狂犬病病毒检测历史及研究进展

狂犬病病毒检测历史及研究进展 卢彦欣1  王雷1  扈荣良2 （1.吉林大学畜牧兽医学院，长春，130062 2.军事医学科学院军事兽医研究所  130062） 狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies virus)感染温血动物和人的中枢神经系统后引发急性致死性脑脊髓炎的一种人兽共患传染病。狂犬病是迄今为止人类病死率最高的急性传染病之一， 无特效的治疗药物，一旦发病，死亡率几近100 %。狂犬病主要分布在亚洲、非洲和拉丁美洲等发展中国家[1 ，2 ] 。2000多年前，我国就有狂犬病的记载[3] ，目前，我国是世界上受狂犬病危害最为严重的国家之一。 人类对狂犬病的认识曾经经历了漫长的历史过程，对其本质的认识也只是在近一百年内才完成的。随着上世纪初期和中叶微生物尤其是病毒实验技术的不断发展，人类对狂犬病本质的认识逐渐深入。在狂犬病认识史中具有里程碑意义的工作，是十九世纪八十年代法国科学家路易斯巴斯德（Louis Pasteur）及其同事发现狂犬病是由一种传染因子引起的，并且这种传染因子不但存在于唾液中，而且出现在整个神经系统，它的真正感染部位是在中枢神经部位。巴斯德及其同事于1885年利用传代获得的固定病毒成功制备成了疫苗。1903年，Negri发现了嗜伊红包涵体，但当时他错误地认为引起狂犬病的病原是一种原虫，并最后将狂犬病命名为“神经细胞恐水病”。尽管如此，数年后，这种Negri小体（嗜伊红包涵体）作为狂犬病的一种重要的诊断特征盛行起来。 1926年超速离心技术、1930年电子显微镜技术的引入以及1928年超滤技术的出现进一步促进了人类对病毒及其本质的认识。二十世纪六十和七十年代，狂犬病病毒的形态、化学组成、抗原特性和细胞培养等才有了一个清晰的轮廓。 狂犬病病毒属弹状病毒科(Rhabdoviridaes)狂犬病毒属(Lyssavirus)，有包膜，其基因组为单股负链RNA，编码N、P、M、G及L 5种结构蛋白。几乎所有的温血动物都对狂犬病病毒易感，犬是本病毒的敏感宿主和贮存宿主之一，在狂犬病的传播过程中起主要作用。狂犬病主要通过动物咬伤后，唾液中的狂犬病病毒经破损皮肤或粘膜侵入体内，在局部组织的神经节繁殖，并进一步侵犯中枢神经系统，最终扩散至外周神经和唾液腺。此外，还有通过消化道、呼吸道以及动物间密切接触等途径感染狂犬病的报道。狂犬病在临床上常现病毒性脑脊髓炎，但是症状常常因动物的个体差异而又有不同的表现，需与其他病毒性脑炎进行鉴别诊断，这就需要进行病原的检测和实验室诊断。本文仅就狂犬病病毒检测的历史与发展现状作一综述。 1. 病毒形态学观察 电镜观察：病毒颗粒呈圆柱体，底部扁平，另一端钝圆，整个病毒粒子的外型呈子弹状，直径75nm，长130～200nm。表面有1072～1900个突起，排列整齐，与负染标本中表现为六边形蜂房状结构[4]。 2. 组织病理学检测 本方法是在现代诊断方法建立以前的通用检测方法。当感染动物的大脑组织经染色(如苏木精染色、姬姆萨和伊红染色) 后，有经验的显微专家可发现脑炎的证据，但本实验并不能作为诊断狂犬病的特异方法，灵敏度也不高，特别是在样品出现自体分解的情况下，即使是新鲜样品也会有40 %的假阴性结果。狂犬病脑炎在大脑组织和脑脊膜的组织病理学变化，包括单核细胞浸润、血管周围淋巴细胞或多型核白细胞成套，淋巴细胞聚集，内基小体的形成，由神经胶质细胞组成的巴贝斯结节的形成等，而其中内基小体(Negri) 的检出最为重要。