【DOC】中药赞育延生饮对生精障碍大鼠治疗作用的实验研究

【DOC】中药赞育延生饮对生精障碍大鼠治疗作用的实验研究 中药赞育延生饮对生精障碍大鼠治疗作用 的实验研究 中国男科学杂志2006年第2O卷第11期17 中药赞育延生饮对生精障碍大鼠 实验研究 治疗作 湘南学院组织学与胚胎学教研室(郴州423000) 陈晓岚段小毛汤银娟莫艳秀刘科峰 用的 摘要目的观察中药赞育延生饮对生精障碍大鼠的治疗作用.选用SD大鼠,灌胃腺嘌呤造成肾阳 虚生精障碍模型.造模后,中药组大鼠每日给予中药赞育延生饮(zanyuyanshengyin,ZYYSY)5.4g/kg体重,西 药组给予克罗米芬l3.5mg/kg体重,模型组不予任何治疗,连续1个月.用酶联免疫法测血清睾酮值,用TUNEL 法测生精细胞凋亡率,用免疫组织化学法研究生精细胞的增殖率和Bc1.2,Bax达率.结果中药治疗组大鼠血 睾酮水平明显升高(239.463~24.8),精子数量增多(18.83~6.07),生精细胞增殖率上升(39.15~3.70),凋 亡率下降(3.04~0.32),与模型组各相应值 (8.784~2.05,9.75~4.03,20.63~4.98,7.12~0.30)相比有显 着性差异(P<0.05).结论中药赞育延生饮治疗大鼠生精功能障碍有 效.. 关键词生精障碍;细胞凋亡;细胞增殖;睾酮;大鼠 中图分类号R698.2 ExperimentalstudyontheeffectofZanYuYanShengYinon spermatogenesisdisturbanceofrats ChenXiaolan,DuanXiaomao,TangY’mjuan,Moyanxiu,LiuKefeng DepartmentofHistologyandEmb~ology,XiangnanCollege,Chenzhou423000,China DuanXiaomao DepartmentofPharmacology,XiangnanCollege AbstractObjectiveToobservetheeffectofChinesemedicineZanYuYanShengYin(ZYYSY)onspermatogenesis disturbanceofrats.MethodsFortySDratsabout250gweightwereusedandrandomlydividedinto4groups.(1) Normalcontrolgroup:normalSDratswithoutgivenanytreatment;(2)Modelgroup:spermatogenesisdisturbance modelswereobtainedbybeingbredadenosine(200mg~g’d’.,30d);(3)Positivecontrolgroup:clomiphenewasused afterthemodelswereformed(13.5mg~g’d-l,30d);(4)ZYYSYgruop:ZYYS Ywasadministeredafterthemodelswere formed(5.4g/kg’d..,30d).Eachgruophas10rats.Bloodwascollectedandthetestosteronelevelwasmeasuredby enzymeimmunoassay,testeswerefixedinBouinsolution,embeddedinparaffinandslicedasustra1.Microscopy, TUNELandimmunohistochemistrywereappliedinthisstudy.ResultsThetestosteroneleveloftheZYYSYgroup obviouslyincreased(239.463~24.8)andthenumberofspermincreased(18.83~6.07),thepositivecellrateofPCNA alsoincreased(39.15~3.70)andthepositivecellrateofapoptosisdecreased(3.04~0.32).Comparedwiththemodel group(8.784~2.05,9.75~4.03,20.63~4.98,7.12~0.30),theresultshavesignificantdifference(P<O.05).Conclusion TheChinesemedicineZYYSYiseffectiveforthespermatogenesisdisturbance. Keywordsspermatogenesisdisturbance;apoptosis;cellproliferation;testosterone;rat 男性不育,一直是生殖系统研究领域的热点. 西药对此尚无较好的治疗方法.而祖国医学从根本入 手,以补肾填精,生精活血为理念,对生精功能障碍 ‘湘南学院药理学教研室 有较好的治疗效果.在本实验中,我们采用腺嘌呤 诱发的肾阳虚睾丸功能损害大鼠模型?,用酶联免 疫,缺口末端标记法(TUNEL),免疫组织化学等 18ChineseJournalofAndrologyVo1.20No.112006 方法,从生理生化和组织形态学方面观察了中药赞育 延生饮(zanyuyanshengyin,ZYYSY)对生精障碍大 鼠的治疗作用. 材料和方法 一 ,动物来源 由南华大学动物室提供的2级清洁SD大鼠40只, 日龄70—80d,体重(250?10)g. 二,动物分组 将40只大鼠随机分为4组,每组10只.(1) 正常组:不予任何处理;(2)模型组:每日灌 胃腺嘌呤【200mg/kg?d,,30d】造成.肾阳虚生精障 碍大鼠模型,不予任何治疗;(3)西药治疗组: 造成.肾阳虚生精障碍大鼠模型后当天即给克罗米芬 【13.5mg/kg?d】灌胃治疗30d;(4)中药治疗 组:造成.肾阳虚生精障碍大鼠模型后当天即给中药 赞育延生饮【5.4g/kg?d】灌胃治疗30d. 三,试剂来源 所用睾酮酶免试剂盒,增殖细胞核抗原 (proliferatingcellnuclearantigen,PCNA)免疫组织 化学试剂盒,凋亡试剂盒均购于北京拜尔迪生物技术 有限公司.造成肾阳虚生精障碍大鼠模型药腺嘌呤购 于武汉化学试剂公司. 四,观察指标 1.症状体征:观察大鼠的精神体态,活动反应, 体毛荣枯和体重变化等,体重于上午喂食前称量. 2.血睾酮水平:在成模后测1次,治疗完成后 再测1次.于上午8点开始,眶后静脉丛采血,离 心取血清,用酶免法测睾酮浓度,操作按试剂盒说 明书进行. 3.附睾精子数量:解剖大鼠剥取附睾,吸取附 睾尾浆液,分别加入精子稀释液和biggers.whitten andwhittinghamsolution(BWW)营养液于试管中,参 照人类精液常规分析方法,作精子计数. 4.睾丸组织学:将大鼠睾丸用Bouin液(冰醋 酸:甲醛:苦味酸饱和水溶液按1:5:15比例配制,现配现 用)固定,石蜡包埋,切片,厚5ITI,HE染色, 光镜下观察生精小管形态和精子发生状态. 5.生殖细胞增殖率:用免疫组织化学法测定生精 细胞PCNA阳性细胞百分比.将切片脱蜡至水,加 0.3%甲醇一过氧化氢20min去除内源性过氧化物酶; 山羊血清封闭;一抗湿盒中4”C冰箱过夜,二抗37”C 温箱内孵育30min;三抗37?温箱内孵育30min; DAB一过氧化氢显色(1ml蒸馏水加Buffer缓冲液, DAB底物及过氧化氢各1滴,混匀后使用);复染 核,常规脱水,封片.