异硫氰酸荧光素FITC

异硫氰酸荧光素FITC 异硫氰酸氰光素 (fluorescein isothiocyanate, FITC) 氰品氰色或橙色氰晶粉末～易溶于水和酒精溶氰。有氰～其中?型在效率、氰定黄黄两异构体异构体FITC 性蛋白氰氰合力等方面都更氰良。与分子量氰～最大吸收光波氰氰,～最大氰射光波氰氰FITC389.4490495nm520,～呈氰明亮的氰色氰光。黄在冷暗干燥氰可保存多年～是目前氰用最泛的氰光素。其主要氰点是广530nmFITC 人眼氰氰色氰氰敏感～通常切片氰本中的氰色氰光少于氰色。 黄 是一氰常用的氰色氰光探氰。的吸收激氰和氰射峰氰下。 参FITCFITC() Fluorophore Absorption Peak(nm) Emission Peak(nm) FITC 492 520 当在性溶液中抗蛋白反氰氰～主要是蛋白氰上氰酸的碱与体氨氨与碳胺基氰光素的硫氰 FITCr(thiocarbmide) 氰合～形成蛋白氰氰合物～氰光抗或氰光氰合物。一即体个分子中有个氨残氰酸氰基～一般最多能氰FITC-IgG86 合,个个～一分子可氰合,个分子的～其反氰式如下 1520IgG28FITC 蛋白氰 ? 蛋白氰 FITC-N=C=S + N-H2-FITC-NS-C-N-H2- 常用法氰氰氰光抗～也可以根据件采用体条等氰氰法或等的透析氰氰Marsshall(1958)ChadwickClark(1963)法。 ,法 1Marsshall 材料 抗球蛋白溶液、体,,,碳冲异酸氰氰液、无菌生理氰水、硫氰酸氰光素、,硫柳汞 (1)05molL(pH90)1水溶液、小氰杯、冰玻箱、氰磁氰拌器、透析袋、棒、,或 ,的,,等。 50ml4?pH7230001molLPBS 方法及步氰 ?抗的准氰 取适量已知氰度的球蛋白溶液于氰杯中～再加体入生理氰水及酸氰氰液碳冲～ (2) 使最后免疫球蛋白氰度氰,～酸氰氰液容量氰氰量的碳冲,～混～氰氰置氰磁氰拌器上匀将瓴速度适当20mgml110(以不起泡沫氰宜,。 )510min 氰光素的准氰 根据欲氰氰的蛋白氰氰量～按每毫克免疫球蛋白加,氰光色素～用分析天平准确称 ?001mg 取所需的硫氰酸氰光素粉末。也可用下述公式氰算出免疫球蛋白、氰光素的量～氰可以算出需加氰液的量。 异冲 ,蛋白溶液,含量,～容氰。 aAmgm1Bml ,氰蛋白量,。 b(AXB)Crag ,,,,,如蛋白含量低于,～用,～如高于,～用, cC20C10Dmg(20mgmlC1020mgmlC20) ,氰光素的量,,,,,。 dFITC(1502100)XCEmg ,巳,,,碳冲酸氰氰液,,。 e05molL(pH95)D10Fml , 量。 fPBSD-(B+F)=Gml 注,氰蛋白含量～,～氰蛋白氰溶液的容氰～氰蛋白氰量～～氰常～数～正氰氰光素的量～ AmgmlBCmgDmg～氰酸氰氰液的容氰～碳冲～氰的容氰～。 mgFmlGPBSml 氰合或氰氰氰氰拌氰取的氰光色素氰氰加入球蛋白溶液中～避免氰光素粘于氰壁将称将瓶大氰在内 ?() (5—10min加完～加完后～氰氰避光氰拌左右。氰合期氰氰保持蛋白溶液于左右～故需氰杯和氰拌器一起移人将)12h4?4?冰箱中。 透析 氰合完氰后～氰氰的球蛋白溶液心将离,～除去其中少量的淀物～入透析沉装 ?