中性粒细胞的分离与纯化

中性粒细胞的分离与纯化 272医学理论与实践2005年第l8卷第3期JMedTheor&PracVo1.18,No.3,Mar2005 ?综述与讲座? 中性粒细胞的分离与纯化 李鹏邢杰. 武警医学院寄生虫学教研室,天津300162 关键词中性粒细胞分离纯化 中图分类号:R446.113文献标识码:A文章编号:1001—7585(2005)03—0274—04 正常情况下,中性粒细胞(M)在人外周血白 细胞比例是最高的,约为50%一70%.其在发生急 性感染或炎症,广泛的组织损伤或坏死,急性溶血和 失血,急性中毒以及恶性肿瘤等情况时发挥着重要 的作用,比例更高LlJ.对其数量和功能进行研究是 临床和科研上一项重要的内容,但因其在血液中的 含量约为红细胞的千分之,,且与红细胞的比重较 为接近,一旦分离之后在目前又尚无理想的保存方 法2.随着对白细胞(特别是PMN)细胞生物学和 分子生物学研究的逐步深入,建立一种简便,分离纯 度高,存活率高且对PMN测定指标影响小的方法尤 其重要.为此本文对几种分离,纯化人或大鼠中性 粒细胞的常用方法作一综述. 1密度梯度离心法 此法是利用不同细胞之间密度不同的性质,通 过速度沉降法来分离制备中性粒细胞.人中性粒细 胞的漂浮密度为1.0801.085g/mL;嗜酸性粒细胞 为1.091.095g/mL;单核细胞为1.050—1.o66g/ mL;淋巴细胞为1.052,1.077g/mL;红细胞为1.09 — 1.1lg/mL;血小板1.030—1.060g/mLJ. 1.1Ficoil(聚蔗糖)一Hypaque(泛影葡胺)密度梯度. 离心法Ficoll是蔗糖的多聚体,呈中性,亲水性 高,平均分子量为4O0,0O0. 1.1.1白细胞液的制备.取肝素抗凝静脉血样,于 室温下静置1h或离心2o00rpm,15min,然后吸取富 含白细胞的”白膜层”. 1.1.2分离液的配制.将)%聚蔗糖液或粉状Fi_ coil一400以Hanks’液配制成9%聚蔗糖液,为A液, 比重为1.028g/mL.将60%复方泛影葡胺注射液以 Hanks’液配制成34%溶液,为B液,比重为1.198g/ mL.根据公式:d=(dAVA+dBVB)/(VA+VB)(d与V 分别为溶液的浮力密度与体积).将A液与B液按 50:25.4的比例混合,}昆合液的比重为1.085g/mL, 即为中性粒细胞分离液. 1.1.3中性粒细胞的分离和纯化.(1)以等量 0.15M,pH7.4PBS稀释白细胞液,加于粒细胞分离 液上(分离液与分离样本的体积比可为1:14),水 平离心20o0rpm,20min.(2)以毛细吸管吸取分离液 界面上的白色层带至另一试管内,以PBS稀释至分 离前的体积.(3)将前一步分离得到的细胞悬液置 于比重为1.077g/mL的细胞分离液上,离心 2o00rpm,20rain,则沉于管底的为粒细胞.(4)进行 涂片,瑞氏染色及台盼蓝染色. 样本经分离液分离后,细胞悬液中几乎未见红 细胞;应用国产聚蔗糖溶液及国外产品Ficon一400 配制的粒细胞分离液,比较其浮力密度及分离效果, 无差异.经瑞氏染色,除中性粒细胞外,淋巴细胞及 单核细胞等其它白细胞成分均少见,中性粒细胞百 分率>9o%,台盼蓝染色测定细胞活力>9o%.此 种分离,纯化中性粒细胞的方法,回收率较高,纯化 程度好,样本处理可达数百毫升;又可应用国产试 剂,配制分离液操作简单. 1.2Percoll密度梯度离心法【5_Percoll是pharma. cia公司的商品名,为聚乙烯吡硌烷酮(eve)包被的 硅胶颗粒混悬液,渗透压很低[<20mosm/(kg? n20)],粘度也很小,可形成1.3g/mL密度,采用预 先形成的密度梯度时可在低离心力(2O0,lo00g)于 数分钟至数十分钟内达到满意的细胞分离效果.由 于Percoll扩散常数低,所形成的梯度十分稳定.此 外,Percoll不穿透生物膜,对细胞无毒害,因此广泛 应用于分离细胞,亚细胞成分,细菌及病毒,还可将 受损细胞及其碎片与完好的活细胞分离.