HPLC法测定珍菊降压片中绿原酸、氢氯噻嗪及芦丁的含量

HPLC法测定珍菊降压片中绿原酸、氢氯噻嗪及芦丁的含量 HPLC法测定珍菊降压片中绿原酸、氢氯噻 嗪及芦丁的含量 现代中药研究与实践2005年第19卷第1期 ResearchandPracticeofC:hineseMedicines 质量控制与管理 一 43一 HPLC法测定珍菊降压片中绿原酸,氢氯噻嗪及芦丁的含量 . 叶晓镭,支月芳.,周萍 (1.中国药科大学,江苏南京210038,2.江苏省中医院药剂科,江苏南京210029) 摘要:目的建立高效液相色谱法测定珍菊降压片中绿原酸,氢氯噻嗪及芦丁的含量.方法采用甲醇一 水一丙酮(45:45:10)溶液超声提取,在IichrospherODS(5/*m,4.6×150mm)柱上,以乙腈一0.4磷酸溶液 为流动相进行梯度洗脱,流速1mL?min,枉温3OC,二极管阵列检测器(DAD).结果绿原酸浓度线性范 围2.47,12.35/*g?mL(r一0.9995);平均回收率为1OO.3,RSD为3.4.氢氯噻嗪浓度线性范围4.26 , 21.28/*g?mL(r一0.9997);平均回收率为99.4,RSD为2.5.芦丁浓度线性范围1O.88,54.4/*g? mL(r一0.9996);平均回收率为99.3,RSD为1.8.结论该法准确,精密度高,重现性好,可作为珍菊 降压片中野菊花浸膏粉,氢氯噻嗪,芦丁质量控制一种方法. 关键词:珍菊降压片;绿原酸;氢氯噻嗪;芦丁;高效液相色谱法 中图分类号:R284.1文献标识码:A文章编号:1004—2199(2005)01—0043—03 DeterminationofChlorogenicAcid,Hydrochlorothiazideand RutininZhenjujiangyaTabletsbyHPLC YEXiao—lei.ZHIYue—fang.ZHOUPing (1.ChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing210038,Chiina;2.DepartmentofPharmaceutics. JiangsuProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicine,Nanjing210029,China) Abstract:ObjectiveToestablishamethodforthedeterminationofchlorogenicacid, hydrochlorothiazideandrutininZhenjujiangyaTablets.MethodThethreeingredientsintheTabletswas extractedbyultrasonatorwithmethanol— wateracetone(1:1:1)solution.Themeasurementconditionwas asfollows:LichrospheroDS(150mm× 4.6mm)column;mobilephasecomposedofacetonitrile0.4 phosphonicacidsolutionwithgradientelution,flowratewas1.0mL?min一:detectionbyDAD.the columntemperaturewassetupat300C.ResultsThelinearrangeofcalibrationcurvewaswithin2.47, 12.35g?mL一(r一0.9995)forchlorogenicacid;4.26,21.28g?mL.(r一0.9997)for hydrochlorothiazideand10.88,54.4g?mL.(r一 0.9996)forrutin;Theaverageextractionrecovery was1OO.3forchlorogenicacid(RSD一3.4);99.4forhydrochlorothiazide(RSD一 2.5)and 99.3forrutin(RD一 1.80A).ConclusionThemethodisaccurateandwithagoodreproductivityand ahighprecision,andcanbeusedforqualitycontrolofZhenjujiangyaTablets. Keywords:ZhenjujiangyaTablets;chlorogenicacid;hydrochlorothiazide;rutin;HPLC 珍菊降压片为中西药复方制剂,在临床上用于 治疗各种类型的高血压.其主要组成成分为盐酸可 乐定,氢氯噻嗪,芦丁及野菊花膏粉等,绿原酸为野 菊花膏粉的成分之一.该药现有的国家标准仅有 收稿日期:2004—1l—O8 作者简介:叶晓镭(1961一),女,中国药科大学基础部精密仪器室,工 程师. 部分成分的鉴别项目,无上述各成分的含量测定方 法等.虽有文献报道采用HPLC方法测定其中各成 分的含量_2,但尚未发现有同时测定三种成分含量 的报道. 本试验使用HPLC方法同时测定珍菊降压片 中绿原酸,氢氯噻嗪及芦丁的含量,采用二极管阵列 检测器提高测定对象的灵敏度及选择性,使测定更 快速简便.通过梯度洗脱的方式消除其他成分的于 一 44一 扰,提高分离和效能.本法简便,快速,准确,不 失为一种定量测定珍菊降压片中绿原酸,氢氯噻嗪 及芦丁的含量的良好方法. 1仪器和试药 仪器:日本SHIMADZULC10A系列液相色谱 仪,SPD—M10Avp二极管阵列检测器,ClassVP 6.12色谱数据工作站. 试药:绿原酸对照品,芦丁对照品及氢氯噻嗪对 照品均购于中国药品生物制品检定所;乙腈(色谱 纯),水为重蒸水,其他试剂为分析纯.珍菊降压片为 上海雷允上药业有限公司产品. 2方法和结果 2.1色谱条件 色谱柱:LichrospherODS柱(5t*m,4.6mm× 150mm),江苏汉邦科技公司;流动相:乙腈一0.4 磷酸溶液(10:90),25min内线性改变至3O:7O, 并维持5min;流速:1mL?min_.;柱温:30C;外 标法. 2.2对照品,供试品及阴性对照品溶液的制备 2.2.1对照品溶液 绿原酸对照品溶液,精密称取绿原酸对照品约 2.5mg,置1OmL的量瓶中,用流动相溶解并稀释 至刻度.制成每1mL中约含绿原酸250g的绿原 酸对照品溶液. 氢氯噻嗪对照品溶液,精密称取氢氯噻嗪对照 品约5.0mg于25mL容量瓶中,用流动相溶解并 稀释至刻度.制成每1mL中约含氢氯噻嗪200g 的氢氯噻嗪对照品溶液. 芦丁对照品溶液,精密称取芦丁对照品约5.0 mg于25mL容量瓶中,制成每1mL中约含芦丁 200g的芦丁对照品溶液. 2.2.2供试品溶液取本品2O片,精密称定,研 细,精密称取约0.6g,置5OmL的量瓶中,加甲醇一 水一丙酮(9:9:2)溶液50mL,超声处理50min,冷 却,精密加入甲醇一水一丙酮(45:45:10)溶液至刻 度,摇匀,离心,上清液分两部分:精密吸取上清液1 mL,置25mL量瓶中,加流动相至刻度作为A液供 测定芦丁及氢氯噻嗪;直接吸取的上清液作为B液 供测定绿原酸. 2.2.3阴性对照溶液按处方比例,采用上述供试 品溶液的制备方法制备相应阴性对照溶液. 2.3干扰试验在上述色谱条件下分别精密量取 现代中药研究与实践2005年第19卷第1期 ResearehandPracticeofChineseMedicines 对照品溶液,供试品溶液和阴性对照溶液各2OL, 注入液相色谱仪中,记录色谱图.供试品色谱图与 对照品色谱图相应的位置上有相同的色谱峰,阴性 对照溶液在相同的保留时间内无干扰.对照品,供试 品和阴性对照溶液的色谱图见图1. J 2A jl—^^—一JUL—一 51015min 1一绿原酸2一氢氯噻嗪3一芦丁 1一chlorogenicacid2-hydr0chl0r0thiazide3-rutin 图1对照品(A),芦丁阴性对照(B),绿原酸阴性对照(C), 氢氯噻嗪阴性对照(D)和供试品(E)的HPLC图谱 Fig.1HPLCchromatogramsofstandard(A),negativesampleof rudin(B).negativesampleofchiorogenicacid(C),negative sampleofhydrochiorothiazide(D)andsample(E) 2.4测定方法 精密量取对照品溶液和供试品溶液各2OL, 注入液相色谱仪中,记录色谱图,并以外标法计算供 试品中绿原酸,氢氯噻嗪及芦丁的含量.绿原酸的保 留时间约为7.2min,理论板数为9700,对称因子 0.94.氢氯噻嗪的保留时间约为8.3min,理论板数 为18000,对称因子1.07.芦丁的保留时间约为 13.9min,理论板数为66680,对称因子1.10. 2.5线性范围 精密量取绿原酸对照品溶液0.1,0.2,0.3,0.4, 0.5mL,氢氯噻嗪对照品溶液0.2,0.4,0.6,0.8, 1.0mL,芦丁对照品溶液0.5,1.0,1.5,2.0,2.5mL 置10mL量瓶中,用流动相稀释至刻度.取上述各 溶液2OL注入液相色谱仪中,记录色谱图,测定其 峰面积,以峰面积对浓度C(t~g/mL)进行回归. 回归方程:绿原酸:A一34543C+3369.6,,-一 0.9995;氢氯噻嗪:A一144641C一39086,,-一 0.9997;芦丁:A一71366C一184722,,-一0.9996; 绿原酸的线性范围为2.47,12.35g?mL_.,氢 氯噻嗪的线性范围为4.26,21.28g?mL,芦 现代中药研究与实践2005年第19卷第1期 ResearchandPracticeofChineseMedicines 丁的线性范围为10.88,54.40g?mL.各峰面 积值与浓度均呈现良好的线性关系. 2.6稳定性试验取供试品溶液,在0,2,4,6,8h 进样,记录色谱图,样品中绿原酸峰面积的RSD为 1.4;氢氯噻嗪峰面积的RSD为1.7;芦丁峰面 积的RSD为1.1;结果表明供试品溶液在8h内 是稳定的. 2.7精密度试验 精密量取同一份对照品溶液2OL,注入液相 色谱仪,重复进样6次,绿原酸峰面积的RSD为 2.0,氢氯噻嗪峰面积的RSD为1.1;芦丁峰面 积的RSD为1.4;结果表明进样精密度良好. 2.8重复性试验按"2.2.2"项下操作,6份供试 品中绿原酸含量的RSD为2.8;氢氯噻嗪含量的 RSD为1.4;芦丁含量的RSD为1.7.结果表 明重复性良好. 2.9回收率试验 采用加样回收率测定方法,取已知含量的样品 约0.3g,精密称定,置5OmL的量瓶中,分别定量 加入绿原酸,氢氯噻嗪,芦丁对照品溶液适量,按上 述供试品制备方法制备加样回收率供试品溶液,测 定,计算,结果见表1. 表1绿原酸加样回收率试验结果 Tab.1Resultsofrecoveryofchlorogenicacid 试验结果表明:回收率在96.5,104.8,加 样回收率良好. 表2氢氯噻嗪加样回收率试验结果 Tab.2Resultsofrecoveryofhydr0chl0r0thiazide 试验结果表明:回收率在96.3,103.2,加 样回收率良好. 表3芦丁加样回收率试验结果 Tab.3Resultsofrecoveryofrudin ---—— 45---—— 样品量芦丁加入对照芦丁测回收率平均 RsD/ !量!量! 300.619.6524.051O1.2 299.619.6523.9899.2 302.024.8324.171O1.199.3?1.8 300.224.8324.O299.3 3oo.527.0224.0596.2 299.827.1523.9998.8 试验结果表明:回收率在96.2,101.2,加 样回收率良好. 2.1O供试品的含量测定 按"2.2"和"2.3"项下操作,3批珍菊降压片 (030605,030807,030805)供试品中每片含绿原酸分 别为0.214,0.221,0.261mg;含氢氯噻嗪分别为 5.O6,5.21,5.43mg;含芦丁分别为24.2,23.3, 21.7mg. 3讨论 3.1提取时间按"2.2.2"项下操作,分别考察超 声提取3O,4O,5O,6O,80min对药品测定结果的影 响,结果表明提取时间50min,使基本提取完全. 3.2提取溶剂的选择根据氢氯噻嗪在丙酮中溶 解,绿原酸和芦丁在甲醇或乙醇,水中溶解的特性, 供试品分别用比例为:(45:45:10),(2:2:1)及 (1:1:1)的水一甲醇一丙酮提取,结果表明用比例 为水一甲醇一丙酮(45:45:10)的溶剂三种成分提 取最完全. 3.3珍菊降压片主要组成成分为盐酸可乐定,氢氯 噻嗪,芦丁,珍珠层粉及野菊花膏粉,绿原酸,氢氯噻 嗪及芦丁紫外最大吸收波长差异较大,用二极管阵 列DAD检测器可以在三种组分各自最大吸收波长 下检测,从而得到良好检测灵敏度.采用等度洗脱的 方式分离和分析需要更长的时间,用梯度洗脱既可 使各组分获得良好的分离,又大大提高了分析效率. 3.4本法重复性良好,准确,可用于珍菊降压片中 绿原酸,氢氯噻嗪和芦丁的测定,为该药的质量控制 提供了一种良好的测定方法. 参考文献 [1]中华人民共和国卫生部.药品标准?中药成方制剂(第二十册) WS3一B一3925—98[S].北京:人民卫生出版社,1998. E2]姜丽霞,徐世芳.HPLC法测定野菊花中绿原酸的含量EJ].北 京:中国药品标准,2004,4(6):54—56. [3]郁健,叶晓镭.HPLC法测定珍菊降压片中绿原酸的含量 rI].南京中医药大学,2004,20(4):237.