异源5_非翻译区在猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性拯救过程中的功能解析

异源5_非翻译区在猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性拯救过程中的功能解析 ?研究论文? 5 异源 ′非翻译区在猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性 拯救过程中的功能解析 112211高 飞 ，陆嘉琦 ，姚火春 ，杨 倩 ，袁世山 ，童光志 1. 2002412. 210095(中国农业科学院上海兽医研究所，上海 ;南京农业大学动物医学院，南京 ) Porcine reporoductive and respiratory syndrome virusPRRSV摘 要:猪繁殖与呼吸综合征病毒,, ,基因组 5 非′翻译区 ,untranslateregiond ,UTR,对病毒复制转录等过程至关重要,但其发挥作用的机制尚不清楚。本实验室将欧洲型 PRRSV 5′ UTR 替换入北美型 PRRSV 弱毒株感染性克隆 pAPRRS 的骨架中,构建 pAPLV5。经过 DNA 转染入 MARC-145 细胞系中, 两次传代后,拯救出嵌合病毒 vAPLV5。通过对嵌合病毒的全长测序发现,嵌合病毒基因组较亲本病毒发生了碱基突变,突 变主要集中于 Nsp2 和 Nsp9 位置。将 Nsp9 位置,病毒的 RNA 依赖的 RNA 聚 合 酶,RNA-dependenKNt A povymerase, RdRp,的 4 处突变位点引入嵌合病毒的感染性克隆 pAPLV5,所构建的 4 个突变嵌合克隆转染 MARC-145 细胞后无需传代 CPEP0 vAPLV5 即产生细胞病变,cytopathic effect,,,且 代病毒滴度较原嵌合病毒 高。通过半定量负链和亚基因组检测发现, RNA PRRSV 5′ UTR RdRp 5′ UTR 突变嵌合病毒的 合成水平也较亲本嵌合病毒高。由此推测 功能可能与 相关,异源的 通过 突变 RdRp 来发挥其调控作用,完成病毒拯救过程。 关键词:非翻译区,RNA 依赖的 RNA 聚合酶,嵌合病毒,转染 中图分类号:S852.659.6文献标志码:A文章编号:1674-6422(2011)06-0007-08THE RECOVERY OF CHIMERIC TYPE II PORCINE REPRODUCTIVE AND RESPIRATORY SYNDROME VIRUS WITH REPLACEMENT OF TYPE I 5′ UNTRANSLATED REGION 112211GAO Fei, LU Jia-qi, YAO Huo-chun, YANG Qian, YUAN Shi-shan, TONG Guang-zhi (1.ShanghaVi eterinary Researchnstitu Ite, CAAS, Shanghai 200241, China; 2.Coollegf Vetee rina ry Medicine, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China) Abstract: The 5′ untranslated region (UTR) of the genomic RNA is believed to be vital for the replication and transcription of Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), but its functional mechanism remains unclear. In the present study, a chimeric clone pAPLV5 was generated by substituting type I 5′ UTR into the backbone of infectious full-length cDNA clone pAPRRS of type II attenuated strain. After two passages post transfection in MARC-145 cells, the chimeric virus vAPLV5 was rescued. Sequence analysis of full-length genome of the chimeric virus vAPLV5 identified