国境口岸轮状病毒(a组)、诺沃克病毒、星状病毒的多重rt-pcr检测方法

国境口岸轮状病毒(a组)、诺沃克病毒、星状病毒的多重rt-pcr检测方法 国境口岸轮状病毒(A组)、诺沃克病毒、星状病毒的 多重RT-PCR检测方法 编制说明 (征求意见稿) 目 录 1 工作概述 ......................................................................................................................... 2 1.1 任务来源 ................................................................................................................. 2 1.2 制定本标准的目的和意义 ..................................................................................... 2 1.3 国内外有关标准的简要说明 ................................................................................. 3 2 标准的制定基础 ............................................................................................................. 3 3 标准方法研制过程 ......................................................................................................... 4 3.1 材料来源 ................................................................................................................. 4 3.2 方法建立 ................................................................................................................. 4 3.2.1 方法建立的技术路线和过程 ....................................................................... 4 3.2.2 引物和优化 ........................................................................................... 5 3.2.3 多重RT-PCR反应条件的优化 ................................................................... 5 3.2.4 灵敏度实验 ................................................................................................... 6 3.2.5 大样本的评价实验 ....................................................................................... 7 4 方法的验证 ..................................................................................................................... 8 5 建议 ................................................................................................................................. 8 6 参考文献和标准 ............................................................................................................. 8 7 附件 ................................................................................................................................. 