硕士论文--介孔氧化钛晶须固载γ-谷氨酰转肽酶及其应用

硕士论文--介孔氧化钛晶须固载γ-谷氨酰转肽酶及其应用 硕士论文--介孔氧化钛晶须固载γ-谷氨酰转肽酶及其 应用 ::. 摘 要 ...是生物体内 一谷氨酰转肽酶丫,, 谷氨酰循环中的关键酶,可特异性催化,.谷氨酰基的转移反应,对各种肝胆疾病 均有一定的临床价值。同时,由于催化的转肽反应具有位点特异性和光学 选择性强,无需对反应物进行保护和脱保护,反应过程中也不消耗等特点。 因此,利用该反应制备系列.谷氨酰基类化合物的研究已成为工业生物催化领域 的研究热点。但由于是~个异源二聚体糖蛋白,在体外催化环境下易发生 亚基解聚,稳定性比较差;同时,催化剂的成本较高也限制了其在生物催化领域 的广泛应用。 大量的研究证实,采用固定化酶技术不仅可实现酶制剂的回收和重复使用, 利于生产工艺的连续化、自动化,同时也可有效提高酶的稳定性。吸附固定法是 利用载体表面活性基团与酶分子间的非共价相互作用如氢键、疏水相互作 用、 静电相互作用等实现酶的固载,该方法具有反应条件温和、操作简便、酶活回 收率高、载体可再生等优点。 近年来,二氧化钛介孔材料作为一种新型的高性能材料在光催化、吸附、分离等领域的应用备受关注。其中,介孔氧化钛晶须 ,具有均一且可调的中空孔径、巨大的比表面积、表面富含羟 基、化学稳定性好、结构稳定、机械强度高等优点,为酶的固定化提供了良好的 操作背景。 为此,本论文首先利用自行筛选、保藏的枯草芽孢杆菌. .发酵 获得,经分离纯化后获得电泳纯的;以具有不同孔结构的为载 体,进行的吸附固载,考察载体结构特性以及固定化条件等对酶固定化效果 的影响,优化酶固定化反应条件,并对固定化酶的结构进行表征,分析固定化酶 在转肽反应条件下的催化特性、酶活衰减及其四级结构的稳定性;在此基础上, 本文进一步将固定化应用于茶氨酸合成体系,并建立优化的反应工艺。 具体研究结论如下: . 通过发酵及纯化获得了电泳纯. ,并以为载体对其进行吸附固定化,确定最适固定化条件为:载体最可几孔径 ,给 酶量。 ,固定化酶活回收率可达.%, /,在常温下反应。 载体载酶量达. /。 利用场发射扫描电镜.、比表面和孔径吸附测定仪和 傅立叶变换红外光谱仪.观察载体和固定化酶结构。结果表明,固定化 后酶分子在载体表面和微孔道中均有一定分布,且酶分子与间是通过氢 键相互作用连接的;采用圆二色光谱仪测定固定化前后的二级结构, 结果表明固定化后的二级构象变化很小。 以的专一性不可逆抑制剂’ ,对游 离酶和固定化酶迸行活性位点滴定,其活性位点浓度分别为. /和 . /,固定化的活性位点浓度为游离酶的.%,表明该固定 化方法对酶活性中心的扰动较小。 分别测定了游离酶和固定化酶的温度稳定性、稳定性及操作稳定性。 、 结果表明,固定化后的稳定性较游离酶显著提高,在下保温贮藏 经个批次转化后,固定化酶活力仍可保持初始值的.%。 分别测定了游离酶与固定化酶的反应动力学和热力学常数。结果表明, 与游离酶相比,固定化的对供体的亲和力常数‰和酰基化反应 /,相 活化能厶均有所升高,而固定化的失活反应活化能玩为. 比于游离酶, /有明显的增加,表明通过固定化能确能显著提高酶 的热稳定性,大幅减少酶的受热失活。 以.谷氨酰胺为谷氨酰基供体,乙胺为谷氨酰基受体,以. 茶氨酸为目标产物,对酶法合成茶氨酸的工艺条件进行了初步研究,考察了、 温度、供体/受体摩尔比以及酶浓度等条件对反应过程的影响。结果表明, 反应 的和温度对的转肽活性影响较大,本体系下转肽反应的最适为., 最适反应温度为?左右。当浓度为. /,乙胺摩尔浓度为 左右,产物 /,酶浓度为. /,为.时,在?下反应。 浓度达最高值,此时茶氨酸的转化率相对于为.%,而在相同条件下 以游离酶为催化剂时,茶氨酸的转化率仅为.%。 分别测定了游离酶和固定化酶对供体和产物茶氨酸的亲和力常数/,均较游 离酶分别为. 分别为,./和%,. /和. /有所升高。其中,固定化对产物茶氨酸的亲和 力常数相比于游离酶上升更为明显,这从一个侧面解释了固定化酶催化体系 下茶 氨酸实际转化率更高的原因。 关键词:丫谷氨酰转肽酶;固定化;介孔氧化钛晶须;茶氨酸 /: ... ./ , ., ,, ’. , . ,. , . ,.%. , ,, 【曲 . ,,, , . . ,? ,. ,, . : .., ?. /, .%. / / . .,??. .. . ,. .‘一,. . % . . .% , . . , ..., . ’一.. . ?.. . ‘一,. ? ..% 、. /, /, /.. ? . . , . % . , ? : ,. /, . /... . /,, . . . , . ; :;; : 目 录 摘要..?. 第一章文献综述??. . ,.谷氨酰转肽酶的研究背景.. 的分布?.. .. 的结构特点?.. .. 的催化机理和酶学性质??.. .. 的应用一 .酶的固定化技术. ..酶固定化技术的发展历程.. ..固定化酶的特点?一 ..酶的固定化方法及常用载体??.. ..酶固定化技术的研究热点一 .介孔氧化钛晶须材料?. ..氧化钛材料概述?.. ..介孔氧化钛的应用一 ..介孔氧化钛晶须的结构及性能?一 .本课题的研究内容及意义第二章介孑 晶须固载的制备和结构表征 .实验材料 ..主要实验试剂..主要实验仪器.实验方法 .. . . 的制备??.. . 酶活测定..蛋白浓度的测定?..固定化酶的制备? ..蛋白固定率. ..酶活回收率 ..固定化酶的表征? ..圆二色光谱 ..固定化活性位点滴定??.. .结果与讨论.. 在上的固定化条件 ..固定化前后载体表面的结构变化 ..固定化前后载体及的红外光谱分析??.. ..固定化前后的圆二色光谱.. .. 的活性位点滴定.本章小结 第三章?的催化特性和稳定性分析?.. .实验材料 ..主要实验试剂..主要实验仪器.实验方法 .. 酶活测定..固定化酶的制备? ..固定化酶的稳定性 ..作用最适 ..作用最适温度??. .. 酰基化反应动力学常数的测定.. 酰基化反应活化能的测定? .. 热失活曲线与失活动力学和热力学参数的测定? .结果与讨论..固定化的稳定性?.. ..固定化的催化特性.. .本章小结 第四章固定化催化合成茶氨酸 .实验材料 ..主要实验试剂..主要实验仪器.实验方法??... .. 酶活测定..固定化酶的制备? ..茶氨酸的检测方法 .. 对反应的影响? ..温度对反应的影响 ..供/受体摩尔比的影响..酶量对反应的影响 ..酶促反应动力学参数的测定.结果与讨论.茶氨酸的液相分析方法? ..反应的影响?, ..反应温度的影响? ..反应供受体摩尔比例的影响..酶量对反应的影响 。。 催化合成.茶氨酸反应过程动力学参数的测定? .本章小节 第五章结论与展望? .结论??. .展望参考文献发表文章.:复衣义早??’ 致 谢?硕士学位论文 第一章文献综述 .丫.谷氨酰转肽酶的研究背景 .. 的分布 丫.谷氨酰转肽酶丫一,,..。.。在不同生物 体内的分布不同。在真核生物中,主要是以结合酶的形态存在捌。如人体内, 它存在于肾、胰、肝、脾和小肠等组织的微绒毛膜上,其含量分布大致为: 肾 胰肝脾吲。昆虫中的与哺乳动物中的一致,亦是膜结合酶, 存在于微粒体中。真核生物的在水中是不溶的,但经过有机溶剂或酶处理后 可变成水溶性的。原核生物中,酶能溶解于水,且主要存在于细胞浆液中或分 泌 到细胞外。在不同菌属的细胞中分布的位置也不同。如在大肠杆菌中,酶主 要存在于周质空间,而对于枯草芽孢杆菌,则可以分泌到细胞外【】 .. 的结构特点 是一个异源二聚体糖蛋白,由~个大亚基约?和一个小亚基约 组成【。不同来源的分子量可能会有较大差异,且活性也会有较大 差异。等?通过对 .的两个亚基的研究发现,大小两个 亚基均具有转肽酶的活力,但把两个亚基拆开以后大亚基具有较高活力,而小亚 基活力较低,但均远远低于两个亚基结合时的活力。 的活性中心有个独立的活性亚位点,分别是.谷氨酰结合位点、半 胱氨酰和甘氨酰基的结合位点【】。,.谷氨酰结合位点位于酶的分子质量相对较小 的亚基上,主要与吖.谷氨酰基、吖.谷氨酰基和..甲基.谷氨酰基化合 物相结合;半胱氨基的结合位点只与中性氨基酸作用,与有侧链的氨基酸结合较 差,易于结合芳香族氨基酸和必需氨基酸,与.脯氨酸和【.取代的氨基酸不起 作用;而甘氨酰基结合位点对甘氨酸有专一性,与别的氨基酸结合能力很弱】。 年,等分析了大肠杆菌. .的晶体结构,认为其 催化残基是位于小亚基端的,.、.、和 是与底物结合有关的重要残基【。 .. 的催化机理和酶学性质 不同来源的虽然可能分子量和活性有所不同,但其催化特性和专一性 是很相似的。酶学研究表明,只对含,.谷氨酰基的化合物有光学和立体专第 一章文献综述 。 一性催化作用,且催化过程不需要【 研究表明,的催化机制遵循乒乓机制。的催化残基上的首先 亲核攻击谷氨酰供体上,.位上的羰基碳原子,形成谷氨酰基化的酶分子与谷 氨 酰基以酯键连接;然后在受体亲核基团如.攻击下形成新的谷氨酰基化 合物,并释放出酶分子。该反应称为“,一谷氨酰基化反应丫”。 根据受体底物的不同,.谷氨酰基化反应可分为三类】: 转肽反应:受体为.氨基酸或二肽及带【.氨基的小 分子化合物等; 自转肽反应:当供体分子同时作为受体分子时。 例如谷氨酰胺,可同时作为供体与受体; 水解反应:受体分子为水分子时,其产物为谷氨酸。 其中,水解反应的最适为.~.,而转肽反应的最适为.~., 来源于细菌的的转肽反应范围较宽为.~.。 .. 的应用 在生物体内,可以通过催化转肽生成,.谷氨酰氨基酸,这些氨基酸将通 过谷氨酰循环转运到细胞中。利用这一性质,.谷氨酰转肽酶在临床诊断和氨 基 酸衍生物合成方面有着重要的应用。 临床医学上的应用 在哺乳动物体内是细胞分泌酶,主要存在于肾、胰、肝、肠和脑组织 中。在肝内,主要存在于肝细胞浆和胆管上皮中,在胆汁淤积、炎症等刺 激下,肝脏合成丫.谷氨酰转肽酶增加,所以丫.谷氨酰转肽酶活性改变对于肝胆系 统疾病的诊断具有一定的价值?。 血液中的主要来自肝胆胰等,此酶不能透过肾小球因而不能从尿中排 出;尿液主要来自肾脏,很可能来自肾的近曲小管,它不进入血液循环而 直接从尿中排出卫。同时进行尿、血,.谷氨酰转肽酶检测,有利于肾病与尿路 感染的鉴别,也有利于肾病与肝胆胰等其它疾病的鉴别。 在特定条件下,会大量释放到血液中,这一性质在临床可用来检测组 织细胞是否发生了病变,同时还可以作为细胞分化、细胞老化的有效检测指标。 在生物合成中的应用 硕士学位论文 在催化合成丫.谷氨酰基化合物时具有位点专一性强,无需对底物进行 保护和脱保护,反应中不需要辅酶,不消耗,反应过程可在细胞外水 溶液中进行等优点,因此有着巨大的应用价值。 