several nucleotide mutations, which mainly occurred in Nsp2 and Nsp9. Subsequently, four mutations that were generated in Nsp9 (RNA dependent RNA polymerase, RdRp) were introduced into the chimeric clone pAPLV5 to create four different mutants. As a result, transfected MARC-145 cells developed CPE without any passage. Viral titers of these four mutants were higher than original chimeric virus pAPLV5. Semi- quantitative RT-PCR was conducted for negative-strand genomic RNAs and sg mRNAs analysis. The results showed that the RNA synthetic level of the four mutant viruses were higher than vAPLV5. In conclusion, PRRSV 5′ UTR was closely associated with the 收稿日期:2011-10-24 国家自然科学基金面上项目,30972204,,欧盟“第七框架”项目,245141 ,基金项目: 高飞,女,助理研究员,博士研究生,预防兽医学专业 作者简介: 袁世山,E-mail: shishanyuan@hotmail.com,童光志,E-mail:gztong@shvri.a .cnc 通信作者: regulatory function of RdRp, and heterologous 5′ UTR might play a role in virus rescuing processes through alteration in RdRp. Key words: Untranslated region (UTR); RNA dependent RNA polymerase(RdRp); chimeric virus; transfection 随后多聚蛋白被加工分解成若干较小的非结构蛋白对于单股正链 RNA 病毒来说,其基因组 5 ′UTR ,nonstructure proteins,,, Nsps从而产生了复制酶, 是病毒复制的关键,同时也在其他的许多生物合成 病毒复制酶所在区域为 Nsp9。 RdRp是复制酶的 催 过程中发挥作用。许多研究发现,单股正链 RNA 病 [15]化功能元件,其结构域对于 RNA 的复制至关重要 毒的 5′UTR 的某些二级结构能够防止核酸外根据序列分析,两型 5′UTR 区域的长度不[1]切酶对 基因组 RNA 的降解 。例如,脊髓灰质炎同,序列 同源性只有约 50%,但是根据二级结构预测结果发 病毒 5′ 端的一个苜蓿叶状的二级结构对于基因现,所有 PRRSV 均存在不少保守茎环结构。由此, [2]组 RNA 的稳 定性至关重要 。5 ′UTR 对 推测保守茎环结构会在病毒复制过程中可能发挥作 RNA 合成也是至关重 要,在登革热病毒中,其 用。 5′末端的一个 RNA 茎环 结构作为 RdRp本研究将欧洲型 PRRSV 5UTR 替换′,RNA 依 赖 的 RNA 聚 合 酶,RNA dependentRNA 入北美型 PRRSV 弱毒株感染性克隆 pAPRRS 的 骨 架 中, polymeras,结合位e点,通过长距离 的 RNA-RNA 相构 建 pAPLV5。 经 过 DNA 转 染 入 MARC-145 细 胞 系 互作用促使 5′末端与基因组的 3′ 端模中,两次传代,第一代无法拯救出病毒,CPE 出现 [3, 4]板识别来启动特定 RNA 合成 。脊髓灰质炎 病毒在于 MARC-145 细胞上盲传的第二代,后,拯救出 的苜蓿叶状结构不仅对稳定基因组有作用,且 对病嵌合病毒 vAPLV5。通过对嵌合病毒的全长测序发 [5,6]毒基因组正链和负链 RNA 合成也是必需的 。 在对现,嵌合拯救病毒基因组较原嵌合克隆发生了碱基 动脉炎病毒科的马动脉炎病毒的研究中发现, 突变,突变主要集中于 Nsp2和 Nsp9位 置。