下面分别 介绍Haslett法,等渗Haslett法,RPMI一1640法. 1.2.1Haslett法[6,7] 1.2.1.1人外周血中性粒细胞的分离,纯化方法. (1)中性粒细胞分离液的配制.将Percoil原液与 8.77%的氯化钠溶液以9:1的比例(体积之比)混 合,定为lO0%Percoll,再用灭菌生理盐水配制6o% 及75%的Percoil分离液(体积之比),其中6o%Per. coil密度为1.079g/mL,75%Percoll密度为1.ogog/ 医学理论与实践2005年第l8卷第3期JMedTheor&PracVo1.18,No.3,Mar2005273 rrlL,人外周血中性粒细胞在Percoll中的漂浮密度为 1.080—1.085[8j.将DextranT一500粉剂用灭菌生 理盐水配成6%的溶液.(2)中性粒细胞的分离提 纯步骤.操作均在室温20cE,25qC下进行.取外 周静脉血与3.8%的枸椽酸钠以9:1的比例混合, 1500r/rain离心15rain.吸取白膜层用生理盐水稀释 后加入6%DextranlmL充分混匀后垂直静置30rain. 取上清即白细胞悬液洗涤.取初次离心后的上层血 浆,离心获得无血小板血浆(PPP)用以重悬粗白细 胞.继在一硅化试管中,依次加入75%与6o%Per— toll液和PPP重悬液,三者体积比为2:2:1,1250r/ min离心14rain,吸取6o%与75%Percoll液的界面层 中PMN,用PBS充分洗脱Percoll胶粒.将所获PMN 稀释至lmL后,取样作台盼蓝和瑞氏染色.用上述 方法对2o例外周血样本进行实验,结果表明:PMN 的回收率为(80.2%?7.2%);台盼蓝染色活率> 98%;PMN形态改变<8%;中性粒细胞为(95.8%? 1.6%);淋巴细胞为(1.9%?0.9%);红细胞为 (1.7%?0.8%);单核细胞为(0.11%?0.17%);血 小板几未见到.可见,本法所获PMN能满足体外生 物学功能的实验要求. 1.2.1.2大鼠外周血中性粒细胞的分离,纯化方 法.基础研究中,大鼠是最为常用的实验动物,而大 鼠白细胞中的PMN比率较低,甚至不到人血的一 半J,因此用分离人血PMN的方法分离大鼠PMN, 获得率较低,仅有40%左右.大鼠中性粒细胞分离 与纯化u0J:(1)大鼠颈动脉取血后,离心(300g, 20min),取上清离心(2500g,15min),得到贫血小板血 浆(PPP).(2)沉淀加6%的Dextran—T50o,再加生 理盐水25mL,混匀后静置30rain,使红细胞沉淀. (3)吸出富白细胞血浆再离心(275g,6min),加入2, 3rrlLPPP悬浮得到的细胞团,悬浮液分别加到含有 用PPP新鲜配制的42%的pereoll2mL和5l%percoll 2rnL的试管中,离心(275g,6rain),取出中间层,离心 (275g,lOmin),用0.2%和1.6%的盐水溶破残余的 红细胞,离心(275g,lOmin),用KRPD(Kreb—Ringer PhosphateBuffer)洗一次,最后用KRPD悬浮,即可得 到较纯的PMN【11J.本方法使用的90%Percoll贮备 液用生理盐水配制成渗透压约50mmol/L的低渗液; 42%和51%Percoll密度梯度离心液用贫血小板血浆 配制成渗透压约180rnmol/L的等渗液. 1.2.2等渗Haslett法方法同Haslett法.但90% Percoll贮备液用8%盐水配成等渗,从而使用贫血 小板血浆配制的42%和51%Percoll密度梯度离心 液均为等渗液. 1.2.3RPMI一1640法.9o%Percoll贮备液用8% 盐水配制,42%和51%Percoll密度梯度离心液用RP— MI一1640配制均为等渗液. 其操作步骤:(1)取兔血清lOmL,DextranT一500 3mE和生理盐水15mL放于5OraL抗凝管内,混匀, 静置t5,30rain.