CCK对下丘脑腹内侧核不同类型神经元的调节作用.doc

CCK对下丘脑腹内侧核不同类型神经元的调节作用.doc CCK对下丘脑腹内侧核不同类型神经元的调节作用 作者:牛瑜，杜永平，张月萍，段建红，王文挺，胡三觉 【摘要】 目的:研究下丘脑腹内侧核(VMH )不同类型神经元的电生理特性及胆囊收缩素(CCK)对神经元兴奋性的调节作用. 方法:利用红外可视脑片膜片钳技术记录SD大鼠下丘脑VMH神经元的电生理特性，观察和分析CCK及胃泌素对VMH神经元放电频率的影响. 结果:根据大鼠VMH神经元自发放电频率的特征和膜的被动特性，将其分为三种类型:I型神经元在静息电位没有自发放电，并有相对较小的膜时间常数和输入电阻，分别为(8?1) msec (n=4)和(192?39) MΩ (n=4);?型神经元静息电位具有自发放电，膜时间常数(14?1) msec (n=11)和输入电阻(327?2) MΩ (n=11),较I型神经元的显著增大(P<0.05);?型神经元静息电位也有自发放电，膜时间常数(25?2) msec (n=17)和输入电阻(522?28) MΩ (n=17),较I型和?型神经元的都显著增大(P<0.05). CCK可以增加?型和?型神经元的自发放电频率，但对?型神经元不起作用. 胃泌素模拟CCK的作用也可以增加?和?型神经元的自发放电频率，而胃泌素主要是通过胆囊收缩素 B(CCK B)受体对神经元起作用. 结论:CCK对VMH 三种类型神经元具有不同的调节作用，而这可能是通过CCK B受体所介导的. 【关键词】 胆囊收缩素 0引言 腹内侧核(ventromedial hypothalamic nucleus，VMH)是下丘脑基底部最大的核团，大量研究表明VMH是调控摄食的饱中枢,1,，而这个生理过程又受到许多内源性因素和递质如胆囊收缩素(cholecystokinin，CCK)，5 羟色胺,葡萄糖等的调控,2,. CCK是一种激素和神经递质，广泛存在于外周和中枢神经系统，在调控摄食的生理过程中起着关键作用. 但目前有关CCK是如何对VMH神经元起作用以及它的受体机制(CCK A或CCK B)尚不清楚，相关的研究报道也较少. 我们利用红外可视脑片膜片钳技术探讨下丘脑VMH神经元的电生理特征和CCK对其兴奋性的影响，从而深入了解中枢神经系统对摄食行为的精确调控方式. 1材料和方法 1.1材料出生14 d健康SD大鼠40只， 体质量30,40 g，雌雄不限，由第四军医大学实验动物中心提供;戊巴比妥钠，NaCl, NaHCO3, KCl, NaH2PO4, CaCl2, MgCl2和glucose(天津市医药公 司);乙二醇双四乙酸，羟乙基哌嗪乙磺酸， CCK，胃泌素(美国Sigma公司);记录电极由南京泉水实验器材厂提供;恒流泵(HL 2型, 上海沪西仪器厂);振动切片机(752M型, 英国Campden公司);直立式Nomarski微分干涉相差显微镜(BX51WI，日本Olympus公司);微电极拉制仪(PP 83型, 日本Narishige公司);模拟 数字转换器(Digidata 1322A, 美国Axon公司);放大器(Multiclamp 700A, 美国Axon公司). 1.2方法 1.2.1下丘脑脑片制作大鼠用10 g/L的戊巴比妥钠(50 mg/kg，ip)麻醉后，立即断头取脑，取出脑组织置于人工脑脊液(artificial cerebrospinal, ACSF)的冰水混合物中，10 min后取出脑组织修块. 用少许瞬间粘合剂(502胶)把修好的脑组织块与预先准备好的琼脂块一起固定在振动切片机的标本托上. 在4?条件下，切成含VMH在内的300 μm的冠状脑片. 全部脑片置于ACSF中室温(25?)下孵育60 min以上备用. ACSF成分(mmol/L)包括:125 NaCl, 25 NaHCO3, 2.5 KCl, 1.25 NaH2PO4, 2.0 CaCl2, 1 MgCl2, 10 glucose (pH=7.4). 整个过程ACSF都持续充以950 mL/L O2和50 mL/L CO2混合气体. l.2.2脑片固定采用盖网固定法，即用铂金丝制成U形框架，然后将稀疏的尼龙丝附着其上，制成盖网轻压于脑片上. 1.2.3巨阻封接与形成全细胞记录使用直立式Nomarski微分干涉相差显微镜. 图像通过显微镜上方的摄像头传输到电脑进行实时监控. 封接前，首先在低倍物镜(×5)下找到VMH核团，然后在高倍浸水物镜(×40)下，通过监控软件窗口观察细胞大小、形态和轴突走行. 选择合适的细胞后，进行巨阻封接(封接电阻达到1 GΩ以上)，待封接稳定2,3 min后破膜，形成全细胞膜片钳记录. 