氨基酸、蛋白质的性质 - 5

氨基酸、蛋白质的性质 - 5 5(6 氨基酸、蛋白质的性质 一、实验目的 ,(熟悉蛋白质的化学性质。 ,(掌握蛋白质的鉴别方法。 二、实验原理 蛋白质是含氮的复杂生物高分子，是由各种 , 构型的α 氨基酸通过肽键相连而成的多聚物，并且具有稳定的构象。在酸、碱或酶的作用下，单纯蛋白质发生水解，其最终产物是α 氨基酸。 ,(呈色反应 蛋白质中的某些氨基酸的特殊基团可以与特定的化学试剂作用呈现出各种颜色，这种呈色反应可以作为蛋白质或氨基酸的定性检验和定量测定的依据。 (,)茚三酮反应 茚三酮反应是蛋白质中的α 氨基酸与茚三酮水合物在溶液中共热生成蓝紫色化合物罗曼紫(,,,,,,,,’,,,,,,,)的反应。 该反应非常灵敏，是所有α 氨基酸共有的特征性反应。可根据α 氨基酸与茚三酮反应生成化合物的颜色深浅程度以及释放出 ,,,的体积定量测定氨基酸。 (,)米伦反应 米伦(,,,,,,)反应也是蛋白质颜色反应之一。该反应是米伦试剂与含酚羟基蛋白质的颜色反应，可用于鉴别蛋白质中酪氨酸的存在。 (,)蛋白黄反应 蛋白质分子中若含有苯环，则遇浓硝酸加热变黄，此反应称为蛋白质的蛋白黄反应，用于鉴别蛋白质中苯环的存在。除以上各颜色反应外还有缩二脲反应、亚硝酰铁氰化钠反应等。, ,为常用的蛋白质的颜色反应。 表, , 蛋白质的颜色反应 反应名称 试剂(成分) 颜色 鉴别基团 缩二脲反应 强碱、稀硫酸铜溶液 紫色或紫红色 多个肽键 茚三酮反应 稀茚三酮溶液 蓝紫色 氨基 蛋白黄反应 浓硝酸 深黄色或橙红色 苯环 米伦反应 汞或亚汞的硝酸盐、亚硝酸盐 红色 酚羟基 亚硝酰铁氰化钠反应 亚硝酰铁氰化钠溶液 红色 巯基 ,(沉淀反应 ,，蛋白质分子末端具有游离的α—,,和α— ,,,，因此，蛋白质和氨基酸一样，也具有, 两性解离和等电点的性质。在等电状态下，蛋白质颗粒容易聚集而析出沉淀;在非等电状态时，蛋白质分子表面总带有一定的同性电荷，由于电荷之间的相互排斥作用阻止蛋白质分子凝聚。蛋白质是高分子化合物，具有溶胶的一些性质，蛋白质分子表面带有许多极性基团，可与水结合，并使水分子在其表面定向排列形成一层水化膜，这使蛋白质颗粒均匀分散在水中难以聚集沉淀。以上两因素维持着蛋白质溶液的稳定，破坏这两种因素则可使蛋白质沉淀。 (,)中性盐沉淀蛋白质 将高浓度的中性盐加入蛋白质溶液中，盐离子的水化能力强而夺去蛋白质的水分，破坏了蛋白质分子表面的水化膜，产生沉淀，即发生盐析。利用各种蛋白质沉淀所需中性盐浓度不同，可将蛋白质分阶段沉淀，此操作过程被称为分段盐析(,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,)。 (,)有机溶剂沉淀蛋白质 利用乙醇、丙酮和甲醇等一些极性较大的有机溶剂与水之间具有亲和力，破坏蛋白质表面的水化膜而使蛋白质沉淀。 ，,，,，,，(,)重金属离子沉淀蛋白质 某些重金属离子如 ,,，,,，,,和,,等(用 ,，表示)可与带负电荷的蛋白质颗粒结合，形成不溶性盐而沉淀。反应式为: (,)有机酸沉淀蛋白质 苦味酸、鞣酸、钨酸、三氯乙酸、磺基水杨酸等(用 ,,表示)可与带正电荷的蛋白质颗粒结合，形成不溶性盐而沉淀。反应式为: 三、实验用品 试管,,支，,,,,,烧杯,只，离心管,支，离心机,台，玻璃棒,根。 蛋白质溶液，,(,,,,,,,茚三酮溶液，,(,,,,,,,苯酚溶液，米伦试剂，浓 硝酸，,(,,,,,,,,醋酸铅溶液，,(,,,,,,,氢氧化钠溶液，,(,,,,,,,硫酸铜溶液，饱和硫酸铵溶液，无水乙醇，,(,,,,,,, 盐酸溶液，,(,,,,,,, 三氯乙酸溶液，,(,,,,,,,氯化汞溶液，,(,,,,,,,硝酸银溶液，苦味酸，硫酸铵粉末。 