内基小体呈梭形、圆形或椭圆形，存在于感染动物的神经细胞的胞浆内，直径为3～20μm不等，内基小体最常发现于海马角的锥状细胞和小脑的浦肯野氏细胞中，也发现于不同神经节和髓质细胞及唾液腺、舌和其它器官的神经元中。内基小体呈嗜酸性染色，可用姬姆萨等染色法区分内基小体，内基小体呈品红色，内有小的深蓝或淡紫色嗜碱颗粒。在人工感染的病例中，有的脑组织含有内基小体，有的则没有。临床病例的组织学检查中，发现50 %样品含有内基小体，所以检测内基小体的存在仅作为狂犬病的辅助诊断方法。 3. 活病毒的检测 3.1 小鼠颅内接种分离狂犬病病毒法(Mouse Inoculation Test, MIT) 此方法最初用于狂犬病的诊断是在1935年[5]。依照WHO狂犬病专家委员会推荐[6]，FAT检测为阴性的结果必须再次经动物试验证实。 狂犬病病毒具有较强的嗜神经性，可采用小鼠颅内接种法分离病毒后，再进行狂犬病特异性抗原的检测。试验用小鼠一般选择体重10g左右的健康小鼠，性别、品种不限。3日龄以内的乳鼠，可提高病毒分离的阳性率。可疑动物脑组织或唾液腺组织可用于病毒的分离，从流行病学角度考虑，检查唾液腺中的病毒更为重要，但脑组织的病毒检出率要更高。脑组织需要预先用含1%~5%灭活牛血清的生理盐水或PBS或脱脂奶研磨成10%悬液，离心5min去除粗颗粒；唾液腺需切碎后再研磨，1~2层无菌纱布过滤后，颅内接种小鼠，0.03ml/只，随时观察接种小鼠的表现和体征。小鼠颅内接种狂犬病病毒后潜伏期至少5d，在此期间出现的死亡为非特异性死亡，原因可能是接种污染细菌、接种时损伤小鼠脑组织等。之后逐日小鼠正常、发病、死亡的数量及其病症，其典型症状为竖毛，镊子夹其尾部倒提时出现震颤，置于平面时后腿运动失调、麻痹、直至死亡[7]。同时应用FAT法检测所有死亡或发病小鼠脑组织中的狂犬病病毒。 MIT法的特点：敏感，准确性较高；试验要求不高，适于不具备组织培养条件的实验室分离狂犬病病毒街毒；周期长，仅凭动物发病症状不足以确诊，常常配合免疫荧光法作特异性鉴定。 3.2 细胞培养分离技术(Cell-culture Isolation Techniques, CIT) 20世纪70年代中期以来，各实验室相继用地鼠肾传代细胞(BHK-21)、鸡胚细胞、鼠神经瘤细胞(MNa)和其他传代或原代细胞系分离狂犬病病毒街毒。与小鼠颅内接种法相比所需时间大大缩短。有研究表明，小鼠MNa细胞分离街毒的敏感性并不低于MIT法[8.9]，如果接种物中含有少量的街毒，颅内接种小鼠，仅有50%的分离率，而用CIT检出达99%[10]，但BHK-21细胞分离街毒的敏感性较MNa细胞低。10%脑悬液样品离心去除大组织块后接种MNa细胞，培养18小时或更长时间（4天）后，冷丙酮固定细胞，用荧光标记的抗狂犬病病毒核蛋白抗体染色，荧光阳性者表明检测样品中含有狂犬病病毒。 该方法的特点：敏感，周期短，需配合免疫荧光进行特异性诊断；成本低；需在具备组织培养条件的实验室中进行；适合样本量较大时的检测；样品严重污染细菌或腐败致使样品中病毒失活，会导致分离病毒失败。 4. 病毒蛋白检测 4.1 荧光抗体实验(Fluorescent Antibody Test ,FAT) 狂犬病病毒感染的细胞内有由狂犬病病毒核衣壳聚集形成的包涵体。以提纯的狂犬病病毒核衣壳免疫实验动物制备的多克隆抗体，或抗核衣壳单克隆抗体(单抗)与异硫氰酸荧光素偶联后，可特异地与这些包涵体结合，进行检测。目前利用荧光抗体试验对抗原进行检测的方法已经渐渐取代了对Negri包涵体的检测。该方法是狂犬病抗原实验室诊断最常用、最精确、快速和最可靠的方法[11]。该方法1958年由Goldwasser首创，后经Dean和Kissling改进，目前成为人及动物狂犬病感染诊断的最常用方法。本方法对新鲜样本特别敏感，也可以用于脑或神经组织的印片、涂片或冰冻切片，经过标记有异硫氰酸荧光素的狂犬病病毒抗血清或球蛋白处理后，在紫外线激发下，通过荧光显微镜即可检测。狂犬病病毒阳性标本中分布有大量的黄绿色荧光颗粒，呈不同的形状和大小，较大的圆形或椭圆形发出强烈荧光者为Negri包涵体，而像沙粒或灰尘的较细小的荧光粒子及丝状荧光物，则为神经元或树突中含有的狂犬病病毒颗粒。但是FAT的敏感性及特异性不及MIT。如果利用单克隆抗体，可以增加本方法的特异性，并能区别狂犬病病毒和其他的狂犬病病毒属成员。 该方法的特点是：耗时短，得出结果只需2个小时；敏感性和特异性好；需要训练有素的技术员；需荧光显微镜及高质量的荧光标记抗体。 4.2 酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay ,ELISA) 最初本方法用于检测注射疫苗以后机体内的抗体水平，后来也应用于狂犬病抗原的检测。可通过检测脑组织中的狂犬病病毒核衣壳来做出诊断。将标本于缓冲液或组织培养液中研磨成匀浆，离心取上清，置于微量反应板中孵育(该板已用抗狂犬病病毒核衣壳抗体包被)，然后再用过氧化物酶标记的抗狂犬病病毒核衣壳抗体来检测被捕获的抗原，加显色底物进行酶促颜色反应。后发展成为在微量培养板上包被上兔的抗狂犬病毒核衣壳的IgG抗体，再用过氧化物酶标记的单克隆抗体捕捉狂犬病抗原。该方法1986年由PerrinP建立，对该方法和FAT进行敏感性及特异性对照实验，结果表明与FAT有很好的相关性(96%)，灵敏度略低于FAT[12]。本方法通过狂犬病病毒特异性多克隆抗体捕获狂犬病病毒核蛋白，结合ELISA捕获系统可以检测血清1型（PV株），血清3型（Mocola）株，和欧洲蝙蝠狂犬病毒血清1型（PV株）。 技术特点及要求：ELISA虽然敏感性有所降低，但是适于对腐败的标本进行抗原检测，并且无需昂贵的荧光显微镜，操作简单、重复性好，适合作现场流行病学调查，也可做狂犬病疫苗或狂犬病病毒的鉴别诊断。但是操作过程中要接触到有毒害和致癌作用的试剂。 4.3 胶体金免疫层析法(Gold-immunochromatography Assay ,GICA) 胶体金免疫层析法( GICA) 是国际上世纪九十年代新发展的用于临床样品检测的方法。它是层析法与免疫胶体金技术相结合并且集免疫反应和色谱层析于一体的一种诊断技术，本方法可以达到对抗原浓缩的作用，灵敏度较高。 其主要原理为，用胶体金代替酶标记抗狂犬病病毒抗体，吸水纤维上的金-抗狂犬病毒抗体与样品中的狂犬病病毒抗原结合物结合后，沿硝酸纤维素膜迁移，硝酸纤维素膜上用羊抗鼠IgG(对照线) 和抗狂犬病毒单克隆IgG(检测线) 划线包被，在包被有抗狂犬病毒单克隆抗体处形成“抗狂犬病毒-狂犬病毒-金标抗体”的抗原抗体复合物而出现红色线。 该法特点：无需洗涤，大大减少了污染机会；不需要仪器设备，易于操作，适合野外诊断；所需时间短仅为20分钟；成本较高。 4.4 乳胶凝集试验（Latex Agglutination Test LAT） 本方法是用乳胶包被纯化的马抗狂犬病病毒的IgG抗体血清，乳胶在其中起到放大抗原抗体反应结果的作用。在不破坏标本细胞结构的前提下，乳胶凝集反应可以检测被感染动物唾液和脑组织等中的抗原[13]。