目前,利用的转肽催化作用已合成了谷胱甘肽、..谷氨酰.牛磺酸、 丫..谷氨酰?色氨酸、茶氨酸、丫.谷氨酰.一多巴、,一.谷氨酰..半胱氨酸等,一 . 谷氨酰基化合物.】。其中,等人利用来源于基因工程菌. 高活力的,催化转肽反应得到的,..谷氨酰..色氨酸和丫..谷氨酰..多巴 的收率可高达%和%【】。利用的催化水解作用,可以制备得到氨基 头孢菌烷酸】。 氨基酸改性 ,..谷氨酰.氨基酸在水中的溶解性能一般均好于其原来的氨基酸。在所有的 氨基酸中,.型的芳香氨基酸、碱性氨基及有支链的氨基酸通常带有苦味。在这 些氨基酸中就有人体所必需氨基酸,如苯丙氨酸。将其.谷氨酰基化后形成的二 肽不再有苦味,而变成了类似柠檬口感的酸味。因此,对那些有苦味的氨基酸可 通过.谷氨酰基化对其进行风味的改变。等人利用来源于基因工程菌 . .的对苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸及组氨酸进行了改性,其中苯 丙氨酸的效果最为显著【。 .酶的固定化技术 ..酶固定化技术的发展历程 酶固定化技术是一项新的生物技术,它是通过化学或物理的处理方法,使游 离酶和固态的水不溶性载体相结合或被包埋,将酶束缚或限制在一定的区域内, 使酶分子在此区域进行特有和活跃的催化作用,并可回收及长时间重复使用的一 种学科技术】。 酶固定化技术研究始于年,正式研究于世纪年代,年代已经 在全世界普遍开展。 年和】首先发现酶不溶于水而具有活性 的现象,他们发现被骨碳粉末吸附的酵母蔗糖酶仍具有催化活性。当时,固定化 酶的报道不足篇。年和以应用为目的开始进行了固 定化酶的研究工作,他们将羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合在修 饰过的聚苯乙烯树脂上,实现了酶的固定化。年,千炯一郎【】首先使用固第一章文献综述 定化氨基酰化酶生产.氨基酸,实现了固定化酶的工业规模应用。此后,固定 化酶研究开始在世界范围迅速发展,该项技术被广泛应用于工业生产、医学、环 保、和污水治理等方面。 ..固定化酶的特点 酶经固定化后,与游离酶相比具有以下优点: 可重复使用,酶的使用效率得到提高,使用成本降低。在现今纯化酶成 本较高的时期,酶的可重复使用性可以最大限度的降低酶工业化应用中的成本; 易与反应体系分离。由于酶分子与不溶性的载体作用形成固定化酶,因 此可以在反应结束后,快速有效的实现从反应环境中分离出来,获得不被酶污染 的、纯度较高的生成物,简化了产品的提纯工艺,提高产率,产品质量较好; 稳定性得到较大提高,可较长期地使用或贮藏。固定载体都是水不溶性 物质,使得固定化酶具有一定的机械强度,可以搅拌或装柱的方式作用于底物溶 液,使反应过程能够管道化、连续化和自动化。 酶的催化反应过程更容易控制。只要将固定化酶与反应环境分离就可终 止反应,使得固定化酶的催化反应过程更加容易控制,例如:当使用填充式反应 器时,底物不与酶接触,即可使酶反应终止。 更适合多酶体系的使用。可以更好的实现多种固定化酶共同作用催化形 成产物,因此不仅可利用多酶体系中的协同效应使酶催化反应速度大大提高,而 且还可以控制反应按一定顺序进行。 但是,固定化酶也有其局限性:固定化时酶活力有一定损失,增加了酶利用 成本:适宜于溶解性底物和小分子底物反应。酶或多酶反应体系固定化后常常会 引起酶性质的改变,这主要是由于?固定化后酶活性中心的氨基酸残基、空 间结 构和电荷状态发生改变;?载体的理化性质对固定化酶周围微环境产生影响,如 形成能对底物传递产生影响的扩散层或静电作用,载体空间障碍以及多孔类载体 的内扩散限制等。这些影响主要表现在底物专一性的改变,及温度稳定性 和最适条件的改变,动力学常数的改变等。 ..酶的固定化方法及常用载体 酶的固定化方法很多,可将其分为四大类:吸附法、共价结合 法?、交联法、包埋法。 硕士学位论文 吸附法 利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面而使酶固定化的方法称为 吸附法。吸附法是最早出现的酶固定化方法,包括物理吸附和离子交换吸附。该 法条件温和,酶活力部位及其空间构象不易被破坏,因此固定化后对酶的催化活 性影响小’删。但酶和载体之间结合力弱,由离子键、氢键、偶极键及疏水键固 定的酶易受反应介质的、离子强度等的影响而从载体上脱落,从而污染催化 反应产物,使用受到一定的限制。 常用的无机载体有多孔玻璃、活性炭、漂白土、高岭石、氧化铝、硅胶、磷 酸钙、金属氧化物等,常用的天然高分子载体有淀粉、白蛋白等。近年来大孔型 合成树脂和陶瓷等也开始逐渐成为常用的物理吸附载体。 包埋法 载体与酶溶液混合后,借助引发剂进行聚合反应,通过物理作用将酶限定在 载体的网格中,从而实现酶固定化的方法称为包埋法。包埋法分为网格型和微囊 型两类,网格型包埋法将酶包埋于高分子凝胶细微网格内,微囊型包埋法将酶包 埋在高分子半透膜中制备成微囊型。包埋法一般不需要载体与酶的氨基酸残基进 行结合反应,改变酶的空间构象的可能性较小,酶活回收率较高,但固定化酶易 漏失,存在扩散限制等问题,催化反应受传质阻力的影响,不宜催化大分子底物 的反应。 常用的载体有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光敏树脂等合成高分子化合物以及淀 粉、海藻酸和角叉菜胶等天然高分子化合物,以及硝酸纤维素、聚苯乙烯和聚甲 基丙烯酸甲酯等。 