细菌基因组DNA的制备

细菌基因组DNA的制备 细菌基因组DNA的制备.txt如果我穷得还剩下一碗饭 我也会让你先吃饱全天下最好的东西都应该归我所有，包括你～～ 先说喜欢我能死啊?别闹，听话。 有本事你就照顾好自己，不然就老老实实地让我来照顾你～ 细菌基因组DNA的制备 悬赏分:0 - 解决时间:2008-11-12 19:22 9. 加1/10 体积3mol/L NaAc, 及2倍体积无水乙醇颠倒混合沉淀DNA。室温下静止10-20分钟，DNA沉淀形成白色絮状物。 10. 用玻棒钩出DNA沉淀,70%乙醇中漂洗后,在吸水纸上吸干,溶解于1ml TE中,-20?保存。 11. 如果DNA溶液中有不溶解颗粒,可在5000rpm短暂离心,取上清; 如要除去其中的RNA,可加5μl RNaseA(10μg/μl), 37?保温30分钟, 用酚抽提后, 按步骤9-10重沉淀DNA。 第四节 细菌基因组DNA的制备 一、 细菌培养物。 二、设备 移液管, 高速冷冻离心机, 台式离心机，水浴锅。 三、试剂 1、CTAB/NaCl溶液:4.1g NaCl溶解于80ml H2 O,缓慢加入10g CTAB,加水至100ml。 2、其它试剂:氯仿:异戊醇(24:1)，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，异丙醇，70% 乙醇，TE，10% SDS，蛋白酶 K (20mg/ml或粉剂)，5mol/L NaCl。 四、操作步骤: 1. 100ml 细菌过夜培养液, 5000rpm离心10分钟, 去上清液。 2. 加9.5ml TE悬浮沉淀, 并加0.5ml 10% SDS, 50μl 20mg/ml(或1mg干粉)蛋白酶 K, 混匀, 37?保温1小时。 3. 加1.5ml 5mol/L NaCl, 混匀。 4. 加1.5ml CTAB/NaCl溶液, 混匀, 65?保温20分钟。 5. 用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提, 5000rpm离心10分钟, 将上清液移至干净离心管。 6. 用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提, 取上清液移至干净管中。 7. 加1倍体积异丙醇, 颠倒混合, 室温下静止10分钟，沉淀DNA。 8. 用玻棒捞出DNA沉淀, 70%乙醇漂洗后, 吸干,溶解于1ml TE, -20?保存。如DNA沉淀无法捞出,可5000rpm离心, 使DNA沉淀。 9. 如要除去其中的RNA, 可以按本章第三节中操作步骤处理。 第五节 基因组DNA的 上述得到的DNA一般可以用作Southern, RFLP、PCR等分析。由于所用材料的不同,得到的DNA产量及质量均不同,有时DNA中含有酚类和多糖类物质,会影响酶切和PCR的效果。所以获得基因组DNA后,均需检测DNA的产量和质量。 1. DNA溶液稀释20-30倍后,测定OD260 /OD280 比值, 明确DNA的含量和质量。 2. 取2-5μl 在0.7% agarose胶上电泳, 检测DNA的分子大小。 3. 取2μg DNA, 用10单位(U)Hind?酶切过夜, 0.7% agarose胶上电泳, 检测能否完全酶解(做RFLP, DNA必须完全酶解)。 如果DNA中所含杂质多, 不能完全酶切, 或小分子DNA多, 影响接续的分析和操作,可以用下列方法处理: (1)选用幼嫩植物组织，可减少淀粉类的含量。 (2) 酚:氯仿抽提, 去除蛋白质和多糖。 (3)Sepharose柱过滤, 去除酚类、多糖和小分子DNA。 (4)CsCl梯度离心, 去除杂质, 分离大片段DNA(可用作文库构建)。 提问者: huangza806 - 四级最佳检举 CTAB(十六烷基三甲基溴化铵),是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在这种条件下，蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液里，在高离子强度的溶液里，CTAB与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。因此，CTAB可以用于从大量产生粘多糖的有机体如植物以及某些革兰氏阴性菌(包括E.coli的某些株)中制备纯化DNA 。 参考资料: