【doc】豚鼠椎基底动脉缺血—再灌注对耳蜗损伤的实验研究

【doc】豚鼠椎基底动脉缺血—再灌注对耳蜗损伤的实验研究 豚鼠椎基底动脉缺血—再灌注对耳蜗损伤 的实验研究 示该药对动脉硬化性疾病具有较好的防治作用. 有关大蒜降血脂的机.:.可能是其有效成分 可与含巯基的酶或底物发生置换反应,而干扰脂质 的合成.同时也可通过脂酶原理而加速甘油三脂的 水解大蒜降低血浆胆固醇水平,可能是其增加了 粪类固醇和酸性酮醇的排泄.减少了胆固醇和脂肪 酸的生物合成 中华大蒜油为大蒜的提取物,毒性较小,其对 高脂血症大鼠的降血脂和胆固醇作用,可为临床 提供一种安全有效的抗动脉粥样硬化药物.对高 脂肪,高胆固醇膳食的正常人和高血脂患者.长期 服用大蒜油对预防动脉粥样硬化性疾病的发生将 是有益的 参考文献 1叫景华.太蒜药用研究现状山东中医学院,1996.20 郑州大学皇塑(医学版】2002年5月第37卷第3期 L0J:30 2李格.史载祥.大蒜提取物防治冠.病的临床l硬实验研究 进展巾药药理与临床.1996,12(5):4B 3BordiaA,BansaiHC.AroraSK.etalElferaofth sentialoiksofgar!icandoniononalimentaryhyperlipemia. Ather0scIer(]sIs,1975,21(1)15 4徐叔云主编药理实验方法学.第2版北京:人民卫生出 版社.1991.1031 5陈灏珠.动脉粥样硬化和冠状动脉粥样硬化性心脏病.见: 叶任高主编内科学.第5版北京:^民卫生出版社. 200027l 6AdogaGI.Themechanismofthehypolipidemiceffectof thegarlicoilextractinratsfedonhighsucroseandaicohol dietsBiochemBiophysResCOII1]TLLln.1987,142(3J:1046 7聂红.孙学惠.太蒜.见:沈映君主编.中药药理学北京: 人民卫生出版社.20001030 (2001—1225收稿责任编辑综春燕) 豚鼠椎基底动脉缺血一再灌注对耳蜗损伤的实验研究 叶放蕾董明敏 郑州大学第一附属医院耳鼻叫喉科郑州450052 ?女,38岁.博十,副教授,副主任压师,研究方向:耳聋防治,Email:yefangiei@371net 关键词缺血再灌注损伤;耳蜗;诱导型一氧化氨合酶;病理学;超微结构;超氧化物歧化酶;丙二醛;豚鼠 中图分类号R764 摘要目的:探讨椎基底动脉缺血再灌注耳蜗组织损伤方式及其可能的损伤.方法:选用耳廓反射灵敏, 体重300,350g的健康杂色豚鼠72只.随机分成6组.即正常对照组,假手术组,缺血30min组,再灌注1h,6h, 24h组.各组动物分别于手术前及处死前分别测试ABR,耳蜗标本HE染色病理检查,耳蜗电镜桅查,测定耳蜗 组织超氧化物歧化酶(]D)活力,i珂二醛(MDA含量,耳蜗组织诱导型氧化氯台酶(iNOs)免疫组化.结果:缺血 组及再灌注各组脑干诱发电位(ABR)发生明显异常,各波潜扶期明屁延长,阈值升高(P<0.111);外毛细胞变形,细 胞超微结构改变;耳蜗组织MDA古量升高,SOD活力降低;iNOS在耳蜗组织过明显增强.结论:椎基底动脉缺 血再稚注损伤可弓l起豚鼠ABR各渡潜伏朝延长和阑值增高,可造成耳蜗毛细胞段血管纹等组织病理损伤耳蜗 组织SOD活力F降及MI)A升高参与了椎摹底动脉缺血再灌注耳蜗损伤耳蜗组 织在正常情况下,血管纹,毛细 胞及螺旋神经节细胞均有iNOS弱阳性表达,在缺血及再灌注期间iNOS表达增强 Experimentalstudyoncochleavertebrobasilararteryischemia reperfusioni11juryinguineapigs YEFanei,DONG.