按Yin法计数阳性细胞数. 6.生殖细胞凋亡率:用TUNEL法测定凋亡细胞 百分比.切片经二甲苯脱蜡,常规浸水后,蛋白酶 K消化,37?温箱内孵育30min;0.3%甲醇一过氧化 氢室温下孵育20min;滴加反应液,37?温箱湿盒内 孵育2h;封闭液室温下孵育10min;吸去多余封闭 液,滴加1:100辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素, 37?温箱内孵育30min;PBS清洗后,DAB一过氧化 氢显色,脱水,封片.按Yin法计数阳性生精小管 数和阳性生精细胞数. 7.Bcl一2和Bax表达率:用免疫组织化学法检测 生精细胞Bcl一2和Bax阳性细胞百分比.操作方法及 步骤同生殖细胞增殖率检测法. 五,统计分析 将数据输入计算机,SPSS软件10.0版本处理, 方差分析,再组间比较用SNK检验. 结果 一 ,症状体征 各组造模大鼠自灌饲腺嘌呤第5d起,出现恶 寒倦卧,精神萎靡,反应迟钝,少动,体毛干枯, 消瘦等肾阳虚表现,诸症随给药日数的增加而加剧; 正常组大鼠精神体态,活动反应如常;中药组大鼠经 治疗,精神体态日见好转,疗程结束后.肾阳虚诸症 明显改善. 二,血清睾酮值 可见模型组和西药组睾酮值明显下降,与正常组 差异显着(P<0.05);中药组睾酮值与正常组相 似,无显着性差异(P>0.05)(见表1). 三,附睾精子数 可见模型组和西药组精子数量显着减少,与正常 组差异显着(P<0.05);中药组精子数量与正常组 无显着性差异(P>0.05)(见表2). 四,HE染色 4组大鼠同时选曲细精管第?期进行观察,可见 模型组生精小管大部分退化变性,萎缩,管壁变薄, 生精细胞排列紊乱,数量明显减少,腔内少见成熟 的精子(图1);中药组与正常组近似,大部分生精 小管内生精细胞发育良好(图2). 五,PCNA表达率 增殖细胞核抗原(proliferatingcellnuclear antigen,PCNA)免疫组织化学染色显示,其阳性率 在模型组(图3)和西药组表达明显减少,与正常 中国男科学杂志2006年第2()卷第l1期l9 组差异显着(P<0.05);中药虮(图4)表达率 与正常组相似,无显着性差异(P>0.05),各组 PCNA阳性细胞率见表3 六,生精细胞凋亡 对生精小管调亡细胞的检测发现,捌亡主要发生 在精原细胞和初级精母细胞.模型纵(圉5)和两 药组凋亡率叫显升,精子细胞也发生了凋亡,与正 常组差异显着(P<0.05):中药组(图6)凋亡率 较低.与正常组无差异(P>0.05).各组生精细胞 搁亡率见表3 七,BCL-2和Bax表达率 Bcl一2蛋白咀敞在的颗粒状分布J:精原细胞耳?初级 精母细胞核中.各组阳性细胞率见表4.模刑组(图 7)和西药组阳性细胞表达率明显减少,与正常组差 异显着(P<0.05),怛两组之间无显着性差异:中 药组表达率与正常组相似,无显着-肚差异cP>0.05) (图8),但与模型组和西药{_fl有显着性差异(P< 0.05)Bax以敖庄呐颗粒状分布于精原细胞核中, 各组阳性细胞率见表4.模型组(图9)l羁J西药组表 达率明显增加.与正常组差异显着(P<0.05),但 两组之间无显着性蔗异;中约组表达率较低.与正常 组无差异(P>0.05)(图10),但与模型蛆和西 药组有屁菩性差异(P<0.05). 表I给药前后大鼠血清睾丸酮浓度() 洼:弓lF常蛆L匕较’产<0.05:与模比艘”P<0.05 表2各组附睾精子计数(i) 注:与常-七较’P<0+05;与模型组比较”P<005 表3治疗后各组指标阳性百分率(%)?s) 注:与正常组比较’P<o.05:横型瓦’’百 衷4治疗后各组Bcl-2,Bax阳性百分率(i?) 