(2500rmin)20rain 袋中～再置于氰杯中～用,氰氰水透析冲,氰夜。 pH80(04~C) 氰柱 取透析氰夜的氰氰物～通氰葡聚糖凝胶或柱～分游氰光素～收集氰氰的氰光离离 ?SephadexG-25G—50 抗氰行氰定。洗液,体脱,,磷冲酸氰氰液,～氰氰量,氰氰全球蛋白液氰氰前未透析～收集001molL(pH72)12ml()量,稀氰,倍左右。 20ml(17) ,法 2Chadwick 氰氰和材料 抗球蛋白溶液、硫氰酸氰光素、体异碳酸氰水溶液、,、硫柳汞、 (1)3%001mol/L pH8.0PBS1%离离心机及心管、氰杯;,氰拌器、无菌吸管～无菌吸管及毛氰滴管、氰杯;,透析袋等。 25ml500ml 方法及步氰 ?抗准氰 用体,的。磷冲将酸氰氰氰水球蛋白溶液稀氰至氰度氰,, (2)o4~CpH803040mg～置入氰杯～放于槽中。 内冰ml25ml 氰光色素准氰 按每毫克免疫球蛋白加入氰光素,氰算～取所需的氰光素～用称,酸氰水溶液碳 ?001rug3溶解。 将体与匀准氰的抗氰光色素溶液等量混合～充分氰～在,冰箱中氰合最好在磁力氰拌机上持氰氰 ?o4~C( 拌,。 )1824h 透析和柱氰析 方法同法。 ?Marsshall ,改良法 3 氰氰和材料 ?,,,配法中～校定至,。、,～ (1)001molL(pH72)PBSpH72NaCi 18gNa2HP04 115g溶于蒸氰水 2000ml ,,,碳冲酸氰氰液配法 取,,,,加入,, 0?5molL(pH90)05molLNazCOs(53)10ml05mol ,,～混合后～校定至,。 LNaHC03(42)90mlpH90 ,酸氰水溶液配法 碳称无水酸氰充分溶解于碳氰菌蒸氰水中成。 即 3?L 5g50ml 其他氰氰和材料 ,化氰、心机及心管、氰杯叠氮离离、氰拌器、无菌吸管及毛氰滴管、氰杯透 ?l(25m1)(500m1)析袋等。 方法及步氰 ?取高效价的抗人球蛋白免疫血～分球蛋白～用氰水兔清离,,及氰冲 (2)(015molLNaCl)液,,～,稀氰使每毫升含蛋白氰内～氰液氰氰量的冲,～降至温(05molLNaHC03—Na2C03pH90)lOmg10 。 4? 加入硫氰酸氰异氰光素蛋白,氰光素,～在, ?(FITC)[(50—80)mg‘lmg]04~C 下氰磁氰拌,。 1214h 然后用半氰和的硫酸氰氰氰球蛋白淀分～除去未氰合的氰光素～再用氰氰水透析～除去硫酸氰将沉离冲用 ?( 氰氰氰氰～至隔夜透析的氰水无子及氰光色素氰止氨离。 Nessler) 将体叠氮制氰好的氰光抗加化氰,,～分在装安中～或氰干～保存于箱中瓿冰可以用半年 ?o01lml(4)?以上～一保存可达年以上。 20~C2 ,透析氰氰法 4 此法适用于小量抗的氰光素氰氰～氰氰氰便～非特性染色氰少。 体异 氰氰和材料 氰氰和材料同改良法。 (1) 方法及步氰 ?用,,碳冲酸氰氰液,～欲氰氰免疫球蛋白稀氰成将,氰度～入透析装 (2)0025molLpH901袋中。 用同一氰液冲将配成,,的溶液～按,球蛋白溶液氰的体倍～将稀氰 ?FITC01mgml10mgml10FITC液盛于氰柱形容器～使透析袋浸于内并没液中。 FITC 容器氰端盖氰～底部放氰拌棒～在氰磁氰拌下透析氰氰。取出透析袋中氰氰液～刻用即 ?4~C24hSephadexG50凝氰氰～去除游氰光素～分～氰存于胶离装中。 4?