~/iingrain DepartmentoJOtolaryngology,theFirnAJfiliatedHospita1.ZhengzhouUniversity.Zhengzhou 450052 一 ............ --—-----——-——-—-—--—— L j.nlm]ofZhengzhouUnivers[ty(3:'led[eTa]Sciences)May2002Vo1.37No. 3?32l? Keywordsischemiareperfusioninjury:cochlea;iNOS:pathology;nliCrOS~ructure;soD;MDA:guineapig AbstractAim:Toinvestigateinjuriesofthecochleaafterthereperfusionofvertebrobasilarischemia.Methods: SeventytwohealthyguineapigswithpositivePreyersreflexweightedfrom300tO350gwererandon'dyassignedtO 6groups(一 1Z):thenormalcontrolgrouptheshamoperationgroup,theischemiagroupandthereperfusion groups.ABRwasevaluatedtheh/stomorphology.fcochleaandcochlearnucleuswereobserved.thecont~Dtof MDA(molondialdehyde)andactivityofSOD(superoxided[smutatse)incochleawereiTleasoredandtheiNOSim— ntunoact[v[tyincochleaR'aSstudied.ReslJlts:Theprolongedlatenciesandgradualelevatio nofthethresholds~zePe clearlyseenintheischemiagroupandreperfusiongroups.Les{onsgMeredetectedinthehaircellandthestriavascu iaristheSODactivitiesdecreased—andMDAconceptrationsincreased】abe】 ingexpressionOfiNOSincreasedsignif [cantly.Conclusions:Thevertebrohasilararteryischemiareperlus[oninjury(VIRI)CRItincreasethelatencyofABR %KraVeSandthresholdinguineapigsTheVIRIcanCausethelesionsofthecortiandthestriavascutar[swhichare ~]oresevereinreperfusioninjuryandCausethedecreaseofSODactivhiesandncreofMDAeonlentsofcochlea ThereisslightlypositiveexpressionofiNOSinthehaircellthestriavascularisandthespiralganglioninnormal cochleatissuesTheexpressionofiNnSincreasedwith[heseverityofischem[areperfusion. 椎基底动脉缺血或灌注不足是一种常见的脑 血管病.常引起耳聋等症状.为了观察缺血一再灌 注耳蜗组织是否损伤,其损伤方式如何及损伤机 制.作者采用豚鼠椎基底动脉缺血一再灌注模型一 记录不同时期ABR的改变.观察听觉末梢感受 器耳蜗组织的病理生理改变,并结合免疫组化方 法观察了诱导型一氧化氮合酶(iNnS)活性的改变 与耳蜗再灌注损伤的关系. 1材料与方法 11实验动物与分组选用耳廓反射灵敏,体重 3?,350g的健康杂色豚鼠72只.雌雄不拘.由河 南省实验动物中心提供.随机分成6组.每组动物 l2只.即正常对照组,假手术组,缺血组,再灌注l h,再灌注6h,再灌注2,1h组. 1.2椎基底动脉缺血一再灌注模型建立实验动物 采用氯胺酮(40mg/kg)和静松灵(10mg/kg)联合 麻醉.颈前正中切口,解剖一侧颈总动脉及基底动 脉,用微动脉血管夹夹闭30min,松开血管麦.手术 显微镜下观察血流恢复情况,可见松开的远端血管 血液充盈.血流恢复(实验中个别恢复不畅的动物剃 除)术后逐层对合组织.由松开血管夹开始计时分 组,分缺血组,再灌注1h,6h,24h4组.假手术组 仅暴露血管.不行夹闭. 1.3脑干诱发电位【ABR)测试实验动物麻醉后 保温.置于隔音室中.隔音室本底噪声(nHI)为30 dB采用银质针形电极,记录电极置于两外耳道口 连线与颅正中线交叉处皮下.参考电极置于两侧乳 突皮下.接地电极置于鼻尖部正中皮下.刺激参数 及刺激参量,用CadwellQuantum84型诱发电位系 统进行测试.用磁屏蔽TDH49型耳机给声,刺激声 时程为100s方波脉冲短声(Click).耳机发声窗距 外耳道口约1.5cm,带通滤波100,300Hz.平均扫 描10ms.扫描平均叠加1000次,增益2000倍,短 声刺激重复率】1.29次/'S刺激强度从70dB开 始,10dB一档递减至II1波消失为止 1.4耳蜗组织切片病理检查4?40g/I多聚甲醛 行活体动脉灌注,断头取出听泡,暴露耳蜗,置于2,5 gI戊二醛中,于蜗尖处向耳蜗内缓慢灌注2.5g/1 戊二醛.4?固定24h;10g/LEDTA脱钙7,10d. 常规脱水.石蜡包埋,常规石蜡切片HE染色.光学显 微镜下观察耳蜗组织毛细胞及血管纹等结构变化. 另备切片用于耳蜗组织iNnS免疫组化染色. 1.5耳蜗组织透射电镜观察耳蜗取材同1.4.解 剖显微镜下取出螺旋器.采用梯度酒精脱水.包埋 剂加DMP一30浸透过夜聚合,半薄切片,染色定 位,超薄切片.日立透射电镜观察,拍片. 1.6耳蜗组织超氧化物歧化酶{SOD),丙二醛 (MDA)检测方法动物断头,冰盒中取出耳蜗.制 成10gL的耳蜗组织匀浆备用.4?3000r/min离 心tOmin,取上清一45?冻存待测SOD,MDA试 剂盒均由南京建成生物研究所提供测定方法 严格按照试剂盒说明进行.用亚硝酸盐形成法测定 SOD活性.单位ku/g.用硫代巴比妥酸显色法测定 MDA含量,单位~mo1./g.组织蛋白测定采用丽春 红S法. 1.7耳蜗组织免疫组化iNOS活性检查厦判断 耳蜗iNnS免疫组化染色SABC法步骤:切片经二 甲苯脱蜡,梯度酒精水化,抗原修复,正常山羊血清 封闭,滴加兔抗鼠iNOS抗体(Sigma公司),置4? ? 322? 冰箱过夜;PBS洗,滴加二抗(生物素化羊抗免 IgG).37?放置30rain;DAB显色,显微镜下观察, 控制时间,至阳性物质呈棕黄色,蒸馏水中止显色反 应,苏木素轻度复染(30s);梯度酒精脱水.二甲苯 透明.中性树胶封片.阴性对照用PBS代替一抗, 其余步骤相同. 结果判断:光镜下iNOS阳性反应物呈棕黄颗 粒状,采用MPIAS一500计算机图像处理系统,灰度 值0(黑)一255(白),分别测量各组动物耳蜗组织不同 部位iNOS平均灰度值. 1.8统计学分析实验数据用?表示,应用 SPSS统计软件包进行统计学处理,两样本均数差异 的显着性检验均采用t检验.多个样本均数差异的 显着性检验应用方差分析.以P<0.05作为差异有 郑州大学(医学版)2002年5月第37卷第3期 显着性. 2结果 2.1豚鼠基底动脉缺血一再灌注ABR改变见表 1正常豚鼠ABR主要由4个波组成,各波潜伏期 及I一?波间期稳定,?波消失最慢,阈值平均 l6.000=3958dB假手术组与正常组相比ABR 各波潜伏期及阐值差异无显着性(P>0.05);缺血 组,再灌注(1h,6h,24h)各组ABR各波潜伏期较 正常组及假手术组明显延长,阈值升高(P<0.01); 再灌注1h组ABR各波潜伏期与缺血组相比无明 显改变(P>0.05).但再灌注6h组可见ABRI波 与缺血组相比差异有显着性(P< 潜伏期延长, 0.05),阈值与缺血组相比无改变. 裹1映血再灌注前后ABR各渡潜伏期,I-Ill波间期爰闻值改变 *与正常组相比P<001,A与缺血组相比P<0.05 2.2耳蜗组织病理改变及iNOS活性改变 2.2.1耳蜗组织切片HE染色及透射电镜观察: HE染色见正常组及假手术组Corti器毛细胞无损 伤,血管纹清晰;缺血及再灌注各组均可见外毛细胞 变形,再灌注6h组织损伤最重,Corti器外毛细胞 缺损.细胞间连接消失.血管纹变薄.耳蜗组织透射 电镜观察缺血组仅见毛细胞表皮板下方次级溶酶体 聚集增多;再灌注1h组可见外毛细胞静纤毛内微 丝解聚,纤毛根缩短,溶酶体膜破裂,表皮板下池肿 胀,表皮板下线粒体肿大,嵴消失,再灌注6h,24h 组外毛细胞次级溶酶体聚积.内含大量吞噬颗粒.内 质网高度扩张,囊泡样变性,线粒体水肿.外毛细胞 胞体变短;但内毛细胞在缺血及再灌注各组与正常 组比较形态无明显变化. 2.2.2耳蜗组织SOD活性,MDA含量变化:见表2 缺血及再灌注各组SOD活性逐渐降低,再灌注(th,6 h)组下降最明显,与正常组相比差异有显着性(P< 0.05);MDA含量升高,缺血及再灌注(1h,6h,24h) 各组与正常组相比差异均有显着性(P<0.05);再灌 注6h组SOD下降,再灌注1h,6h组MDA含量升 高与缺血组相比差异有显着性(P<0.05). 表2各组动物耳蜗组觏SOD,MDA变化 *与正常对照组相比P<0.05,?与映血组相比P<0.05 2.2.3耳蜗组织免疫组化iNOS活性:iNOS阳性 反应物质呈棕黄色,胞浆着色,阴性对照不着色.正 常组及假手术组iNOS在耳蜗各转血管纹,内,外毛 细胞,螺旋神经节细胞内均有弱阳性表达,其中血管 纹表达最强,其次为螺旋神经节细胞,内毛细胞,外 毛细胞.缺血及再灌注各组iNOS在上述各部位表 达逐渐增强,与正常组相比灰度值明显降低(P< 0.05).再灌注6h,24h组iNOS在血管纹表达较 缺血组明显增强(P<0.05),再灌注24h组iNoS 在内,外毛细胞表达较缺血组明显增强(P<0.05). 灰度值统计结果见表3 』0rLlm【.i22,e~z,houUruversity(MedicalSciences)May2002Vo1.37No.3 表3各组动物耳蜗各部位iNOS表达灰度值 ? 323? *与正常组相比P<0.05.?与缺血组相比P<O05 3讨论 31椎基底动脉缺血一再灌注ABR改变椎基底 动脉系统缺血及脑血流量降低,均可引起ABR发生 显着改变.那么随着缺血及再灌注.ABR如何 改变,目前的研究结果不一.有研究发现双侧椎 动脉阻断和一侧颈总动脉结扎,缺血15rain内再灌 注,ABR各波潜伏期及波间期延长.随血液再灌注 约30rain得以恢复正常;而缺血超过15min者随 着再灌注ABR各波潜伏期及渡问期改变不能恢复. Guo等-.在犬脑干缺血再灌注模型上监测脑干诱 发电位.发现阻断脑干血流5min内ABR各渡均消 失.再灌注后波形有所恢复,但随着再灌注的延续 ABR各波波形又趋消失.本实验结果提示,豚鼠椎 基底动脉缺血30minABR各波潜伏期及I-III波间 期延长,闽值升高;血液再灌注ABR各渡潜伏期及 波问期延长及阔值升高并未得以恢复正常,提示椎 基底动脉缺血一再灌注可引起突发性听力损伤,血液 再灌注不能使ABR各波潜伏期及阈值恢复正常. 