9 7.1 广东出入境检验检疫局验证报告 ......................................................................... 9 7.2 厦门国际旅行卫生保健中心验证报告 ............................................................... 10 7.3 广州市妇女儿童医疗中心验证报告 ................................................................... 11 1 工作概述 1.1 任务来源 本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口。 本标准由国家质量监督检验检疫总局批准。 编号:2011B175 类别:卫生检疫 标准名称:国境口岸轮状病毒(A组)、诺沃克病毒、星状病毒的多重RT-PCR检测方法 负责起草单位:中华人民共和国珠海出入境检验检疫局 本标准主要起草人:莫秋华、谭华、李卫岗、梁玉英、史咏梅、杨泽、涂承宁 1.2 制定本标准的目的和意义 本标准以国境口岸腹泻病人为检测对象，针对轮状病毒(A组)、诺沃克病毒和星状病毒等3种最主要的病毒性腹泻病原体，制订一管反应能同时检测3种病毒的多重 防控的需要，并RT-PCR快速检测方法，以满足口岸卫生检疫部门开展腹泻病监测和 能提高检测工作的效率，缩短检测时间。 腹泻病(Diarrhea Diseases)是一组多病原、多因素引起的疾病，目前它已成为严重影响人类健康的一个重要公共卫生问。世界卫生组织(WHO)20世纪90年代的统计结果显示:全世界5岁以下婴幼儿，每年有10亿患腹泻，可导致500万小儿死亡。在第三世界国家，腹泻病是造成幼儿死亡的第一原因。在中国，腹泻病是仅次于呼吸道疾病的第二位多发病，也是婴幼儿死亡的两大病因之一。我国卫生部早已把腹泻病列为儿科重点防治的疾病之一。 腹泻病分为感染性腹泻和非感染性腹泻两大类，其临床表现轻重不等，多表现为腹痛、腹泻、呕吐、发热等症状，严重者还伴有脱水、电解质紊乱甚至休克、死亡。在感染性腹泻病中，目前已知引起腹泻的病原体有数十种之多，但国内报告以细菌性和病毒性腹泻占多数。虽然不同自然环境和生产、生活方式不同的地区，引起腹泻病的主要病原体有所不同，但总体上居首位的是志贺氏菌及轮状病毒。病毒性腹泻在感 2 染性腹泻中占有重要的比例，轮状病毒(Rotavirus，RV)、诺沃克病毒(Norwalk virus, NVs)和星状病毒(Astrovirus，AVs)等3种胃肠炎病毒是主要的病原体。它们均是RNA病毒，通过水、食物等途径在儿童和成人中引起急性胃肠炎的散发和暴发，甚至大流行,如2008年初在英国出现的诺沃克病毒大暴发，每周约有10万人感染该病毒，严重影响人们健康和社会发展。 在国境口岸针对出入境可疑胃肠炎发病人员的查验工作中，在应对可能的突发公共卫生事件中，均迫切需求能快速检出致病病原体的检测方法。基于RT-PCR的分子生物学技术是病毒检测首选的方法。如果采用一次实验能同时检出以上3种常见腹泻病病毒的多病原体联检技术，即所谓多重(3重)RT-PCR技术，将能大大加快检测的速度，提高工作效率，节省试剂成本，对于防止急性胃肠炎的暴发、大流行，保障人民健康，做好公共卫生工作都具有重要意义。 1.3 国内外有关标准的简要说明 截止2012年7月，经检索，目前没有相关行业标准涉及多重RT-PCR检测方法通过一次实验同时检测轮状病毒、诺沃克病毒和星状病毒等3种病毒。 具体来说，目前已颁布或尚在制订中的检验检疫行业标准均只涉及到以上3种病毒中的某一种的检测，并且主要为食品专业的标准，卫生检疫专业的较少。列举如下: 目前涉及以上3种病毒的相关检验检疫行业标准，已颁布实施的有6项，其中4项是食品专业(分别是:SN/T 2520-2010贝类中A群轮状病毒检测方法 普通PCR和实时荧光PCR方法;SN/T 1635-2005 贝类中诺沃克病毒检测方法 普通RT-PCR方法和实时荧光RT-PCR检测;SN/T 2730-2010进出口食品中诺如病毒检测 酶联免疫吸附法;SN/T 2519-2010贝类中星状病毒检测方法 普通PCR和实时荧光PCR方法)，另2项是卫生检疫专业(分别是:SN/T1720-2006 出入境口岸轮状病毒感染监测规程;SN/T2626-2010 国境口岸诺如病毒检测方法); 仍在制修订当中的计划项目有1项(属于卫生检疫专业):2009B229 口岸食源性疾病轮状病毒(A组)荧光PCR检测方法。 2 标准的制定基础 本标准制订单位是国家质检总局批准设立的“国家级腹泻病检测重点实验室”， 3 长期在腹泻病领域开展检测和科学研究工作。