我们将 5 末端的转录调控序 列,transcriptional ′Nsp9位置的四处突变位点引入嵌合病毒的感染性 克 regulatory sequence,TR S,所在的先导序列中的顶端隆 pAPLV5,进行病毒拯救并对拯救病毒进行了详 茎环结构 实生物学特性分析。 ,leaderTRS hairpin,LT H,在病毒亚基因组转录中 1 材料与发挥着启动子作用。有趣的是,在对动脉炎病毒科 材料 1.1 中其他成员甚至冠状病毒的 5末端序列结构′ 乳仓鼠肾细胞,BHK-21, ATCC1.1.1 预测中 同样发现了茎环结构,因此推断 LTH 这个细胞与病毒 No. CCCL10,和 非洲绿猴肾细 胞,MARC-145 顺式元件 是病毒亚基因组 mRNA 转录的关键性结构 [7, 8]ATCC No. CRL-12219, Manassas VA, ,由本实验室 因子 。 另外,5UTR 还可对病毒蛋白的′ [9] 保存,细胞培养生长液为含有 10 % 胎牛血清,FBS 翻译进行调控,例 如黄病毒科 和小 RNA 病毒科 [10, 11] ,Gibco-BRL, GaithersburgMD, ,的 EMEM,维持液 的一些成员中, 发现 5 UTR 中通过内′ 为 2% FBS 的 EMEM (ATCC, ManassasV,A 部核糖体进入位 点,internal ribosomal entry site, USA), typeI I PRRSV vAPRRS (GenBank登录号, GQ330474 IRES,来调控蛋白翻译。 作为亲本病毒与其他嵌合病毒作比较,同时也作为与 猪繁殖与呼吸综合征病毒,Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV,,属于套式 [16]Invitrogen公 司,OPTI-MEMLTX/PLUS 试剂购自 研究室构建 。根据相应位置,不同的上下游 购 自 Invitrogen公 司,RT-PCR 反转录酶为 AMV 引物,对 pAPLV5 转染细胞拯救出的病毒 vAPLV5 购自 TaKaRa 公司,Norther杂交试剂购n 自 Ambion 进行全基因组测序,以期找到突变位点。并利用定 公司。 点突变 PCR 技术,分别构建 vAPLV5 传代衍生突 1.1.3 主要仪器 超净工作 台、PCR 仪、恒温培养 变全长克隆,所有突变质粒均经过突变位点测序及 摇床、恒温培养箱、水平电泳仪、荧光倒置显微镜 Sma I 酶切鉴定。以 pAPRRS 为 骨 架, 利 用 Afl II ,Olympa公司,,离心机。s 和 Spe I 酶切使其缺失 1693-13116 n片t 段, 构 建 1.2 方法 了复制功能缺失的质粒 pAS 作为检测复制的阴性对 [15, 17]1.2.1 突变 typeI I PRRSV 全长克隆 pAPRRS 以照 。本实验中所用到的引物见 1。 及 type I 5UTR 和 type II 骨架嵌合克隆 ′1 表 文中所用的引物和探针 pAPLV5 由本Table1 Primers and probes for this study 名称 序列 位置 应用 Name*SequencePositionApplicationF1-7823/8401/8914 5′-TCGACGGCGAGCTGACTG -3′ 7716-7733 SOE PCR R1-7823 5′-7804-7833 SOE F2-7823 ACAGCGGGTCgAGCCGCTAGCGGCTAGCAG-3′ 7813-7842 PCR R1-8401 5-8383-8410 ′ SOE F2-8401 GCTAGCGGCTcGACCCGCTGTGGTCGCGGC-3′ 8392-8419 PCR R2-7823/8401/8914 5-12298-12315 ′ SOE R1-8914 AGGGCATGGaCGTGGCCAAGACGGAGCG-3′ 8895-8924 PCR F2-8914 5′-8904-8935 SOE F1-9433 TTGGCCACGtCCATGCCCTCCGGGTTTG-3′ 8435-8466 PCR R1-9433 5-ACCGGCGACGGTGAAGCC-3′ 9413-9442 ′ SOE F2-9433 5-9423-9453 ′ PCR CCGAGGGCGAaAGGCGAGTTAAACGCCTTT-3′ R2-943315275-15305SOE 5-′ SFLV101100-121(LV) PCR CGTTTAACTCGCCTtTCGCCCTCGGGAAAAAC-3′ SR683 658-683 SOE 5′-SR343 323-343 PCR CCATACCAGCGTCTGTCCTTGACTATCTTG-3′SFLV1 