(2)吸取上清,300g离心20rain,弃 上清,将此富白细胞细胞团加RPMI一16402rnL混 匀,再加到贮有42%和5l%Percoll液的试管中,275g 离心lOmin.(3)吸出42%和5l%之间的界面层(即 富PMN),以0.2%盐水2mL溶解红细胞20s后加等 量1.6%生理盐水,再以RPMI一1640洗涤1,2次, 则可计数PMN和测定其活力,纯度.Haslett法,等 渗Haslett法及RPMI一1640法分别得到的PMN纯度 分别为(93.8%?1.3%),(94.4%?1.3%),(94.4% ?1.1%),3组之间无差异(P>0.05).Haslett法, 等渗Haslett法及RPMI一1640法分别得到的PMN活 力分别为(93.3%?1.2%),(93.6%?1.8%), (93.2%?1.1%),3组之间无差异(P>0.05). Haslett等曾对Ficoll一泛影葡胺和Percoll一血浆等分 离白细胞的方法作一系列比较,发现虽然用前者也 可获得与后者相似纯度的(PMN>95%)但Ficoll法 对PMN本身的影响较大,表现在(1)形态改变,前者 改变率为(30.5%?15.8%),后者仅为(3.8%? 3.6%);(2)趋化能力降低;(3)暴露在相同剂量的 LPS环境中释放超氧化物量降低等.认为Ficoll结 构中的长链烃组成具有LPS样作用,导致分离过程 对PMN的激活.另外Ficoll一泛影葡胺法中尚需用 氯化铵溶解红细胞,所以PMN中往往混有未被溶解 的红细胞,而且溶解过程对PMN也具损害作用. Haslett法可一次分离纯化PMN外,还能获得纯度较 高的单个核细胞,既可少量分离又可大量收集,但操 作技术要求较高,特别是在制备非连续密度梯度 Percoll层时,要求保护好界面,否则将达不到目的. 由于用Percol1分离PMN活率与回收率均较高,是一 种较为理想的分离纯化方法. 2流式细胞术 流式细胞术(FlowCytometry,FCM)是一种对处 在液流中的单个细胞或其它生物颗粒(如细菌)等进 行快速定量和分选的技术.其原理是待测细胞 被制备成单个细胞的悬液,经特异性荧光染料染色 后放人样品管,在氮气的压力下进人流动室.流动 室内充满鞘液,在鞘液的约束下,细胞排成单列由流 动室的喷嘴喷出,成为细胞液柱.液柱与入射的激 医学理论与实践2005年第18卷第3期JMedTheor&PracVo1.18,No.3,Mar2005 光束垂直相交,相交点为测量区.通过测量区的细 胞被激发产生荧光,在与入射光束和液柱垂直的方 向放置光学系统(透镜,光阑,滤片检测器),用以收 集荧光信号,所有信号自动传送入电子计算机分析 处理,迅速获得细胞类群及其数量的信息.由高频 超声振荡器和极向偏转板等构成的细胞分离纯化系 统,在分析鉴别不同细胞类群的基础上,使带有不同 电荷的细胞滴通过电磁场时发生偏离,最后将细胞 分别收集于不同容器内.只要由相应的荧光标记, 就可以分选出任何所需要的细胞群体,尤其是含量 稀少但对鉴定又非常重要的细胞,纯度可达95%以 _ k~12,13l. 3注意事项 3.1红细胞的去除在密度梯度离心之前,加入红 细胞沉降剂,如葡聚糖,甲基纤维素,多聚蔗糖,明胶 等,可以去除红细胞,但这样会损失一部分白细胞, 如使用葡聚糖会损失30%的白细胞【l. 3.2缩短Ficoll沉淀时间有资料ll5J显示:将PMN 与其生理环境分离的方法可能影响其生理防御功 能,PMN分离法可激发PMN的受体表达和氧化酶功 能.Ficoil分离法对PMN呼吸爆发活性的影响可能 是由于Ficoil溶液可能损害PMN的细胞膜结构和功 能.Ficoil溶液分子表面张力高,因此形成较宽的分 子间隙便于特定大小范围的细胞通过;而这种高表 面张力可能引起细胞膜电位的改变和细胞膜的形态 极化.有研究LlJ发现,PMN细胞膜的极化可能激活 细胞而诱导过氧化物的产生.因此在可能的情况下 应尽量缩短Ficoll沉淀时间,以减少细胞与高张力 分子的接触时间.