交联法 通过双功能或多功能基试剂使酶分子和试剂之间形成共价键,得到三向的交 联网状结构的固定化方法称为交联法。交联法反应条件比较剧烈,酶活回收率一 般比较低‘蚓。 常用的交联剂有戊二醛、异氰酸衍生物、双氮联苯等。 共价结合法 酶分子的非必须基团与水不溶性载体表面的活性功能基团通过形成化学共价 健实现不可逆结合的酶固定方法称为共价结合法。共价结合法所得的固定化酶与第一章文献综述 载体连接牢固,有良好的稳定性及重复使用性,成为目前研究最为活跃的一类酶 固定化方法。但反应条件较为剧烈,会引起酶蛋白空间构象变化,破坏酶的活 性部位,因此往往不能得;:较高的酶活回收率。 常用的固定化介质可分为骨架和功能基团两部分,骨架一般为水不溶性的高 聚物,功能基团种类则多种多样,如氨基,羧基和环氧基等。 新型固定化方法 通过辐射、光、等离子体、电子等新方法在较为温和的条件下进行酶的固定 化,制备高活性固定化酶,尽量减少或避免酶活力的损失的新型固定化方法已受 到越来越多的关注。】。 综上所述,不同的酶固定化方法在制备过程、酶与载体结合方式等方面存在 着差异,因而导致固定化酶的催化特性和使用性能也有所不同。表对各种常见 的酶固定化方法进行了比较。 表各种固定化方法的优缺点比较 由此可见,没有哪一种酶固定化方法是具有全面优越性的,在实际运用中应 根据酶的基本特性以及反应体系的需要加以灵活选择。 ..酶固定化技术的研究热点 近年来,开发简便、温和、适用的固定化方法,设计、合成性能优异的固定 化载体已成为酶固定化技术研究的新热点【?。具体内容包括: 对已有固定化方法的改进。在底物反应液中加入维生素可以提高固定 化葡萄糖氧化酶的使用性能。调节固定化酶催化反应体系的值,使固定化 酶有一个最适的反应微环境,也可以有效地提高固定化酶的催化能力引。等离子硕士学位论文 体处理聚丙烯膜接枝丙烯酸后用于固定化胰蛋白酶可使固定化酶的操作稳定性 达批次,储存稳定性达到天。用柔性高分子链接枝于载体表面制得柔性 固定化载体,再将它以共价键合的方式进行酶的柔性固定化,此技术可改善因刚 。 性固定化使酶失活的缺陷,并提高固定化酶的自由度【 合成新型固定化载体。采用线型聚合物致孔法合成了球状特大孔丙烯腈 .醋酸乙烯酯共聚物.树脂,再转化为聚丙烯偕胺肟一聚乙烯醇载体固 定化嗜热菌蛋白酶,结果表明固定化酶活性随载体孔径的增大而提高 。以普通 微球制备.树脂,再接枝双醛淀粉或戊二醛,进行木瓜蛋白酶 的固定化,酶活收率较常规方法提高倍左右【。 .介孔氧化钛晶须材料 ..氧化钛材料概述 二氧化钛本身由于化学稳定性高、耐光腐蚀,并且具有较宽的价带能级,催 化活性好,可以使一些吸热的化学反应在光辐射的表面得到实现和加速, 加之对人体无毒无害,通常成本较低,所以对纳米二氧化钛的光催化研究 非常活跃。纳米尺度的二氧化钛由于颗粒细化产生了许多与普通二氧化钛不同的 物理化学性质,它具有高比表面积,高表面缺陷以及高表面能,其能隙增宽,氧 化还原势增大,光催化反应驱动力增强,电子从晶体内部到达晶体表面的时间大 大缩短,降低了电子一空穴对复合的几率,导致光催化活性提高。因此,纳米 尺度的二氧化钛在紫外线吸收剂、高效光敏催化剂、水处理、精细陶瓷、生态陶 瓷及气敏传感器元件等领域具有广泛和潜在的应用前景】。 然而,单纯的二氧化钛纳米粉体有着难以克服的缺点,若尺寸过大,难以达 到理想效果,而尺寸过小则容易团聚。与此相比,介孔氧化钛材料具有巨大的比 表面,不需解决分散问题,易掺杂或负载其它元素而彰显出优势。 ..介孔氧化钛的应用 与纳米相比,介孔材料具有更大的比表面和孔体积,更好的热稳 定性和水热稳定性,以及其发达有序的孔道结构,孔径均一、可调,表面易于改 性等特性,是一种更为高效的光催化材料;此外,介孔结构更利于反应物和产物 的扩散,使其广泛应用于催化、吸附、分离等领域。介孔材料除可作光催化第一章文献综述 剂外,在光电转化材料,化学传感器等方面有望发挥更大的作用。 光催化剂 作为光催化剂尤其用于环境污染物的处理是近年研究的热点之一。己有 资料,介孔比纳米具有更高的光催化活性。发现以中性胺 为模板剂合成的介孔分子筛.对氯酚类污染物具有较高的光催化降解 作用,可完全降解,,.三氯酚。等通过在空气中丙酮的光氧化反 应证明介孔薄膜比纳米薄膜具有更高的光催化活性。 光转化材料 由于稳定、无毒、易成膜,成为选择最多的半导体电极膜材料。染料 敏化的介孑 太阳能电池替代传统的固态电池具有经济、高效的特点【。在 染料增感电池中,的介孔结构对吸收太阳光起重要作用,可有效增大电极感 光度。吸附的染料经光激发引起染料和电解液一般为碘化物/碘化物的连续氧 化还原反应,结果光能转化为电能。选择染料可使太阳能电池转换效率达到普通 电池的几百万倍。文献报道了用钌一联吡啶衍生物.,’一二经基?,’ 二吡啶氰硫基钌作光敏剂,阴极负载介孔膜的染料增感化学电池,由 于介孔膜具有很大的内表面积,在整个可见光区和近紫外区都有明显的光 吸收,且使光引发的电荷定量分离在几飞秒之内完成。这种新型太阳能电池的光 电转化效率可达%。 生物传感器 介孔材料的出现为生物传感器开辟了新的局面。等采用介孔材料 膜作为电极材料,利用电化学方法将包含葡萄糖氧化酶分子的聚合物膜固定 在电极上,成为安培法检测葡萄糖的有效生物传感器。