1-19 (LV) SOE 5′-SF2480 2480-2503 PCR GCGAGTTCTGaTATGGCTGTTTTCTTTGGGT-3′SR4463 4444-4463 SOE 5-′SF4344 4344-4373 PCR AACAGCCATAtCAGACTCGCCATCATTTCT-3′SR9753 9722-9753 SOE 5′-SF9348 9348-9366 PCR SR12013 11992-12013 TCCACAGTGTAACTTATCCTCCCTGAATCG-3′SOE SF11210 11210-11236 5-AGCCCAACAGGTATCCTTCTC-3′′PCR RT-5-GGAGCGGCAGGTTGGTTAACACGTGA-′Nucleotide sequencing Qst PCR RT-3′ PCR (-) gRNAs analysis, smRNA7g 5′-TAGCCCAACAGGTATCCTTCTC-3′ SF12 12-32 Nucleotide sequencing 5-ATGATGTGTAGGGTATTCC-3′ ′analysisNucleotide sequencing 5′-CAGGGTGAACGGTAGAGCG-3′ sg mRNA7 analysis SR15284 5-15261-15284 ′Nucleotide sequencing CTCCACAGTGTAACTTATCCTCC-3′F-actin 5-CGTGGTGACAACCCAGAACAATG-3′ β-actin analysis ′ Nucleotide sequencing 5′-R-actin β-actin analysis 5-′ Nucleotide sequencing CCCATCTATGAGGGCTACGC-3′ GCCCCGTCGGTCTCAGTCTTGCCATTTTT-3′pAPRRS GenBank GQ330474pSHE M96262注,引物在 (登录号,)和 (GenBank登录 号,) 基因组中的位置,所有测序用到的引物, Nucleotide sequencing 5-′5-′ Nucleotide sequencing 重叠延伸剪接 PCR 用到的引物,都列于上表中TTTGATGTCACGCACAATTTC-3′ GTACCCGCACACTCTCGACTTCTTCCCCTCAT-3′Nucleotide sequencing 5-TCCCACCATGCCAAACTAC-3′ ′Note: All of the sequencing and SOE PCR primers which located in pAPRRS and pSHE were listed in the table Nucleotide sequencing 5′-CCGATTCAAACCCCCAAGTATG-3′ gRNA),上游引物 为 扩 增 负 链 基 因 组 ((-) 1.2.2 DNA, RT-PCR 待六孔 转 染 突变位点 检测 SF12 SFLV101,下游引物为 SR683,亚基因组 板 的 BHK-21 细胞长到密度大约为 60%~80%, 用 mRNA7, 上游引物为 SF12/SFLV101,下游引物为 SR15284。LipofectaminLTe X & PLUS 试 剂 (InvitrogenCarlsbad, , 然后取 25 μL PCR 产物分别在 1.5% 琼脂糖凝胶CA) 以 等 量 (3.75μg) 全长突变质粒转染 BHK-21 电 泳中鉴定结果。细胞,在 5% CO、37?温箱中培养,转染 72 h后, 2 收集上清,并接种于 MARC-145 细 胞,每天观察 负链基因组复制和亚基因组 mRNA的 PCR 反 应体系见参考文献 [18]。细胞病变 (CPE),当出现 80%的病变 时,收集上 1.2.5 (immunofluorescence analysis清并保存于, 70 ?,作为初次拯救的病毒,标记 间接免疫荧光 IFA) 为 P0。1000倍 稀 释 P0 代病毒液,接种于新鲜的 BHK-21 细胞转染 72 h 后,弃去维持液培养 基。 用 冰 甲 醇 固 定 10 min,1%BS A 室 温 封 闭 3MARC-145 细胞,感染后 d4 收集病毒上清,标记 min,用1 : 600的 PRRSV N 蛋白的特异性单抗,美为 P1,以相同的方式收集P2 ~P5代病毒。 传代的病毒上清用 QIAampViral RNA Mini Kit国 South Dakota State Universit的y Dr . Ying Fan 惠赠,37 ?