电压钳模式下，细胞电位钳制在-60 mV，给予细胞内刺激后记录反应，用于后期分析神经元的被动膜特性;随后转向电流钳模式记录神经元的自发放电活动. 封接电阻低于1 GΩ的细胞放弃，静息电位低于-40 mV，记录中电位衰减明显的细胞放弃. 记录电极采用外径为1.4 mm的软质玻璃毛坯，经微电极拉制仪2次拉制，电极电阻约为3,7 MΩ. 电极内液成分(mmol/L)包括:130 葡萄糖酸钾,1 NaCl,0.1 EGTA,1 MgCl2,10 HEPES,5 K2 ATP(pH 值用1 mol/L的KOH调至7.2). 实验在室温下进行. 1.2.4数据采集与分析实验数据经模拟 数字转换器采集，采样频率10 kHz，低通滤波频率为3 kHz，采集软件为Axon实验室提供的软件包Clampex 9.0;采用Clampfit 9.0对数据进行离线分析，绘图软件采用Origin 6.1.统计学处理:数据以x?s表示，用SPSS 10.0统计软件进行统计学处理，多组间比较采用方差分析，多重比较采用LSD t检验, P<0.05认为差异有统计学意义. 图1大鼠脑片上VMH和神经元的形态 略 2结果 2.1红外可视条件下VMH和神经元的形态在低倍镜下可清楚的看到300 μm脑片上VMH核团颜色深， 呈椭圆形的阴影块(图1A); 由于脑片表层的细胞易受到切片过程的影响， 功能状态一般不佳， 故本组实验多选用2,3层深的细胞(图1B). 在红外微分干涉相差技术下， 这些细胞成像清晰， 立体感强， 直径约是10,15 μm， 电极接触细胞表面时有轻度凹陷. 2.2SD大鼠VMH神经元的电生理特征和三种神经元类型我们共记录到32个位于VMH的神经元，根据神经元自发放电频率的特征和膜的被动特性将它们分为三型. I型神经元在静息电位没有自发放电，并有相对较小的膜时间常数和输入电阻，分别为(8?1) msec (n=4)和(192?39) MΩ (n=4)，在输入超极化电流后会出现反跳现象;?型神经元静息电位具有自发放电，膜时间常数和输入电阻分别为(14?1) msec (n=11)和(327?2) MΩ (n=11)，较I型神经元的显著增大( P<0.05);?型神经元静息电位也有自发放电，膜时间常数和输入电阻分别为(25?2) msec (n=17)和(522?28) MΩ (n=17)，较I型和?型神经元的都显著增大(P<0.05)，但?型和?型神经元的静息电位、动作电位的幅值、放电频率和后超极化幅值差异均无统计学意义(P>0.05). 2.3CCK对VMH三种类型神经元放电频率的影响?型神经元静息电位没有自发放电，0.4 μmol/L CCK 对其没有作用;但0.4 μmol/L CCK可以使?型(n=4)和?型(n=4)神经元的自发放电频率增加，并伴有膜电位轻度的去极化，它们的自发放电频率都从(4?1) Hz增加到(8?1) Hz (P<0.05)，而动作电位的幅值没有明显变化(P>0.05，图2). 图2CCK对VMH神经元自发放电频率的影响 略 2.4胃泌素对下丘脑腹内侧核神经元兴奋性的影响胃泌素同样可以增加其神经元的放电频率, 放电频率从(4?1) Hz增加到(7?1) Hz (P<0.05)并伴有膜电位轻度的去极化(n=5，图3). 3讨论 VMH是多种哺乳动物中枢调控摄食的重要神经通路 . 本实验中?型神经元仅占10,，?型和?型神经元分别占35,和55,. 它们在静息电位的兴奋性，膜时间常数和输入电阻方面有显著差异，这提示可能由于这三种神经元的大小、树突的长度及细胞膜上离子 通道的数目和种类不同，证实了VMH神经元 图3胃泌素对VMH神经元自发放电频率的影响 略 具有多样性. 有实验表明，外周血中的CCK水平可作为信号传入中枢VMH调控摄食行为 ,3-5,，而且中枢背侧鳃旁体含有能分泌CCK的神经纤维,并延伸达腹内侧核抑制摄食,6,. 我们的实验结果表明0.4 μmol CCK对没有自发放电活动的?型神经元不起作用，不仅不能引起它产生自发放电，而且也不能使它在方波刺激下产生的放电频率的增加，但可以增加占90,的?型和?型神经元的自发放电频率. 这提示CCK对VMH神经元兴奋性的调节具有选择性，并通过提高大多数神经元的兴奋性使饱中枢兴奋抑制食欲. 下丘脑存在CCK A和CCK B两种受体，但是内源性的CCK究竟是通过哪一种受体来调控食欲的仍然存在争议. 胃泌素和胆囊收缩素属同一激素家族，两者的受体序列也有同源性，其中胃泌素与CCK B受体因高度同源被统称为gastrin/CCK受体. 我们在实验中用相同浓度的胃泌素模拟了CCK对VMH神经元自发放电频率的作用，这表明CCK可通过CCK B受体来调节VMH神经元的兴奋性. 【