另外基于纳米 粒子和植酸沉积自组装形成的介孔植酸酯膜还被用于作为氧化还原蛋白质 的电化学研究的电极材料】,在这种电极上,带有正电荷的细胞色素与带有 负电荷的植酸通过静电作用迅速积累到介孔植酸酯膜上,细胞色素的浓度比 在液相中高三个数量级。 催化剂载体 目前,国外已有用纳米级吸附固定蛋白质及酶体系的研究,并阐述了 与蛋白质及酶之间的相互作用【,。文献表明在吸附法中,材料表面硕士学位论文 的羟基与酶分子残基之间的氢键作用力通常被认为是固定酶的作用力。但到目前 为止,利用介孔二氧化钛作为酶制剂载体的研究还处于尝试探索阶段。等【】 将血红蛋白固定在有序介孔上,发现载体具有非常高的负载能力并能提高血 红蛋白的电子转移能力,表现出良好的过氧化氢电催化特性。..由等【.】 通过. 分子筛担载纳米,制成介孔材料用于固载碱性蛋白酶,得 到的固定化酶稳定性有显著提高。 ..介孔氧化钛晶须的结构及性能 本论文中使用的固定化载体是介孑氧化钛晶须材料 ,,由南京工业大学材料化学工程国家重点实验室提供。 该材料以晶须为前驱物,利用其不稳定的层状晶体结构,控制水化过程 中水分子进入层间的水量和时间,使层状结构有序塌陷,形成?纳米相 与无定形的介相结构,用酸洗除?纳米相之后,经高温热处理晶化 后得到稳定的介孔晶须。该方法在制各介孔氧化钛过程中不用模板剂,合成 过程简单,成本低,已具有自主知识产权【】。 本实验中利用的载体材料材料结构如图所示为直径~ 、长度 ~的棒状颗粒,颗粒上的微孔直径为~,比表面积可达~/,结 构参数可通过控制制备条件进行调控【】。该介孔材料表面存在没有键合的 羟基,羟基密度经热分析仪检测达到个/,可利用其表面丰富的.对酶分 ~、结构稳定、机械强 子进行吸附固载图,化学稳定性好可耐受 度高,具有良好的酶固定化操作背景。但目前为止,尚未用于酶制剂固 定化的研究。 图纳米介孔的表征图第一章文献综述 .本课题的研究内容及意义 ...是谷氨酰循 丫一谷氨酰转肽酶丫一,, 环中的关键酶,对各种肝胆疾病均有一定的临床价值,并可特异性催化,.谷氨酰 基的转移反应,制备合成系列.谷氨酰基类化合物。但由于游离酶稳定性差、易 失活、不能重复使用,而且分离和提纯酶的技术复杂,代价昂贵,限制了它在生 物催化领域的广泛应用。 为此,本论文以高表面活性的为载体,通过氢键吸附实现的 高效固载和稳定化,并对固定化酶的结构进行表征,分析固定化酶在转肽反应条 件下的催化特性、酶活衰减及其结构的稳定性,为进一步拓展在酶固定 化领域的应用,以及寡聚酶的稳定化提供方法学上的借鉴;在此基础上,将固定 化后的应用于茶氨酸合成体系,考察固定化酶在实际反应体系中的操作性 能,进一步简化生产工艺、降低生产成本,力争使该工艺具有工业化竞争优势。 本论文的主要研究内容包括: 固载的制备和结构表征 以具有不同结构参数的为载体进行的固定化研究,考察载体 结构特性、反应时间和给酶量等对蛋白固载率、酶活回收率的影响;以扫描电镜 和红外光谱分别表征空载体和固定化酶结构;以圆二色谱分析固载前后二 级结构的变化。 固定化酶的催化特性和稳定性分析 分别测定游离酶和固定化酶的米氏常数、催化数和有效活性位点数;考察温 度、值对固定化酶催化特性和稳定性的影响,测定酶活半衰期以及固定化酶 的表观动力学、热力学常数,并考察酶脱落流失情况。 以固定化酶为催化剂酶法合成.茶氨酸 以.为催化剂,以为谷氨酰基供体,乙胺盐酸盐为谷氨酰基 受体合成一茶氨酸,对反应工艺进行优化,并测定实际体系下的酶促反应动力学 常数。硕士学位论文 第二章介孔晶须固载的制备及结构表征 课题组的前期研究表明,.谷氨酰转肽酶在体外催化环境下易发生 亚基解聚,从而导致其酶活的不可逆下降,难以适应产业化要求。因此,如何有 效提高酶的稳定性,是进一步拓展谷氨酰基化反应实际应用的关键。 酶固定化技术是目前提高酶稳定性中普遍常用的方法之一。其中,吸附固定 法是利用载体表面与酶分子间的非共价相互作用如氢键、疏水相互作用、静电 相互作用等实现酶的固载,具有反应条件温和、操作简便、酶活回收率高、 载 体可再生等优点。 为此,本章以具有不同结构参数的介孔晶须材料为载体, 考察载体结构特性、反应时间和给酶量等对蛋白固载率、酶活回收率的影响; 以 场发射扫描电镜.和红外光谱分别表征空载体和固定化酶结构, 并以圆二色谱分析固载前后二级结构的变化。 .实验材料 ..主要实验试剂第二章介孔固载的制备和结构表征 .实验方法 . . .. 的制备 种子液培养:菌种在装液量为%的摇瓶中于.?、振荡 培养小时,培养结束接入发酵罐。 发酵罐培养:在发酵罐中按照%装液量加入培养基,按%的种子量 接入摇好的种子液,于.。、 ,补料添加消泡剂,培养小时。 将. .的发酵液经离心后取上清,以%%,%%, % %饱和度硫酸铵梯度沉淀。取% %活性蛋白沉淀以.缓 /复溶,经透析后以 离子交 冲液., 换层析和离子交换层析分离后得到经纯化的电泳纯。 .. 酶活测定 酶活定义:以丫.谷氨酰对硝基苯胺为供体,以双甘二肽 为受体,每分钟催化水解生成 对硝基苯胺所需的酶量。 下 游离酶酶活测定方法:配制不同浓度的溶液,并在 测定其吸光值,分别以浓度和相应的吸光值为横、竖坐标,绘制标准曲线。硕 士学位论文 /、. /、. 取. 双甘二肽溶液. 溶液 . 酶液和. /,混匀后于?水浴反应 .缓冲液 。反应液于 下测定吸光值,根据标准曲线计算产物浓度和酶活。 固定化酶酶活测定方法:称取. 