孵育 2 h,再加入 Alexa Re标记羊d 抗,QIAgen, Hilden, Germany,提取病RNA毒 , 以 提 鼠 的 二 抗 1: 800, 37 ? 孵 育 1 h, PBS 洗 5 遍 取好的 RNA 为模板,使用 TaKaRa 公司的 AMV 反 后, 在倒置荧光显微镜下观察结果。转录酶进行病毒 RNA 的反转录,引物 Qst ( 序列见 引物表 ),得到相应的 cDNA。利用该模板及相应的 1.2.6 为测定第一 轮拯救病毒的生物学特性分析 ,first cycle),拯救病毒滴度将pAPRRS , pAPLV引物得到突变位点所在的 PCR 片段,PCR 产物经 1% 的琼脂糖凝胶电泳鉴定及纯化后,送 Invitrogen公 及其衍生全长突变体按照 1.2.2 的转染方法转 染 80%密度的六孔 板 BHK-21 细胞。待转染 48 h后 ,司 进行测序,测序结果用 DNAStar软件 与 vAPRRS 收集细胞培养上清在 MARC-145 细胞上进行第 一基 因 (GenBank 登录号,GQ330474)进行比对。 [19] 轮 病 毒 TCID滴定 。具体操作步骤如 下,90%1.2.3 全基因组测序 用 QIAampVira l RNA Mini Kit 50 密 度 的 MARC-145 细 胞 在 96 孔板上培养,用 2%(QIAgen, Hilden, Germany从 ) vAPLV 5 的 病 毒 空 斑中挑取单个克隆抽提病毒 RNA,抽提操作步骤 FBS 的 EMEM 进行 10 倍比稀释,每孔 100 μL 上 按照试剂盒提供的 清及上清倍比稀释液覆盖细胞单层,每个稀释度重protoco进l 行。空斑方法参见本 复 4 孔,感染 5 d 后,根据每孔产生 CPE 的情况,文 1.2.6.1。 用 TaKaRa AMV 反转录酶进行反转录 按照计算公式,计算病毒滴度,画柱状图。获得病毒全长 cDNA, 根据已发表文献 [16] 报道所 用的引物以 cDNA 为模板进行分段扩增,并克隆至 2 结果pGEM-T 载体中,进行病毒全长测序。 vAPLV5 全长测序发现 Nsp9 位置出现 4 处突2.1 1.2.4 mRNA 负链基因组复制及亚基因组 转录水平 嵌合体 pAPLV5 转染 BHK 变位点引发有义突变分析 以提取的细胞总 RNA 为模板,用引物 Qst进 21 细胞后,收集上清于 MARC-145 细胞上传代, 行反转录,共 20 μL 体系,接着 42 ?水浴 1 在第二代拯救出了病毒。选取 P3 代病毒挑取空斑 h, 克隆进行全长测序,发现 Nsp9区 域,病毒的 RNA 最后冰浴 2 min。接着进行 PCR 扩增。首先进行 依赖性 RNA 聚合酶,RdRp,出现4 处突变位点, β-actin 内 参 扩 增,PCR 上下游引物为 F-actin和 毒克隆中,且在传代过程中稳定存在。变 的 PCR 产 物 和 pAPLV5, 用 此 Avr -Xba I 片 II 为检测上述全长 段 (8959-14772nt替) 换 pAPLV5 中相应片 段,见 2.2 嵌合衍生突变病毒的构建 Nsp9区 域 4 个突变位点对病毒感测序发现的病毒 图 1。而 8401 位、891位4 和 9433 位突变体在构建 时所用到的酶切位点为 Pme I (7800位, pAPRRS) 染性以及基因组 RNA 合成的影响,通过重叠延伸 和 剪 接 PCR (SOE PCR) 分别替换嵌合克隆 Eco RV (12270位, pAPRRS),同样通过酶切获 pAPLV5 相应位置的核苷酸 (7823 位、8401 位、得 Pme I-Eco RV 突变片段和 pAPLV5 的相应载体 8914 位、 片段进行连接。对得到的全部全长突变体经测序 9433位 ),引物见引物表 , 以 pAPLV5 的 DNA 为 和 Sma I 酶切鉴定均证明构建成功,见图 1。分别 模板并用两对引物进行 SOE PCR。9433位突变 体 命 名 为 pAPLV7823、pAPLV8401、pAPLV891和4 pAPLV9433可用于后续试验中。 