有学者报道，乳胶凝集试验和FAT进行对照，乳胶凝集试验具有高敏感性（95.2%），高特异性（98.7%），阳性符合率达97.6%，阴性符合率达97.4%[14]。 5. 病毒核酸检测 5.1 RT-PCR  由于FAT不适于腐败样本和液体（例如唾液腺和脑脊液）样本的检测，随着基因组克隆和测序技术的快速发展，逆转录酶-聚合酶链式反应（RT-PCR）成为一种诊断狂犬病的新方法。通过设计针对各个基因型的特异性引物[14]，或进行RT-PCR产物限制性片段长度多态性分析[15]，或通过核苷酸序列测定和共同基因遗传进化分析[16.17-20]等方法对狂犬病进行诊断，此方法还可以用来区分狂犬病病毒和狂犬病病毒属的其它成员。核蛋白（N）基因在不同毒株之间高度保守，同时又高度表达，因此引物的设计靶位一般选在N基因处，L基因的某些区域也可以作为引物设计的靶位。通过RT-PCR方法可以从被感染的个体脑组织、唾液腺、脑脊液、皮肤和其它组织里扩增出狂犬病病毒的核苷酸序列[21，22]，甚至从口腔拭子中可以检测出狂犬病病毒的核苷酸序列[23]。现有用半巢式RT-PCR法，通过自动化测序来检测经典的狂犬病毒（基因1型）的研究，在出现狂犬病临床症状的36小时内取患者的唾液或皮肤就可以进行狂犬病病毒的检测。 该方法的特点是：敏感、特异、结果可靠，节省时间，在3小时内便可以得出结果，适合用于临床确诊。RT-PCR可以检测腐败组织里的狂犬病病毒。但是，RT-PCR 对内外环境要求严格，外部环境要求洁净的空气、一次性用品，内部环境要求PCR 仪器内反应温度均一，同时，要想扩增成功取样必须准确。 5.2 原位杂交（In-Situ Hybridization ISH） 分子生物学领域各项技术的飞速发展，使得用原位杂交检测狂犬病病毒的方法也得到不断的改进[24.25.26]。有人使用单链RNA作为探针特异性结合编码1至5个狂犬病病毒蛋白的靶基因组或mRNA的方法检测病毒[24.25]。有学者，应用原位杂交的方法，利用特异性探针已经从狂犬病病毒感染的组织中检测出狂犬病病毒，并且确定了病毒的基因型[27]。 随着分子生物学技术的不断进展，荧光实时定量PCR技术自1992年由Higuchi第一次提出后，经过不断发展完善，到目前为止已经非常成熟。标记方法也由最初单一的染料法，发展到特异性更高的探针法，如Taqman、Molecular Beacon、Fret等不同方法的标记探针，其中由于Taqman探针的广泛使用，实时定量PCR的方法也称为Taqman法。目前，Taqman探针已被用于病毒定量[28,29] ，其结果具有高特异性与高敏感性。但是目前还没有应用荧光实时定量RT-PCR技术检测狂犬病病毒的报道。 　狂犬病实验室诊断结果要求准确、快速、敏感，这不仅对感染狂犬病病毒病人或动物的治疗非常重要，而且对未感染的人和动物及时采取预防措施同样具有重要意义。直接FAT检测狂犬病抗原是目前最为快速、敏感的方法并且该方法费用低，特异性高，是WHO推荐的金方法。酶联免疫吸附试验(ELISA)法与脑标本快速收集方法相适应，也是一个快速敏感的诊断方法，而且特异性好。跟FAT一样，即使标本的运输条件不太好，也不会过多影响结果。但是目前在大多数国家仅限于获得认可的实验室及具有确认资格的人员才能做出狂犬病的实验室诊断。 参考文献： [1] World Health Organization. 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