湿重固定化酶,与. /、. /、. 溶液 双甘二肽溶液. .缓冲液 . /混匀后加入砂芯管中,于。下震荡反应 ,转速为 。 反应结束后滤出反应液,并于下测定吸光值,酶活计算方法同上。 ..蛋白浓度的测定 按照的方法,以牛血清蛋白作为标准蛋白质绘制标准曲线。 ..固定化酶的制备 在离心管中用去离子水浸泡洗涤,重复多次,过.滤膜抽干。 加入~定浓度的酶液,干载体质量与酶液的体积比为:,于保温箱中。振荡 .,/ 反应。取出滤去残液,用倍于载体量/的 .缓冲液洗涤多次后,浸泡于倍载体量/的上述缓冲液中,使用 前至少浸泡小时。 ..蛋白固定率 蛋白固定率嵩需蒜淼?。% ..酶活回收率 酶活回收率蔷警凳翳罴蠢糕木。。% ..固定化酶的表征 采用日本日立公司的 型场发射扫描电镜.观察 矛固定化酶的微观形貌。通过日本公司的比表面和孔 径吸附测定仪分析固定化前后载体的比表面积和孔径分布等结构参数。利用 美国 傅立叶变换红外光谱仪分别对载体和固定化前后进行分 析,扫描范围~ 一,分辨率为 ~,压片法制样。根据红外图谱,第二章介孔固载 的制备和结构表征 分析其表面所带的官能团结构。 ..圆二色光谱 采用光径. 的比色杯在 .圆二色光谱仪上进行二级结构测定, / 游离酶和固定化酶的空白分别为 .缓冲和相同浓度的空载 体悬浮液。光谱值范围为 ,扫描速度 /,带宽 ,响应 时间 。读数次,取信号平均值并基线校正,将所测定的值转换成摩尔椭圆 度 。××。:用拟合软件分析蛋白质二级 结构组成。 ..固定化活性位点滴定 根据 等四的方法,称取一定酶活的固定化置于一定体积的 . . /缓冲液中,加入等体积一定浓度的溶液,。, 振荡速度 反应,测定残余酶活,以反应时刻的酶活为%, 计算残余酶活%。持续增加抑制剂加入量,直至反应后残余酶活降为。 游离酶活性位点滴定时,将一定酶活的游离酶液代替上述固定化酶,其体积 与上述所加缓冲相等。 .结果与讨论 .. 在上的固定化条件 载体结构特性对固定化效果的影响 以具有孔不同结构的为载体,在给酶量为. /载体时,按 ..方法振荡反应 制备固定化酶,不同载体的固定化酶活力和饱和担载量如 图.所示。 由于吸附是一种表面反应过程,因此同类载体的比表面积决定了其担载量。 各种载体的结构数据如表.所示,可以看出随着载体比表面积的增大,载体的 担载量逐渐增加。以 晶须颗粒为载体时,负载量可达. /。 表.不同载体的结构参数 一硕士学位论文 固定化酶活力与载体结构特性之间的关系比较复杂。尽管较大的比表面积提 供了较大的反应面积,使酶的固载量增大。但从实验结果看, 晶须颗粒固 定化酶的比活力为. 介孔材料为载体时,比酶活为. /,而以 /。 这可能是由于过大的负载量影响酶的催化构象和催化环境,从而导致了酶催 化活 性的下降。经测定, 介孔材料固定化酶的比酶活为. /载体,载体 担载量为. /。 .?.; ?; ?; 图. 载体结构特性对固定化效果的影响 .? 为载体制得的固定化酶的比酶活为 在相同的反应条件下,以 . /,载体担载量为. /载体。 反应时间的选择 以最可几孔径为的为载体,给酶量为./载体时,考察 反应时间对酶固定化的影响。由图.可知,在开始反应的 内,由于载 体表面暴露的.数量大,吸附反应速率快,固定化酶的比酶活迅速升高;随着 反应的进行,载体表面可反应羟基数量减少,反应速率逐渐下降,比酶活趋于 稳 定,此时固定化的比活力为. /载体,固定化酶的酶活回收率为 .%。第二章介孔固载的制备和结构表征 图. 固定时间对固定化效果的影响.? 给酶量对固定化效果的影响 当每克干载体 的给酶量为.、.、.、.、.、.、 。、.、. 时,在?、振荡速度为 ,酶 条件下反应。 活回收率的变化趋势如图.所示。当给酶量较低时,载体表面可反应羟基数较 为丰富,吸附位点多,大多数游离酶可吸附于载体表面;随着给酶量的上升, 固 定于载体表面的酶的摩尔分数逐渐下降,导致酶活回收率的降低。在给酶量 为 . /载体时,固定化酶的酶活回收率为最高,达.%; 图.给酶量对固定化效果的影响 .? ..固定化前后载体表面的结构变化 以最可几孔径为 的为载体,制备比活力为. /载体,蛋白硕士学位论文 固定量为. ,以 儋的固定化酶。固定化酶经抽干后真空冷冻干燥 型场发射扫描电镜观察固定化酶和载体的微观形貌,放大倍率在万倍。固 定化前后载体表面扫描电镜分析结果如图.所示。 图 和固定化酶的图 . :;载体为直径~ 、长度~“的棒状颗粒,表面分布有大量 的纳米级微孔图.;经固定化后,载体表面有明显的颗粒负载现象,原 先载体表面的介孔也明显减少图.。 采用比表面和孔径吸附测定仪,在液氮温度下测定固定化前后载体 的等温吸附.脱附曲线,通过.模型计算载体在 固定化酶前后的比表面积,模型计算载体在固定 化前后的孔径分布等结构参数。 图 固定化前后载体的吸附解附曲线和孔径分布图.? .第二章介孔固载的制 备和结构表征 表..固定化前后载体的结构性能 . ?固定化前后载体的主要结构参数如表.所示。由表可知,经固定化后, 载体的最可几孔径由 减. ,同时比表面积和孔容也相应 的减小,但变化幅度有限。可能是由于?制得的固定化酶蛋白固载量仅为. ‖,是饱和固载量的.%;?分析所用的样品经过冻干处理后,酶分子脱水 , 收缩,在载体孔道中所占的体积也相应减小;分子量较大约为 进入载体内部孔道的扩散阻力较大,因此更多的酶分子倾向于分布在载体表 面, 对孔的利用度不高。 ..固定化前后载体及的红外光谱分析 利用美国 傅里叶变换红外光谱仪分别对载体和固定 化前后进行分析,结果如图.所示。 /’。 图?.,,.的.谱图 . ,, 图。为载体和固定化前后的.谱。在图中可以观察到 。处为.的伸缩峰,一般由 红外光谱的特征吸收峰有个,分别是:约 处为酰胺带,.的伸缩峰,是振 多个峰叠加而成,峰带较宽:约 动耦合所产生的多重分裂峰:~ 。波数左右为酰胺带,.的弯曲硕士学位论文 峰; ‘波数左右为酰胺带,伸展振动.弯曲振动的混合峰; 约 。处为.的伸缩振动吸收峰。 同样,的红外光谱有个特征频率: ~。处为为.的伸缩 峰;约处为.弯曲峰;‘处的强吸收峰是的特征峰,由. 的振动引起,峰带较宽。 图.谱线与谱线相比,吸附后存在的特征峰,且的红外特征吸 收峰发生变化,约 ~,约 。处.的伸缩峰向低波数方向移动了 左右的.弯啦峰发生变化,且振动耦合所产生的多重分裂峰峰形变 化明显。这些变化说明原来氢键的作用形式发生了改变,酶和分子之间 形成氢键。同样,对酶分子的红外光谱也产生了影响。固定化后的 酶红外光谱的酰胺带、酰胺带和酰胺?带均向高波数方向移动,这进一步说 明的羟基同酶分子的酰胺基之间存在分子间作用力。 ..固定化前后的圆二色光谱 / 分析样品的制备:将游离酶电泳纯,比活为. /以 的 .缓冲液稀释至. . /;以最可几孔径为 为载体制得固定化酶比活力为. /载体,蛋白固定量为. /,并制 成%/的悬浮液。固定化前后的远紫外光谱如下图所示: ??一 ’、 专 功 ? 刁 呈. ? 一 // 表..固定化前后的二级结构组成 ?. 第二章介孔固栽的制备和结构表征 表.是用拟合软件计算得到的游离酶和固定化酶的二级结构组成。 由表可知,经固定化后,的一螺旋含量稍有降低,无规卷曲形式增强,但 变化幅度很小,可能是由于固定化形式的无法表现出与游离酶相同的酶活 水平。以上结果表明,经固定化后,其二级结构变化很小,因此该固定化 方法可以较好地保持的二级构象,进一步保证的结构及功能的稳定 性。 .. 的活性位点滴定 游离酶与固定化酶分别与溶液。反应,测定残余酶活,以抑 制剂浓度对反应后残余酶活作图,结果如图.和。随着的用 量增大,游离酶和固定化酶的活性逐渐降低直至。根据方法..,以的 用量计算得到游离酶和固定化酶的活性位点浓度分别为. /和 . /。经固定化后,的活性位点浓度有所减少,为游离酶的 .%,由于该固定化方法是通过载体上的羟基与酶分子的表面发生吸附反应, 并未利用其分子内的酸性氨基酸残基,因而对酶分子的结构扰动和活性中心 的影 响较小。 图?.游离酶和固定化酶的活性位点测定 ?. .,. . . . . . . ,.硕士学位论文 .本章小结 本章以为载体进行的固定化,考察了载体结构特性、反应时 间和给酶量对固定化效果的影响,对固载反应条件进行了优化,并对固载前 后的 载体进行了结构表征,具体结论如下: 选取不同结构的材料为载体分别进行固定化,发现随着载体 比表面积的增大,载体的担载量逐渐增加。以 晶须颗粒为载体时,负 载量可达. /,但固定化酶活力并没有相应的上升,而是有所下降。这可 能是由于过大的负载量影响酶的催化构象和催化环境,从而导致了酶催化活 性的 下降。经测定, 介孔材料固定化酶的固定化效果最好,比酶活为. / 载体,载体担载量达. /。 以最可几孔径为 的为载体对进行固定化,考察 反应时间对酶活回收率的影响。结果表明,随着固定化时间的延长,载体表面 可 反应羟基数量减少,反应速率逐渐下降,比酶活趋于稳定,在反应时间为. 时酶活回收率最高.%,固定化的比活力为. /载体。 选取每克干载体的给酶量为.、.、.、.、.、.、 .、.、. 时分别进行固定化,发现当给酶量较低时,载体表面可 反应羟基数较为丰富,吸附位点多,大多数游离酶可吸附于载体表面;随着给 酶 量的上升,固定于载体表面的酶的摩尔分数逐渐下降,导致酶活回收率的降 低。 在给酶量为. /载体时,固定化酶的酶活回收率为最高,达.%。 通过场发射扫描电镜.、比表面和孔径吸附测定仪和傅立叶变 换红外光谱仪观察固定化前后载体的结构发现,分子通过与载体 表面羟基间的氢键相互作用而实现固载,固定化后分子在载体表面和微孔 道中均有一定分布。采用圆二色光谱仪测定固定化前后的二级结构,结果 表明固定化后的二级构象变化很小,进一步保证的结构及功能的稳 定性。 利用对的不可逆抑制,对游离酶和固定化酶进行活性位点 滴定,活性位点浓度分别为,./和. /。经固定化后,固 定化的活性位点浓度有所减少,为游离酶的.%,说明该固定化方法对 酶的结构扰动和活性中心的影响较小。第三章固定化的催化特性和稳定性分 析 第三章.的催化特性和稳定性分析 在第二章中,以为载体对进行了固定化,建立的固定化 操作方法。该方法具有方法操作简便、反应条件温和、酶活回收率和担载量 高的 优点。但同时,游离酶经固定化后,由于受到载体表面及结构性质的影响,酶 的 表观催化特性如最适反应温度、最适反应、稳定性及热稳定性,及反应动 力学参数等常常会发生改变。 因此,本章将重点研究.的催化特性和稳定性,分别测定游离酶 和固定化酶的催化动力学常数;并考察温度、值等对固定化酶稳定性的影响, 在催化环境下.,。测定酶活半衰期,考察酶失活过程中的酶脱 落流失情况,为载体在酶固定化领域的应用提供基础数据。 .实验材料 ..主要实验试剂硕士学位论文 .