实验室在2009年承担了1项珠海市科技计划项目—“基于等温扩增的三种致腹泻重要病毒的快速联合分子检测方法研究和应用评价”。在该项目的研究中，课题组收集了1000份小儿病毒性腹泻样本，采用自主建立的RT-PCR方法和多重RT-PCR方法，检出了200多例轮状病毒阳性样本，90多例诺沃克病毒阳性样本和20多例星状病毒阳性样本。通过该项目的研究，不但积累了大量的阳性样本，而且充分验证了多重RT-PCR技术同时检测轮状病毒、诺沃克病毒和星状病毒的实用性和特异性。 3 标准方法研制过程 3.1 材料来源 在2009年11月—2010年4月期间，系统收集珠海市妇幼保健院就诊的疑似病毒性腹泻患儿的粪便标本1000份。针对1000份粪便标本，首先采用胶体金免疫层析试纸条法对轮状病毒、诺沃克病毒和星状病毒进行快速检测，然后针对阳性样本再采用RT-PCR实验进行验证，最后获得250例轮状病毒阳性样本、92例诺沃克病毒阳性样本和25例星状病毒阳性样本。这些样本被用于本标准的方法学建立和验证实验。 3.2 方法建立 3.2.1 方法建立的技术路线和过程 本标准的制订在方法学研究方面经历了3个阶段，历时1年: 第1阶段:参考已发表的文献和相关标准，设计和筛选了一系列引物，分别建立检测A组轮状病毒、诺沃克病毒和星状病毒的单重RT-PCR方法。 第2阶段:优化组合并进一步修改单重RT-PCR的引物，初步建立比较特异、稳定的3重RT-PCR方法同时检测A组轮状病毒、诺沃克病毒和星状病毒。 第3阶段:根据第2阶段优化得到的3对多重RT-PCR的引物，引入同源加尾系统(Homo-Tag Assisted Non-Dimer System, HAND系统)进一步进行方法的优化。HAND系统又可称为相同标签辅助-无引物二聚体系统。HAND系统采用同源加尾的方式，即在上游引物和下游引物的5’末端分别加上相同的标签序列，从而能有效地抑制引物二聚体的产生，减小多重PCR体系中各基因间扩增效率的差异，提高多重PCR的稳 4 定性、均一性和扩增效率。通过引物浓度，循环参数等各项条件的优化，最终建立稳定、特异、灵敏度较高的3重RT-PCR方法同时检测A组轮状病毒、诺沃克病毒和星状病毒。 3.2.2 引物设计和优化 在本标准的研制过程中，引物的优化是核心工作，我们主要从引物的解链温度、扩增效率和特导性等方面进行序列的修正，经过3个阶段的引物改进(共计淘汰50多条引物)和实验条件优化，优选出以下引物组合: 表1 优选出三重RT-PCR引物组合 腹泻病毒1,23NO 引物名称 序列(5’-3’) 长度 位置 大小 类别 ggggtcccaaaagggtcagtTGTGAATCAGT1 RotaVP6-FP 40 1014-1033 RCTTGCSGA 轮状病毒 186 ggggtcccaaaagggtcagtTCYCTVGATGG2 RotaVP6-RP 46 1134-1159 TGAATAGTTAGTRAT ggggtcccaaaagggtcagtACAGATACCA3 NLV-FP 45 4273-4297 诺沃克 CTATGATGCAGAYTA 376 ggggtcccaaaagggtcagtCAATTTCATC病毒 4 NLV-RP 45 4608-4584 ATCACCATARAARGA ggggtcccaaaagggtcagtACYAGATTYG40 1244-1263 5 AstV-FP AGATCCGTGA 星状病毒 270 ggggtcccaaaagggtcagtACRACATGTG41 1453-1473 6 AstV-RP CTGCTGTTACT 通用引物 7 RNA-P20 ggggtcccaaaagggtcagt 20 - - 12 3注: 序列中小写字母的序列即为同源加尾序列;简并碱基R为A或G，S为C或G，Y为C或T; GenBank参考序列分别是:RotaV, EU984108; NLV, AB447442; AstV, L23513。 3.2.3 多重RT-PCR反应条件的优化 主要针对3对引物和通用引物的浓度进行反应条件的优化，通过正交实验设计优化3对引物及通用引物的浓度组合，每条引物的变化范围从终浓度0.05μmol/L至2μmol/L;引物的贮存液建议按100μmol/L配制，而应用液按20μmol/L进行稀释。最后确定的最优组合是:在20μL的反应体积内，引物RotaVP6-FP和RotaVP6-RP各0.25μL(终浓度0.25μM);引物NLV-FP和NLV-RP各0.12μL(终浓度0.12μM);引物AstV-FP和AstV-RP各0.1μL(终浓度0.1μM);通用引物RNA-P20则为1.5μl(终浓度1.5μM)。 一步法RT-PCR实验的基础试剂我们选择了数家公司的产品进行预实验，实验结 5 果差异不大，均获得比较理想的结果，例如宝生物(大连)有限公司的试剂盒PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2比较经济，使用简便，稳定性好。 