结合本实验其他研究结果表明:缺血再灌注损伤, 使产生ABR这一生物电现象所属部位神经元代谢 受损,突触效能降低,兴奋性阻滞但椎基底动脉缺 血时问,程度及再灌注时间对ABR改变的影响尚需 进一步研究 3.2椎基底动脉缺血再灌注耳蜗组织的损伤 研究表明机体多种组织缺血后重新恢复血液灌 注会进一步加重原有组织的损伤程度.以往的研究 发现,耳蜗组织缺血损伤,可出现外毛细胞肿胀, 核溶解,缺失,细胞超微结构见外毛细胞线粒体肿 胀,嵴消失,溶酶体增多.但缺血一再灌注损伤,耳蜗 组织如何改变呢?作者研究结果发现:光镜下缺血 组外毛细胞变形,损伤严重的出现外毛细胞缺损,细 胞问连接消失;再灌注1h组,与缺血组变化不明 显;6h,24h可见外毛细胞损伤加重,血管纹萎缩变 薄;而内毛细胞,盖膜未见明显变化.透射电镜观察 缺血组外毛细胞表皮板下次级溶酶体聚集增多,线 粒体数目减少;再灌注6h和24h.胞体肿胀变短, 次级溶酶体聚集,内含大量吞噬颗粒,内质网扩张, 囊泡样变性,溶酶体膜破裂.提示再灌注损伤会引 起耳蜗组织细胞缺血损伤进一步加重, SOD对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重 要的作用.此酶能清除超氧阴离子自由基(O), 保护细胞免受损伤,因此SOD的活力与机体多种疾 病有着密切的联系.机体通过酶系统和非酶系统产 自由基在缺血一再灌注病理过程中急剧 生氧自由基, 增加,引起细胞生物膜上的不饱和脂肪酸脂质过氧 化反应,形成大量的脂质过氧化物如MDA.因此测 定SOD酶活力,MDA的含量可反映组织中自由基 含量和脂质过氧化程度.本实验结果提示,缺血3o rain耳蜗组织自由基MDA含量增多,而SOD酶活 力下降.缺血再灌注各组动物sOD均持续低于正 常或假手术组,而MDA均高于正常或假手术组,提 示在耳蜗组织缺血一再灌注时,组织自由基增加,使 大量SOD消耗,sOD活力降低,又使耳蜗组织局部 自由基大量堆积而造成组织损伤,形成恶性循环. 有实验证实SOD可部分拮抗NO介导的神经毒作 用],本实验中随着再灌注耳蜗组织iOs表达增 强,NO生成增加,同时SOD活力下降,也说明了自 由基的细胞毒性作用.脑缺血一再灌注研究发现, 细胞内钙离子和Na的异常增多,常导致大量的电 子溢出线粒体呼吸链与氧反应生成自由基,远远超 过机体的清除能力,造成自由基堆积,与本研究结果 一 致提示自由基引起的缺血性损伤中,缺血后再 灌注比单纯缺血更加严重. 有研究表明,NO作为一种神经调质参与耳蜗 微循环调节;另有研究表明,No作为一种细胞毒 物质,大量生成时会损伤听觉周围组织,应用N0供 体药硝普钠(SNP)可导致CAP的抑制.故NO 对耳蜗的作用目前尚存在着矛盾.一般认为,iNOS 在基础条件下不起作用,而在缺血,缺氧和某些细胞 因子如肿瘤坏死因子(TNF)等的激活下可诱导N— OS-mRNA的表达,产生释放大量No,发挥毒性作 用.由本实验结果观察到.iNOS在正常组豚鼠耳 蜗Corti器内,外毛细胞,血管纹细胞及螺旋神经节 细胞均呈弱阳性反应,其突触底部及与其相连的神 经纤维也呈弱阳性反应,提示iNOS可能与听觉信 息传递相关.缺血再灌注后iNOS在上述部位表达 明显增强.提示-NOS活性增强,产生大量No.可 能又作为一种自由基参与了缺血一再灌注耳蜗组织 损伤.有研究发现,老年性聋大鼠耳蜗iNOS表 达增强.说明iNOS参与了老年性聋的听力损害过 程.对脑缺血的研究发现神经元型nNOS源性NO 在缺血早期具有神经毒性作用.而iNOS源性NO 介导了缺血一再灌注时期的神经毒性作用.支持 本实验结果.另有实验证实SOD可部分拮抗NO 介导的神经毒作用,本实验中随着缺血一再灌注 耳蜗组织iNOS表选增强,同时SOD活力下降.也 间接说明了NO作为一种自由基的细胞毒性作用. 