四、实验操作 ,(蛋白质的呈色反应 (,)缩二脲反应 取,支试管，加入,滴蛋白质溶液和,(,,,,,,,氢氧化钠溶液,滴，摇匀后加入,(,,,,,,,硫酸铜溶液,,,滴，振荡。观察试管中溶液颜色变化。 (,)茚三酮反应 在,支试管中加入蛋白质溶液,,滴，,(,,,,,,,茚三酮溶液,滴，置沸水浴中加热，,,,,,,,，观察溶液颜色有何变化。 (,)蛋白黄反应 取,支试管，分别加入,(,,,,,,,苯酚溶液,滴和蛋白质溶液,滴，然后各加,滴浓硝酸，注意在盛有蛋白质溶液的试管中是否有白色沉淀生成。再将,支试管置沸水浴中加热，观察各试管有何现象发生。 (,)米伦反应 取试管,支，分别加入,(,,,,,,,苯酚溶液,滴和蛋白质溶液,滴， ,,,,滴。此时，,支试管中有何现象,再将,试管置沸水浴中加热，注意观察然后各加米伦试剂 有何变化。 ,,,,(醋酸铅反应在,支试管中加入,(,,,,,,,,醋酸铅溶液,滴，然后滴加,(,,,,,,,氢氧化钠溶液,滴，摇匀。再加入蛋白质溶液,滴，振荡后将试管置沸水浴中加热,,,,,,。注意观察在整个操作过程中溶液发生怎样的变化。 ,,,,(蛋白质沉淀 (,)中性盐沉淀蛋白质 在,支离心管中加入蛋白质溶液和饱和硫酸铵溶液各,,,。混合 ,,,后静置,,,,,，球蛋白沉淀析出。离心后，将上层清液用毛细吸管小心吸出，并移至另一离心管中，慢慢分次加入硫酸铵粉末。注意，每加一次，都要用玻璃棒充分搅拌，直到粉末不再溶解为止。静置,,,,,后，即可见清蛋白沉淀析出，离心后，弃去上层清液。向上述,支有沉淀的离心管中加入,,,蒸馏水，并用玻璃棒搅拌，仔细观察沉淀的变化。 (,)乙醇沉淀蛋白质 取,支试管，加入无水乙醇,,滴，沿试管壁加入蛋白质溶液,滴。 ,,,静置，观察溶液中是否出现浑浊。 (,)三氯乙酸沉淀蛋白质 在,支试管中加入蛋白质溶液,滴，再加入,滴,(,,,,,,,三氯乙酸溶液。有何现象发生, (,)重金属离子沉淀蛋白质 在,支试管中各加入蛋白质溶液,滴，然后再分别加入,滴 ,,,、,(,,,,,,,硝酸银溶液、,(,,,,,,,,醋酸,(,,,,,,,氯化汞溶液 铅溶液、,(,,,,,,,硫酸铜溶液，观察各试管有何现象发生。 ,,,(,)加热沉淀蛋白质 在,支试管中加入蛋白质溶液,,,，置沸水浴中加热,,,,，观察有何现象发生。 注释 ,,,米伦试剂是汞或亚汞的硝酸盐和亚硝酸盐，能与酚类化合物产生颜色反应。 ,,,在含有胱氨酸或半胱氨酸残基的蛋白质溶液中加入强碱，碱分解胱氨酸或半胱氨酸残基产生硫离子。醋酸铅反应是硫离子与醋酸铅溶液的反应。 ,,,若改变或破坏蛋白质分子的空间结构而使蛋白质沉淀，则会导致蛋白质生物活性丧失以及理化性质改变，即蛋白质变性。生物碱试剂或某些酸及重金属离子会引起蛋白质变性，有机溶剂若使用不当也会使蛋白质变性，而高浓度的中性盐不会使蛋白质变性。 ,,,蛋白质按形状不同分为纤维状蛋白质和球状蛋白质两大类。纤维状蛋白质分子形状类似细棒状纤维，如皮肤、毛发、指甲中的角蛋白。球状蛋白质分子类似于球状或椭圆状，在水中溶解度较大，如血红蛋白、肌红蛋白等。 ,,,有机溶剂用量较少或浓度不大时，现象不太明显，此时可另取一支试管作空白对照。 ,,,氯化汞有毒，使用时应注意。 ,,,几乎所有的蛋白质在加热时都凝固，只是不同蛋白质凝固所需温度不同。在受热凝固时蛋白质变性，在临床上利用该性质可检验尿蛋白。 思考 ,(在本实验中有两次蛋白质与醋酸铅溶液的反应，两次现象是否相同,若不同，请说明原因。 ,(某蛋白质不完全水解产物 , 的分子式为 ,,,,,,,,,,,，, 能起缩二脲反应，并能与亚硝酰铁氰化钠反应产生红色，, 与亚硝酸作用放出 ,,，生成化合物,。,分子式为,,,,,，,完全水解可得两种产物，其中一种没有旋光性，并处在 ,的氨端。试写出 ,,,,,,, 和,的结构式。