在取上层有核细胞层悬液时,也 应小心操作以避免混入Ficoll液【17J. 3.3FCM法中去除死细胞及碎片在FCM中必须 去除死细胞,细胞碎片,因为死细胞会增加非特异染 色,并且会释放DNA,引起细胞凝集,阻塞流式细胞 仪. 4小结 目前国内外分离PMN应用较多的是Haslett倡 导的Percoll密度梯度离心法,由于该方法分得的 PMN纯度高(可达92%以上),活性高(可达94%以 上),遂被广泛应用.但Haslett法采用的贮备液和 梯度离心液均为低渗,对PMN某些生理参数,如糖 皮质激素受体(GR)位点有明显影响,且所需离心步 骤多,分离时间长,对白细胞有体外激活作用. Haslett法,等渗Haslett法(用8%盐水代替生理盐水 使90%贮备液为等渗),RPMI一1640法(RPMI一1640 代替贫血小板血浆配制42%和51%密度梯度离心 液)对于PMN纯度,活力三方法间无差异,但GR位 点等渗Haslett法及RPMI一1640法明显高于Haslett 法,表明渗透压对GR位点有影响.而等渗Haslett 法与RPMI一1640法间无差异,且RPMI一1640法离 心次数少,分离时间短,所以RPMI一1640法是一种 较好的分离中性粒细胞的方法. Ficoil—Hypaque密度梯度离心法和Percoll密度 梯度离心法是分离纯化中性粒细胞最常用的两类方 法,前者也可获得与后者相似纯度的(PMN>95%), 但Ficoil法对PMN本身的影响较大,而且Ficoil— Hypaque密度梯度离心法中尚需用氯化铵(或蒸馏 水)溶解红细胞,所以PMN中往往混有未被溶解的 红细胞,而且溶解过程对PMN也具损害作用.Per. coil密度梯度离心法可一次分离纯化PMN外,还能 获得纯度较高的单个核细胞,既可少量分离又可大 量收集,但处理样本的体积及细胞浓度均有一定限 制,操作技术要求较高,溶液配制及制备不连续密度 梯度Percoil层操作技术要求较高,特别是在制备非 连续密度梯度Percoll层时,要求保护好界面,否则 将达不到目的,并且购买国外产品Percoil原液价格 较高. 密度梯度离心法和FCM法相比,前者具有经 济,节约时间的特点,但阳性细胞收集率和纯度不 高,FCM分离细胞则可以弥补这些不足,特别是对 于含量稀少的细胞,但价格昂贵,不易推广. 从上可知要获得可比性的资料,必须使各种方 法化.各种方法都具有优缺点,所以应根据自 己的实际情况选择不同的方法. 致谢本综述经闫玉文教授审教.谨致谢忱. 参考文献 1陈文彬.诊断学.第5版.北京:人民卫生出版社,2001.244. 2杨天楹,杨成民,田兆嵩.临床输血学.北京:北京医科大学中国协 和医科大学联合出版社,1993.141. 3金伯泉.细胞和分子免疫学实验技术.西安:第四军医大学出版 社.2OO2.66. 4刘文超,刘智广,张晓楠,等.外周血中性粒细胞的分离方法.细胞 与分子免疫学杂志,1996,12(4):64—66. 5康舟军,龚肖崎.兔中性粒细胞的分离及糖皮质激素受体的测定. 第二军医大学学报,1995,16(3):278—279. 6HastettC,GuthrleLA,KopaniakMM,d.Modulationofmultiple neutrophllfunctionsbypreparativemethodsO1”traceconcentrationsofbac— teriallllx)~lysaccadde.AmJPathol,1985,119(1):101,110. 7吕金星,汪健,张锡庆,等.Percoll非连续密度梯度沉降法分离人 外周血中性粒细胞.上海免疫学杂志,200O,2o(2):122. 8刘鼎新,吕证宝.细胞生物学研究方法与技术.第2版,北京:北京 医学理论与实践2005年第18卷第3期JMedTheor&PracVo1.18,No.3,Mar2005275 9 10 医科大学中国协和医科大学联合出版社,1997.109. 特拉赫金别尔格M.M.(李姓生译).毒理实验中实验动物各种指 标的正常值.北京:人民卫生出版社,1984.190—191. 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