构建是用 Avr II 和 Xba I ( 分 别 在 pAPRRS 中 的 位 置 分 别 为,8959 位 和 14772 位 ) 分别酶切含有突 bp 1 Nsp9 4 SOE PCR Sma I 图 突变 区域 个位点的 产物及嵌合突变体 酶切鉴定图谱 Fig. 1 Product of SOE-PCR for chimeric revertants and identification of full-length cDNA clone by Sma I digestion 1: DNA 分子量标准 (DL15000); 2: pAPLV9433SOE 第三段产物 ; 3: DL15000; 4: pAPLV8914SOE 第三段产物 ; 5: DL15000; 6: pAPLV8401; 7: pAPLV7823SOE 第三段产物 ; 8: pAPLV5; 9: pAPLV7823; 10: pAPLV8401; 11: pAPLV8914; 12: pAPLV9433 Sma I 酶切鉴定图谱 ; 13: DL15000 1: DNA Marker(DL15000); 2: SOE end-product of pAPLV9433; 3: DL15000; 4: SOE end-product of pAPLV8914; 5: DL15000; 6-7: SOE end-product of pAPLV8401 and pAPLV7823; 8-12: pAPLV5, pAPLV7823, pAPLV8401, pAPLV8914, pAPLV9433 Sma I enzyme map; 13: DL15000 毒有所提高,提示了异源 5 UTR 功能的发′2.3 嵌合衍生突变病毒较嵌合亲本病毒更早产生 挥可能 将等量上述 4 株突变全长克隆、pAPLV5 以CPE 与病毒基因组 Nsp9区 域 (RdRp)有重大关联。 及亲本病毒 pAPRRS 转 染 BHK-21 细 胞,用间接 2.4 突变病毒与野毒的基因组复制与亚基因组转录 免疫荧光来检测核衣壳蛋 白,N,表 达。发现均 的分析比较 将所有全长克隆转染 BHK-21 细胞, 能产生抗 N 蛋白的特异性荧 光。pAPLV5 转 染 孔 24 h后提取细胞 总 RNA,RT-PCR 检测亚基因组,视野中荧光量较 少,pAPLV7823、pAPLV8401、 检测引物见引物表。结果显示,所有的全长突变克 pAPLV8914和 pAPLV9433转染孔中荧光量与亲本 隆均能检测到 sg mRNA 7 的 合 成, 且 pAPLV5 嵌 pAPRRS 孔相当,见图 2。将各自的 BHK-21 转染 合突变体 sg mRNA 的含量明显少于其它突变体,7 上清分别转移至 MARC-145 细 胞 中,4 株衍生突 如图 3 所 示。此外所有突变体转染后 24 h 均检测 变嵌合病毒均在 P1 代产生 CPE,pAPLV5 传 代 两 到负链基因组,也呈现同亚基因组 mRNA 合 成 一 次出现 CPE。暗示衍生突变嵌合病毒感染性较亲本 样的趋势,pAS为复制阴性对照质 粒,。表明异源 2 N 图 嵌合突变病毒及其传代衍生体的间接免疫荧光,蛋白特异性抗体,检测 Fig. 2 IFA detection (N-protein McAb) of the mutant viruses on BHK-21 cells 3 1 2 4 5 6 7 8 3 (-)strand genomicRNA Chimeric smRg NA7 -actin β 3 图 突变病毒与野毒的基因组复制与亚基因组转录的分析比较 Fig. 3 Analysis of genomic RNA replication and sg mRNA transcription for mutant viruses and WT 1: pAPRRS; 2: pAPLV5; 3: pAPLV7823; 4: pAPLV8401; 5: pAPLV8914; 6: pAPLV9433; 7: pAS; 8: 空白对照 1: pAPRRS; 2: pAPLV5; 3: pAPLV7823; 4: pAPLV8401; 5: pAPLV8914; 6: pAPLV9433; 7: pAS; 8: Mock 5UTR 的替换不会阻断负链基因组合成,但′L 会使负 链合成水平下降。根据全长测序结果,将 type II 的 Nsp9 区域相应突变后能使负链 RNA 合成水平相应 提高。 2.5 突变病毒与亲本毒在病毒生物学水平的比较 按 照 1.2.6 的方法对突变病毒和野毒进行 P0 代拯 救病毒进行滴定,结果如图 4 所 示,从中可见在 BHK-21 细胞上转染的 P0 代亲本毒 vAPRRS 的 滴 3.67 度 为 1×10TCID /mL ,vAPLV5 滴 度 为 0, 50 1.23 vAPLV7823为 1×10TCID /mL, vAPLV8401为 50 1.51 4 图 突变病毒的第一轮拯救病毒浓度滴定 1×10TCID / mL , vAPLV8914为 1×10TCID /50 50 1.33 DNA 分子的催化酶。