注:j正常组比较’P<O05模型目1比较..尸<O.05 20ChineseJotlFrlaiofAndrologyVo1.20Nol12006 图6中药组睾丸凋亡细胞TuNFL染色(×2{xI) 图9模型组生精细胞Bax染色{×2()0l . ‘ 铺 , . . .. 讨论 一 , 腺嘌呤与肾阳虚 肾m虚足中医学的概念,指机体新陈代谢低下的 种症候群而腺嘌岭能够诱导肾阳虚睾丸功能损害 已有文献报道…其具体机制尚不十分清楚.但矧 腺嘌【l夸足梭酸的主赞成分之一,体内广泛存在食 物中的腺嘌呤大多在肠道黄嘌呤氧化嘣的作用F转变 成尿陵,少分被重新利用合成核酸.Bendich等 报道,机件掇入大剂量腺嘌I岭时.异常高浓度的 腺嘌呤在黄嘌岭氧化睡的作用下转变成2,8轻基腺 嘌呤,这种隙嘌呤代谢产物沉积于肾小管l酊引起肾功 能衰竭.腺嘌呤代谢产物不仅机械性阻塞肾小瞥而 引起肾功能衰竭,迁『j『引起肾组织肜态学的损害,而 且还可能由于躲嘌呤代谢产物的”毒性作用”引起 肾小管组织化学过碘酸希夫反应(periodicacidSchiff reactiol3.,PAS),馘性磷酸酶(AKP),葡萄精.6. 磷酸酶(G一6一P),葡萄糖一6一磷酸脱氢酶(G一6, PDH),异枸橼酸脱氯酶(ICDH)及非特异性酯酶 (NSE)等活性显着降低.这些酶活性的降低影响了 肾小管糖,脂肪,蛋白质以及水,电解质的代谢. 从而影响了.肾小管细胞能量代谢羊?功能,凶此两发了 肾虚症候群 二,肾阳虚与辈丸功能损害 睾丸功能损害的特征为阜丸中精子l牛成减少,而 精子牛成要山一激素进行调节掣酮足生精细胞 正常发育最基本的激素众所周知,睾酮是由睾丸 问质细胞合成分泌的,曾有学者报道,此种模型 睾丸问质细胞中ff,J3B.类同醇脱氢酶(30.HSD) 活性着降低.而泼足?成辈删呐关键酶,此酶 活性1足,J导致嗣合成F降;一疗而皋喇 的台成分泌义接受腑乖体分泌的促性腺激素如卵泡刺 激素(FSH)幂1黄体生成素(LH)的渊.FSH 和LH的分泌又受F丘脑激素的碉节.此,本实验 qi模组动物掣耐浓度降低的机制估计有l旃种可能: 足腺嘌呤直接作用于掣丸问质细胞,破坏功能: _二足腺嘌呤通过某种CLiO导敛r丘脑.垂体.性腺轴及 肾上腺皮质功能低F.促性腺激素分泌减少而导致睾 酮哦不足中医所苦,肾虚与F匠脑.畦体.性 腺及肾【慷皮质系统有着嘶七U关系肾阳足中医学叫__l 的特殊概念,它昆囱物质甚础?复人学上海医 学院已作了系统研究证J】J】,肾阳虚表现为丘腩难体 肾上腺皮质的功能低下:也有人[_l肾阳虚时.厂己 躺垂体一性腺功能低r.r匠腑一体一性腺及肾 上腺皮质系统受到某刺叫利索(如异常高浓度的腺 嘌呤及其代谢,物的毒性作l剐)的影响而导致其功能 低F(相当于中医所说之肾虚)时.势必响其 分泌的激素1向健性腺激案的减少祧会导敛睾酮分泌 不足,进而导致t精功隧障碍,细胞凋I增多,增 殖减少.本实验中模型纽动物生精细胞凋亡率增高及 中国男科学杂志2006年第2O卷第11期21 增殖细胞核抗原表达率降低的实验结果,也进一步证 实了这一观点. 三,中药赞育延生饮的治疗作用 赞育延生饮方药组成:何首乌15g,山萸肉10g, 菟丝子10g,巴戟天10g,怀牛膝10g,枸杞子10g, 丹参20g,茯苓l0g,丹皮5g,熟地20g. 方中何首乌入肝肾心经,既能补血,又能益 精;熟地滋.肾阴,益精髓;山萸肉滋.肾益肝;枸杞 子能补肝.肾之阴,且能益精补血,有补肝肾之阴, 益精血之功;菟丝子补而不峻,温而不燥,既能补 助肾阳,又能补益.肾精.配伍何首乌,枸杞子用之 肝.肾不足,精亏血虚之早衰,腰膝酸软;其温助肾 阳可用于男子阳痿不育,女子宫寒不孕;巴戟天补助 .肾阳之力温和,温而不热,不仅”补其火而不烁其 水”,且略具益精作用;丹皮配山茱萸以泻肝火,茯 苓健脾燥湿,是为泻药,如此配伍,补泻并用,以 补为主.