当引物设计优化好后，对于一步法多重RT-PCR反应循环条件的优化变得非常容易，最后优化的条件是:50? 反转录30 min;94?预变性3 min;(94?变性30 sec，56?退火30 sec，72?延伸40 sec)×40循环;72?延伸7min;4?保温。由于不同PCR仪器的性能差异，可根据条件优化适当调整PCR退火温度和时间。本标准研制过程中采用的仪器是美国BIORAD公司的C1000型PCR仪，建议程序设置中升降温速率参数设定为0.8-1?/sec。 本标准研制中对单一病毒感染、二重病毒感染(3种两两组合)和三重病毒感染的情况均进行了测试，实验结果显示本方法特异性强、扩增效率高，代表性多重RT-PCR实验电泳结果见下图，以供参照。 M 1 2 3 4 5 6 7 8 bp 1500 1000 bp 500 400 376 300 270 200 186 100 图1 多重RT-PCR检测3种腹泻病毒 M:100bp DNA Marker;1:A组轮状病毒;2:星状病毒;3:诺沃克病毒;4:A组轮状病毒+星状病毒;5:A组轮状病毒+诺沃克病毒;6:星状病毒+诺沃克病毒;7:A组轮状病毒+星状病毒+诺沃克病毒;8:空白对照(HO) 2 3.2.4 灵敏度实验 (1)样本处理:取A组轮状病毒、诺沃克病毒、星状病毒3种病毒的起始浓度相当 6 的阳性样本等量混合，然后采用真空离心浓缩仪适当将其浓缩，测OD为76.5ng/μL， 0-5将其10倍梯度稀释为:10~10，共计6个浓度梯度，每个浓度梯度各取6.56μL作为模板用于三重RT-PCR扩增，即每个梯度的实际模板量(核酸总量)依次约为:500ng、50ng、5ng、0.5ng、50pg、5pg。该实验重复3次以验证其稳定性。 (2)结果:三重RT-PCR反应结束后，取5μL产物在2.0%的琼脂糖凝胶中进行电泳，电泳时间为45分钟，典型结果见图2所示。3次实验后综合评价得出每种病毒重现 -4性稳定的检测灵敏度，轮状病毒、诺沃克病毒和星状病毒的最高检测限依次为10、-3-310、10，即可检测到的核酸量依次为50pg、0.5ng、0.5ng。 M 1 2 3 4 5 6 7 bp 1500 1000 bp 500 400 376 300 270 200 186 100 图2 多重RT-PCR检测3种腹泻病毒混合样灵敏度实验 M:100bp DNA Marker;1:核酸总量500ng;2:核酸总量50ng;3:核酸总量5ng;4:核酸总量0.5ng;5:核酸总量50pg;6:核酸总量5pg;7:空白对照(HO) 2 3.2.5 大样本的评价实验 为了评价本标准所建立的多重RT-PCR方法的特异性、稳定性和灵敏度，我们采用双盲实验，选择了200份不同类型的小儿腹泻样本进行评价实验。样本类型包括:3种病毒单纯感染的阳性样本，2种病毒复合感染的阳性样本，腺病毒、扎如病毒感染的样本，未检出常见5种腹泻病毒的样本，其中还包括特别选择的一些极弱阳性的样本以评价检测的敏感性。实验结果对比后显示符合率为100%。 7 4 方法的验证 为了验证在不同实验室条件下，本标准所建立的多重RT-PCR方法的特异性和稳定性，我们选择了3家单位(质检系统内2家，系统外的地方三甲医院1家)对本方法进行验证评价。3家单位的验证结果均认为轮状病毒(A组)、诺沃克病毒、星状病毒的多重RT-PCR检测方法特异性较强，灵敏度较高，能在国境口岸腹泻病防控和应急检测中发挥重要作用。 验证报告见7 附件。 5 建议 为了提高口岸实验室检测工作的效率，缩短检测时间，提高检测能力，建议在卫生检疫领域的制标工作中，针对病原体的分子生物学检测方法类标准，可以以症候群为类别，提倡和加大针对多病原体的多重检测方法的制订工作。本标准建立的3重RT-PCR方法稳定性好、特异性较强，适合于在口岸的卫生检疫实验室进行推广和普及，建议在专家严格审核后尽快颁布。 6 参考文献和标准 [1] 多重RT-PCR用于临床检测三种胃肠炎病毒的研究. 微生物学通报,2007,34(3):401-5. [2] 婴幼儿腹泻常见病毒多重RT—PCR检测技术的建立. 现代检验医学杂志, 2009,6(24):42-5. [3] SN/T 1635-2005 贝类中诺沃克病毒检测方法 普通RT-PCR方法和实时荧光RT-PCR检测 [4] Development of a one step real-time RT-PCR method for sensitive detection of human astrovirus. J Virol Methods, 2006, 133(1):14-9. 8 7 附件 7.1 广东出入境检验检疫局验证报告 9 7.2 厦门国际旅行卫生保健中心验证报告 10 7.3 广州市妇女儿童医疗中心验证报告 11