参考文献 lCarlileS,日85cornDA,PatersonDJTheel[eatofacute hypoxiaonthelatencyofhumanauditorybrainsteme vokedresponseActaOtolaryngo](stockh1,1992,1】2 (61939 2李学佩,马姜蓉,土伟,等.椎基底动脉脑缺血动物模 型北京医科大学,1995,27(61:427 郑州大学(医学版12002年5月第37卷第3期 3GuoJ,WhiteJA,BatjerHH.1ntrave~oHsperfluhrone mulsionadministrationimprovestherecoveryofauditory evokedpotentialsaftertemporarybrainste~lischemiain dogsNeurosurgery,1995,36(2135,3 4NathanC,Induciblenitricoxidesynthase:regulationsub ser~,esfunctionCttrrTopMicrobioiImmunol,1995,196:1 5NathanC.Induciblenitricoxides. ~qithese:regulationsub seFvesfunctiorLCurrTopM[crohiolImmunoi,1995,l96:1 6SiesJoBK,ZhaoQ,PahlmaikK,etcLLGlutamatecalei ilm,andfreeradicalsasreediatorsofischemiabraindam ageAnnThoraeSurg,1995,59(511316 7董民声,董明敏,娄卫华主编.内耳疾病研究进展.郑州: 河南医科大学出版社,1999.143 8孔维佳,往田英,NuttallAI硝普钠耳毒作用的内耳靶组 织耳鼻咽喉一头预外科,1996,3(31:179 9RuanRSLeongSK.YeohKH.Ototoxicityofsodium nitroprussideHearRes,1997,114(12j:169 10WuMD,KimuraM.InalukuS,etai.Effectofagingon theexpressionofiNOSandcelldeathintheiilouseco ehlearspiralganglionOkajimasFoliaAnatJpn,1997, 74(51:155 11AlonsodeLecinanaM,DiezTejedorEPhyslopath0l0gy ofvertehrobasilarischemia.RevNeurol,1998,26(149): 106 (2001—12—17收稿责任编辑赵秋民) 通痹胶囊抗炎,镇痛作用的实验研究 赵永星?潘成学"鹿宏永.'成德方 1)郑州大学药学系郑州4500522)舞阳钢铁有限责任公司职工医院平顶山462500 ?男,30岁,医学硕士,研究方向:临床药学 关键词通痹胶囊{抗炎作用;镇痛作用 中图分类号R2855 摘要目的:研究通痹胶囊的抗炎作用以及镇痛作用.方法:采用经典的大鼠足趾肿胀,小鼠热板法和扭体 ,腹腔毛细血管通透性,二甲苯所致耳肿胀等实验,分别观察通痹胶囊对大鼠急法 慢性炎症,小鼠镇痛作用,毛细血 管的通透性,耳廓肿胀度的影响结果:通痹胶囊具有明显的抗炎作用,剂量为32.4mg/'kg和458rag/kg2个用 药组与阴性对照组相比差异有显着性(P<0.011;通痹胶囊也具有较好的镇痛作用,剂量分别为45.6mg.."kg和 6j.8mg/kg2用药组与阴性对照组比较,对醋酸所致小鼠疼痛和热性疼痛有明显的镇痛作用(P<0.051;330 mg/kg,46.6mg."kg和658mg/kg3个剂量组通痹胶囊还能显着降低小鼠腹腔毛细血管通透性和二甲苯所致耳 肿胀度(P<o,叭).结论:通瘁胶囊有较好的抗炎,镇痛作用.