structur,均可以e与 MHV 的相应 个茎环结 构,SL RdRp 是在拥有 RNA 核酸,不涉及 DNA 阶段 结构相替换而不影响病毒的感染性和病毒生物学特 的病毒基因组中必要的编码蛋白。目前研究表明, 性。但是研究也指出因为二者的 TRS 所处位置的不 病毒 RdRp 发挥生物合成过程必须与病毒基因组 同,所以二者整个的 5′UTR 在功能上无法相互 替换。 而本研究第一次报道了 PRRSV 5′ 和 3′端的非翻译区相互作用。例如,typeI 的 5 ′ UTR 在 在黄病毒科成 员登革热病 毒,Dengue virus, typeI I 基因组骨架上能完全发挥调控作用,这对于 DENV,基因组 中, 病毒 5 ′UTR 中存在一 PRRSV 调控机制,致病机理有重要的指导意义。 个 SLA 结构,它为 RdRp 提 供了结合位点,然后 参考文献 通过 5末端和 3末端环化序列 ′′ [1] Gallie D R. A tale of two termini: a functional interaction ,cyclization sequence,CS, 的碱基互补使病毒基因 between the termini of an mRN A is a prerequisitfor e 组两端环化,通过这样的长距离的 RNA-RNA 相互 efficient translation initiation[J]. Gene, 1998,1 216(1)-11. : 作用,使 RdRp 从 3端起始病毒负链基因组′[2] Barton D J, O'Donnell B J, Flanegan J B. 5' cloverleaf [3]的合成 。在蜱传脑炎病毒, Tick-borneencephalitis in poliovirus RN A is a cis-acting replicatioelement n virus, TBEV,的 5′UTR 中也发现了多对这requiredfo r negative-strand synthesis[J]. EmbJ, 2001,o 样的远距离相 互作用因子。病毒的 RdRp 也是通过 20(6): 1439-1448. CS 起始病毒 基因组的合成的。以上的病毒由于无 [3] Filomatori C V, Lodeiro M F, Alvarez D E, et a l . A 5' RNA element promotes denguviruse RN A synthesis on a 5端帽结构, 采用 CS 环化基因组两端同 ′ circular genome[J]. Genes Dev, 2006, 20(16)2238-2249.: RdRp 作用起始复制。 而在某些有 5端帽结′ [4] LodeiroM F, FilomatorCi V, GamarnikA V. Structural 构的单股正链 RNA 病毒,如 脊髓灰质炎病毒and functional studieof ths e promoter elemenfor t dengue ,poliovirus,的复制则是通过形成 核糖核酸戴白复virus RNA replication[J]J. Virol, 2009, 83(2):993 -1008. 合 物,ribonucleoprotein,RNP 来 ,起始复制,其 [5] AndinoR , Rieckhof G E, BaltimoreD . A functiona l5UTR 的一个苜蓿叶状茎环高级结构 与病毒′ribonucleoprotein complex forms around the of 5' end 的病毒蛋白酶多聚酶前体多肽,3CD,,以 及 polypoliovirusRNA[J] . Cell, 1990, 63(2):369 -380. [6] HeroldJ , AndinoR . Poliovirus requires a precise 5fo' r end ,rC,结合蛋白,PCBP,结合,然后连接到 poly efficient positive-stranRNdA synthesis[J].J Virol, 2000, ,A,结合蛋白上与 poly,A,尾相连,形成的 RNP 74(14): 6394-6400.将病毒基因组的 5端和 3端相连,在 ′′[7] Van Den Born E, GultyaevA P, SnijderE J. Secondary [2]RdRp 的 作用下,开始负链基因组延伸 。 