实验方法 .. 酶活测定 方法见..所述。 ..固定化酶的制备 在离心管中用去离子水浸泡洗涤,重复多次,过.滤膜抽干。 加入酶活为. /的酶液,干载体质量与酶液的体积比为:,于保温箱中 。振荡 ., 反应. 。取出滤去残液,用倍于载体量/的 / 缓冲液洗涤多次后,浸泡于倍载体量:的上述缓冲 液中,使用前至少浸泡小时。固定化酶的酶活回收率为.%。 ..固定化酶的稳定性 稳定性 将游离和固定化分别置于 ~的缓冲液中。水浴中保温, 定时取样分别测定其酶活。设保温前各自的初始酶活为%。不同的缓冲 的磷酸缓冲液 的.缓冲液 /, 液液: /, /。 ~的碳酸盐缓冲液 热稳定性 将游离和固定化分别置于~。水浴中保温,定时取样分别测 %。 定其酶活。设保温前各自的初始酶活为 贮存稳定性 将游离和固定化置于?下贮存,定期取样分别测定其酶活。 设贮存前各自的初始酶活为%。 ..最适作用 以,.谷氨酰对硝基苯胺和双甘二肽构成反应体系,分别以游离 和固定化为催化剂酶浓度均为. /,调节反应液的值分 别为.,.,.,.,., .,?下水浴反应 ,定时取样测定产 物浓度。设保温前各自的初始酶活为%。缓冲液配制同..。 ..最适作用温度 以丫一谷氨酰对硝基苯胺和双甘二肽构成反应体系,分别以游离第三章固定 化的催化特性和稳定性分析 和固定化为催化剂酶浓度均为. /,调节反应液值为., 分别在 ,?,。,。, ,?下水浴反应 ,定时取样测 定产物浓度。设保温前各自的初始酶活为%。 .. 酰基化反应动力学常数的测定 配制供体浓度为.、、、、、 /,分别取.,称取 /,. 一定酶活的固定化为催化剂,加入. 双甘二肽 .的 /缓冲液后,于?水浴振荡 反应。反应结束后将反应液从砂芯管中吹出,并用紫外分光光度计测定 下的吸光值。 测定游离酶动力学常数时,将一定酶活的游离酶液代替上述固定化酶,其体 积与上述所加缓冲相等。 .. 酰基化反应活化能的测定 固定化:称取一定酶活的固定化置于砂芯管中,加入. 双 甘二肽 /,. .的. /,. /缓冲液后,在不同温度下反应 ,振荡速度 。反应结束后 滤出反应液,并用紫外分光光度计测定 下的吸光值,以产物生成量来确 定反应速率。 测定游离酶酰基化反应活化能时,将一定酶活的游离酶液代替上述固定化 酶,其体积与上述所加缓冲相等。 .. 热失活曲线与失活动力学和热力学参数的测定 在一定温度下对游离的和固定化进行保温,每隔一段时间测定其残余 相对活力,作出酶的失活曲线,并计算固定化热失活速率常数和热失活反 应活化能。 .结果与讨论 .。固定化的稳定性 稳定性 将游离酶和固定化酶分别置于 ~的缓冲液中,。保温 后测定 酶活,以时刻的初始酶活为%,计算残余酶活图.。结果表明,.硕士学位论文 . 的稳定性较差,尤其在碱性条件下.稳定性更差。在 条件下,经过 贮存,其残余酶活仅为初始酶活的.%。通过固定化 的稳定性得到了明显改善,在各条件下,固定化的稳定性较游离酶 .条件下保存 ,固定化酶的残余酶活可保持初始酶 均有大幅提高,在 活的.%。 图固定化酶和游离酶的稳定性. 为了进一步分析?的失活原因,本文测定了在不同条件下 保存 后滤液中的酶浓度,并计算了酶在不同条件下的脱落率,结果如图. 所示。 图 对固定化酶脱落的影响 . 第三章固定化的催化特性和稳定性分析 ~ 由上图可知,酶脱落率随值的变化呈“马鞍”型。固定化酶在 之间时几乎观察不到酶的脱落,而随着值得升高,酶脱落现象逐渐加剧,当 值为时,脱落的酶占固载量的.%。通过与残余酶活数据的对照不难发 现,酶分子脱落是导致固定化酶活降低的重要原因。 热稳定性 将游离酶和固定化酶分别置于不同温度~?下保温后取样测定酶 活,以初始酶活为%,计算残余酶活,结果见图.。游离酶的热稳定性较 差,当温度超过。时,酶活迅速下降,在?下保温后,残余酶活仅为初 始值的.%。而固定化后的热稳定性明显提高,当温度为?时固定化 酶的残余酶活为初始值的.%。 图固定化酶和游离酶的热稳定性 . 固定化酶的储存稳定性 取一定量的固定化酶于?下贮藏,定期测定酶活,固定化酶的储存稳定性 测试结果见图.。在转化初期个批次固定化酶活有明显的下降,这可 能是由于结合较弱的酶分子脱落造成的。随着转化次数的增多,固定化酶的 活力 略有下降,经储存约,转化个批次后,固定化酶活力仍可保持初始 值的.%。硕士学位论文 图?固定化酶的储存稳定性 . ..固定化的催化特性 最适作用 ~的溶液中测定游离酶及固定化酶的活力,结果如图?所示。 分别在 固定化酶和游离酶的最适作用均为.。 图 对酶活性的影响 . 最适作用温度 在不同温度~下分别测定游离酶及固定化酶活力,结果如图。 由图可知,固定化酶和游离酶在?和?时酶活最高。 第三章固定化的催化特性和稳定性分析 图温度对酶活性的影响.。固定化酶和游离酶催化常数的测定 研究表明,的催化机制符合双底物乒乓机制‘,催化动力学方程可表 示为双底物的.方程: ’ 卜互五当受体浓度远大于供体浓度时,该方程可简化为单底物米氏方程: ,.:刍型& 其中,.表示反应速率,表示供体浓度。 /,受体双甘二肽 分别配制供体印浓度为.、、、、、 浓度均为 /的反应液,分别以游离酶酶浓度./和固定化 酶酶浓度. /为催化剂,测定酰基化反应初速率。通过双倒数 作图法得到游离酶米氏常数如. /图.,,固定化酶的米氏常数 /图.,。固定化后酶对谷氨酰供体的亲和力略有下降。 . 硕士学位