丹参,活血化瘀,调经止痈,可使经脉 通利,消除补益之滋腻难化;怀牛膝,补肝.肾,强 筋骨,能引血引热下行.诸药相和,补肾填精以壮 阳,以达”阳得阴助而生化无穷,阴得阳升而源泉 不竭”之目的. 综上所述,推测中药赞育延生饮的作用机制是恢 复了下丘脑.垂体.性腺轴的作用,使激素分泌正常, 从而使睾丸功能得到改善,生精细胞凋亡减少. 四,赞育延生饮与Bc1.2和Bax的关系 在凋亡的调节基因中,Bc1.2基因家族是最重要 的一族.当Bax同源二聚体形成时就诱导凋亡.随 着Bc1.2蛋白表达上升,越来越多的Bax二聚体分开, 与Bc1.2形成比Bax.Bax同源二聚体更稳定的Bax.Bc1.2 异源二聚体,从而”中和”了Bax.Bax诱导凋亡的作 用.细胞内Bc1.2与Bax的比例调节了凋亡的发生. 我们的实验显示,在模型大鼠生精细胞凋亡的同时, Bax基因高表达;待给予赞育延生饮后,睾酮水平恢 复正常,凋亡细胞数量亦相应减少,伴有Bc1.2高表 达.说明赞育延生饮在使睾酮水平恢复的同时,凋 亡相关基因Bc1.2和Bax的表达也趋于正常. 以上实验研究结果显示,中药赞育延生饮对.肾阳 虚生精功能障碍治疗有效. 1 2 3 4 5 参考文献 郑平东.腺嘌呤诱发睾丸功能损害.肾阳虚模型的研究. 中国医药1989;4(3):67.69 WorldHealthOrganization.ExaminationHandbookof MankindSperm—CervicalMucusMutualAction.BeUing: Thepeople’sMedicalPublishingHouse.1989:7-8 YinY.HawkinsKL.DeWblfWC,eta1.Heatstress causestesticulargermcellapoptosisinadultmice.J Androl1997;18(2):159-165 BendichA.Thedirectoxidationofadeineinvivo.JBiol Chem1950;l83:267—272 ZhengPD,ZhuYI.DingMCH.eta1.Developmentof ‘‘InsufficiencyoftheKidney—yang’’animalmodelsinduced 73 byadenosine.AetaMedicaSinica1990;5(3):68— 徐维蓉.王奕,叶其明.等.北冬虫夏草子实体对大鼠 睾丸功能的影响.上海中医药大学2001;15(4):50-54 陈琼,岳广平,戴宁.针灸对肾阳虚睾丸功能损害大鼠 作用的实验研究.中国针灸1996;l6(3):37.39 侯家玉.中药药理学.北京:中国中医药出版社.2002: 116—125 温进坤.韩梅.医学分子生物学原理与实验技术.上海: 上海科学普及出版社,1999:230 (2006—03—10收稿) (上接第16页) 3SzecsiPB.LiljaH.Gastricsin—mediatedproteolytic degradationofhumanseminalfluidproteinsatpHlevels foundinthehumanvacua.JAndrol1993;14<5):351—358 4姚德鸿.Q.糜蛋白酶降低精液粘度的实验观察.男,陛 学杂志1991;5(2):103-104 5应俊,姚德鸿,龙建清,等.精浆中PSA浓度与精液粘度 关系的研究.男性学杂志1997;11(1):16.18 6SigmanM.JarowJP.Maleinfertility.InWalshPC. 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