【6】, 重组小尾寒羊PrW核心片段SDS—PAGE电泳,转印至 NC膜,5%脱脂奶4"C封闭过夜,在腹水单抗中孵育2 h,酶标二抗中孵育1h,DAB显色.腹水单抗做1: 2000稀释.酶标二抗做1:8000稀释. 1.2.7单抗检测牛羊脑组织中的PrW参照文献[6】, 提取羊脑组织中的蛋白质,进行SDS.PAGE电泳并转 印至PVDF膜;5%脱脂奶4"C封闭过夜,TBST洗涤 5次,3rnjn/次;加入腹水单抗1.5h,TBST洗涤1O 次,3rnjn/次;加入生物素标记二抗1h,TBST洗 涤10次,3min/次,采用化学发光法进行X底片曝光. 1.3免疫组化检测羊痒病方法的初步建立 1.3.1试剂免疫组织化学显色系统,封片剂为 DAKO公司产品;蛋白酶K及其阻断剂为SIGMA公 司产品;对照用单抗F89为美国农业部动物病研究所 传染性海绵状脑病实验室赠送;其余为常规国产分析 纯试剂. 1.3.2阳性及阴性样品羊痒病阳性脑组织样 品引自美国农业部动物病研究所传染性海绵状脑病实 验室,阴性脑组织样品采自国内健康小尾寒羊. 1.3.3免疫组化检测羊痒病方法的操作规程方法 参照农业部动物检疫所外来病检测中心制定的国家标 准(GB,1rl9l80—2003). 采样:固定牛头,使脑部暴露,取出整脑. 固定:将脑组织浸入l0倍体积固定液中,7d后 更换固定液, 制备石蜡切片:将固定好的组织块修整,选取脑 闩部放入流水中漂洗24h;脱水:75%乙醇中2h,85% 乙醇中2h,95%乙醇I中2h,95%乙醇II中,100% 乙醇I中2h,100%乙醇II中2h;透明:香柏油12h, 二甲苯I中1h,二甲苯II中1h;浸蜡:软蜡中4Omin, 硬蜡中2h;放入包埋盒包埋,冷却过夜;切片;载玻 贴片. 脱蜡:二甲苯I,II依次10min,100%乙醇I, II,95%乙醇,85%乙醇,75%乙醇依次2min,自来 水2min,PBS洗3次(5min/次). 蛋白酶K消化:将切片放入蛋白酶K中37?消 化,15min. 水化高压:121?,20min,自然冷却,PBS洗3 次(5rain/次). 内源酶灭活:甲醇一双氧水中室温处理5min, PBS洗3次(5min/次). 封闭:加5%猪血清到切片上,湿盒中室温20min. 单抗孵育:将切片放入1:12000稀释的单抗溶 液中37~C孵育4h或4?过夜;PBS洗3次(5min/次). 显色:操作按DAKO试剂盒. 封片:DAKO公司专用封片剂封片. 结果判定:光学显微镜下观察切片.阳性结果: 脑闩部的迷走神经背核,孤束核和三叉神经脊束核等 处出现对称性紫红色染色颗粒,则该样品判为Scrapie 阳性.反之为阴性. 2结果与分析 中国农业科学39卷 2.1重组小尾寒羊PrP.核心片段在大肠杆菌中的表 达 诱导表达结果显示出1条约35kD的蛋白条带. 随时间的增加表达量逐渐增加,4h融合蛋白可占细菌 总蛋白的40%,过夜诱导融合蛋白表达产量最高可占 细菌总蛋白的46.9%. 2.1.1融合蛋白Trx—PrP27—30的分布融合蛋白 Trx—PrP27—30几乎全部分布于包涵体中,细胞周质和 细胞质中几乎无Trx-PrP27—30(图1). 48 33 25 1为pET-32a(+)对照;2为渗透休克上清;3为全菌裂解上清;4和5 为全菌;6和7为包涵体;M为蛋白分子量标志;8和9为纯化融合蛋 白 1ispET-32a(+)control:2isosmoticshocksuspension~3iscelllysis suspension:4and5arewholecell:6and7areinsulionMispro~in illarklgr~8and9arepurificationoffusionproteins 图1融合蛋白Trx-PrP在细菌,coliBL21(DE3)内的 分布 Fig.1ThecellularlocalizationofTrx-PrP27-30inE.cofiBL21 (DE3) 2.1.2Western—Blot鉴定小尾寒羊P核心片段经 Western—Blot鉴定,在35kD处出现阳性条带,证明所 得蛋白为小尾寒羊P核心片段Trx-PrP27—30(图2). 2.2PrP.核心片段特异性单克隆抗体制备 2.2.1阳性杂交瘤细胞筛选结果经筛选,共选出6 株能稳定分泌针对重组小尾寒羊Pr]Pc核心片段特异性 单克隆抗体的杂交瘤细胞株(2H3,4C6,5Fll,7F1, 7F8和7Fl1).腹水单抗均具有很好的ELISA反应性. 2.2.2单抗特异性鉴定结果图3结果显示,在35 kD处出现阳性条带,与重组小尾寒羊Pr】Pc核心片段 相对分子质量一致,说明腹水单抗2H34C6,'5F11, 7F1,7F8和7Fll均可特异识别重组小尾寒羊Pr]Pc核 心片段. 2.2.3Western—Blot检测健康羊脑组织中Pr]Pc结果 图4结果显示,在相对分子质量37到27kD处 2H3,4C6,5Fll,7F1,7F8和7Fll均出现阳性条带, 说明6株单抗均可特异识别健康羊脑组织中的PdPc. 2.3单抗介导羊痒病的免疫组化检测方法 图5结果显示,在单抗2H3,4C6,5F11,7F11 检测的阳性切片中观察到脑闩灰质区出现成片红色染 色颗粒.在光镜下可观察到在脑闩灰质区呈对称分布, 与国际兽疫局(Ore)规定的TSE阳性描述【9]完全符 合,阴性对照切片此处无此现象.经5次重复实验, 结果一致.说明单抗2H3,4C6,5F11,7Fll可特异 性识别羊痒病脑组织中PdPsc. 12M3456M78 1和2为Western.Blot鉴定包涵体;3和4为We,stem.Blot鉴定纯化融合 蛋白;5和6为包涵体;7和8为纯化融合蛋白;M为蛋白分子量标志 1and2areinsuliondetectedbyWestem-Blot:3and4arepurificationof fusionproteindetectedbyWestern-Blot:5and6areinsulion:7and8are purificationoffusionprotein:Misproteinmarker 图2Western—blot鉴定重组小尾寒羊prp=核心片段 Fig.2Western-blotidentification 1【I) 48 33 25 1,2,3,4,5,6泳道分别为7F8,5Fll,4(26,2H3,7F1和7Fll 1,2,3,4,5.6are7F8,5Fll,4C6,2H3.7F1and7Fl1separately 图3Western—bIot鉴定腹水单抗 Fig.3Western-blotidentification D;.罟81 9 4期张永强等:小尾寒羊骚痒病单抗制备及免疫组化检测方法的初步建立823 图4Western-bIot检测健康羊脑组织中prp~ Fig.4Western—blotdetectionPrPcofovine 3讨论 目前,国际上权威的TSE检测方法为Western—blot 和IHC,都是以单抗介导的抗原,抗体反应,因此制 备PrPc核心片段的亲和力强,特异性好的单抗成为所 有工作的重点,然而PrP蛋白在很多动物中是一个非 常保守的蛋白,容易产生免疫耐受,因此单抗制备也 是一个难点.SilkeHarmeyer等【?】人工合成羊Pr】Pc16 段小肽,偶联载体抗原,利用淋巴细胞杂交瘤技术筛 选单抗,分别得到针对89—104,145—163,209—228肽 段的单抗.Alejandro等【】4]~lJ备的单抗2A11(针对牛 A.2H3单抗IHC40~;B,C,D.分别为4C6,5F11,7F11单抗IHC100×:E.F89单抗阳性 对照IHC100×;E阴性对照,IHC100× A.Detectedbymonoelonalantibody2H3,IHC40x;B,C.Dweredetectedbymonoelonalanti body4C6.5F11,7F11separately,IHC100x,EandFispositiveand negativecontrolseparately,positivecontrolsampledetectedbymonoelonalantibodyF89,ne gativecontrolsampledetectedwithoutmonoelonalantibody,IHC lOOx Fig.5 图54种单抗检测羊痒病脑组织中的PrP s仃ydetectionofPrP~bymonoclonalantibody2H3,4C6,5F11and7F11inScrapie PrP171—179,羊163—171)在mC中对经PK酶消化的 BSE切片敏感,但检测不到无PK酶消化的TSE切片 和正常牛脑中的PrP.另外,有人曾报道单抗15B3只 识别PrW,对PrPc不敏感【l51.EustacheParamithiotis 等[161认为因蛋白质结构改变而导致的疾病中,有些内 部的氨基酸序列可能会暴露,他们制备了能选择性识 别PrW的单抗(针对朊蛋白序列中在3个位置出现的 ryr-ryr-Arg).最近,AndreaMatucci等人【l71通过将人 PrP23—231免疫Prt~)/O基因敲除小鼠得到了两株单抗, SA65识别位点在ahelixl,特点是在包埋后用胶体金 进行的免疫检测成功后,能在超微结构下标记PrP, 利用此单抗可研究PrP在黏膜上亚细胞水平的定位, 建立更有效的诊断技术;SA21单抗识别位点在 ahelix2中的165,185之间,其特点是只可识别无糖 基化PrP和在第2位出现单糖基化的PrP,可用于研 究prion病中糖基化的作用和探索在不同的TSE中每 一 个位点如何糖基化的. 笔者通过PCR扩增,大肠杆菌表达,单抗制备, 免疫组化方法一系列试验,系统的建立了中国羊痒病 的检测方法.同时,由于制各单抗所用抗原为中国小 中国农业科学39卷 尾寒羊PrPc核心片段序列,因此单抗特异性更高,更 适合中国羊痒病的检测,而且由于被免疫动物用的是 瑞士的PrPc基因敲除小鼠,因此也保证了单抗的高亲 和力. 4结论 LiuXEApplicationofMonoclonalAntibodyinAgriculture.He fei:An'huiTechnologyPress,1994.(inChinese) [91刘雨田,邹艳丽,王志亮.免疫组化法检测我国疯牛病结果初报. 中国动物检疫,2002,l9(4):25-27. LiuYZouYL,WangZL.APreliminaryreportonBSEdetection 本实验通过PrPc核心片段原核表达,杂交瘤细胞 融合技术制备单抗,最后初步建立了中国羊瘁病的免… 疫组化检测方法,经5次重复免疫组化检测阳性和阴 性切片,以笔者所制备单抗为核心试剂与国际通用单 抗F89结果完全一致.初步建立了中国自主知识产权 的羊痒病免疫组化检测方法.为有效抵御羊痒病的入 侵提供了强有力的物质和技术保障. Reforoncos 【l】AguzziA,PolymenidouM.MammalianPrionBiology:Onecentury ofevolvingconcepts.Cell,2004.116:3l3-327. 【2】王小军,张海涛,鲍恩东.牛海绵状脑病(疯牛病)的诊断技术 和神经病理学研究现状.畜牧与兽医,2002,34:35—37. WangXJ,ZhangHBaoED.Diagnostictechnologyofbovine spongiformencephalopathy(madcowdisease)andtheresearchfor neuropathology.AnimalHusbandryandVeterinaryMedicine, 2002, 34:35-37.(inChinese) 【3】PontiW,SalaM,PolleraC,BraldaD,Poli1G.BareggiS.Invivo modelfortheevaluationofmoleculesactivetowardstransmissible spongiformencephalopathies.VeterinaryResearchCommunications, 2004,28:307—310. 【4】AguzziA.Understandingthediversityofprions.NatureCellBiology. 2004,6(4):290-292. [51RossiD,CozzioAEckhzarF'KleinMA.RiilickeAguzziA. 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