而 在 structure and function of the 5'-proximal regioof nthe GBV-B 的 研究中,发现 NS5A ,RdRp区域,、 equine arteritivirus s RNA genome[J]RNA. , 2004,10(3): 5′NTR 和 3′ NTR 在病毒生命活动 424-437. 过程中具有重要相互作用,只 有在这些元件共同作 [8] van den Bor n E, Posthuma C C, Gultyaev A P, et al. [20]用下,病毒才能保证正常 RNA 合成过程 。通过对Discontinuous subgenomiRNcA synthesisin arteriviruses is guided b y an RNA hairpin structure locatein d th e 异源 UTR 在 typeII PRRSV 骨 架的嵌合病毒研究, genomic leader region[J]J Virol. , 2005,79(10): 6312 - 发现异源 UTR 的替换导致了 RdRp 区域的若干核苷 6324.酸的相应衍生突变。嵌合病毒 转染细胞后需传代两[9] Dumas E , Staedel C , Colombat M , et al. A promote r次才可以拯救出病毒,而人为 引入这些突变于嵌合activity is presenit n the DN A sequence corresponding to 全长突变克隆后,在传代一次 即可拯救出病毒,从 N the hepatitis C virus 5' UTR[J]. Nucleic Acid s Res, 蛋白表达量、第一轮病毒滴度、 病毒基因组复制和亚 2003,31(4): 1275-1281. 基因组 mRNA转录水平上分析, 衍生突变病毒比亲[10] RijnbrandR , Abell G, LemonS M. Mutational analysis of the GB virus B internal ribosome entry site[J]J Virol,. 本嵌合病毒在病毒感染性、RNA 合成水平上均有提 高,由此,暗示 5UTR 和 RdRp 可能存在重′ 2000,74(2): 773-783. 51(3): 271-279. [11] Rijnbrand R , van der StraateTn , van Rijn P A, et a l .[17] Zheng H, Sun Z, Zhu X Q, et a l . RecombinanPRRSt V Internal entroyf ribosomesis directedb y the 5' noncoding expressin gporcin e circoviru s sequenc reveale s n ove region o f classical swine fevevirur s and i s dependent aspecot f transcriptional controof porcinl e arterivirus[J] on the presence of an RN A pseudoknot upstreaof m the Virus Res, 2010, 148(1-2)8-:16. initiation codon[J]J Virol. , 1997,71(1)451: -457. [18] Lu J, Gao F, Wei Z, et al. A 5'-proximal stem -loo [12] Nelsen C J, Murtaugh M P, Faaberg K S. Porcine structuroe f 5' untranslated regioof porcinn er eproductiv and respiratory syndrome reproductive and respiratory syndromvirus comparison: e virus genome is key for viru divergent evolutio non two continents[J] J. Virol, replication[J]Viro. l J, 2011,8 : 172. 1999,73(1): 270-280.[19] Pizzi M. Sampling variatioon f th e fifty percent end [13] WangY , Liang Y, Han J, et al . 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