实时荧光定量PCR法测定福州地区高危型HPV感染型别与病毒载量

实时荧光定量PCR法测定福州地区高危型HPV感染型别与病毒载量 实时荧光定量PCR法测定福州地区高危型HPV感染型别 与病毒载量 " " 福建医药杂志 年 月第 卷第 期 2012 8 34 4 !Fu ianMJde A2ut0gs1u2 .V3l4o N.o4 70 及由于使 用该 药的 目标 血药 浓度范围 尚 未确 立 从 病例及样 本 以满足 临床群 体 药 物 动力学和药 效 学 I 5 而 导致 肿瘤 化学药 物 治疗存 在监测盲 区 因此 迫 研究的 要求 切需要适 用于 临床的有效 药 物 监测的手段 总 之 本研究 初 步建立 了HPLC法测定血浆卡 确 定药 物 治疗浓度范围 不仅是为了获得最佳疗 铂药 物浓度 的平台 为进一 步探 讨 临床疗效 与血药 效 而且也 有利于准 确 预测毒 副 作 用 完 整 的治疗 有效浓度 的关系 制定更 有效 的个体 化给 药 方案 和 方案 应考 虑 患者的个体 差异 使最佳治疗结果 与药 减少耐 药发生和 降低复 发 机 率 提供 了实验基础 I 5 物 剂 量之间 的对应关系更 为确 切 有学者 认为 参考文献 临床治疗上应根据 卡铂血药 浓度来及时调整 下次的 I 1 CaBrhbeAn iPneACrm BrJekDu r oa.telienAt n icAtap-sl 用药 剂 量 并继续监测卡铂血药 浓度 使个体 化用 I //s t ne MLnoLt nBu r LJoaSz KrPeLkaar.madndGnoo g 药后的血药 浓度维持 在有效 范围 以进一 步提高化 o l oaePamchrhstG'aminl ar eaihBlcftiaoss .si.1cdth1eute g p I 6 疗的疗效 及减少不良反 应 在药 物浓度实时 监测 : : NkwYreo eMGha-tcrwHClmiol psiaen 2006 1335-1339 中 金 属配合物 的浓度测定常采 用原 子吸收光 谱 I 李苏 张 力 法测定血浆中 卡铂的 I 中国临床 2 .HPLC AUC J法 但 其 仪器昂贵 前处理需特殊 过 滤 装置 不适 药理 学杂志 : 2002 18 4 294-296. I i3af uLZ aAzdAl Csaonl l eCtas a.tlSeim aradenl -r e t eidd 合临床广泛开展 本研究 采 用的高效液相色谱法比 p p barfocnioaiotnm ianitln aamslb iielahcmnr-ohf r e idu p p y g p C 原 子吸收光 谱法花费 小 亦不需专 用过 滤 装置 因 oamto rhc agr p hryo r.re anadrn eptat aiilcnl coptnipaiotcl -parh 此 该 法尤其 适 合临床开展 本研究 方 法中流动 相采 Isiedu ticst einkoamc J.JoamtoCrh grBdiSBeicmoA pp l 用 甲醇 水溶 液比 纯水更 有利于 色谱柱 的养护 5% : 2001 764 1-2 457-464. 且不需购买 极性较 大的色谱柱 具 有更好 的效 费 I 沈俚 郎景 和 孔北华 等 卵巢恶性肿瘤 I //曹泽毅 4M: 妇 科 常见 肿瘤 诊治指南 .第 3版 .北京 人民卫生出版 社 比 对血浆样 品 前处理方 法的摸 索过 程中 笔 者尝 : 2010 72试用 种 体 积 硫酸 锌 结果 显示 95 100 120 L3 I 叶 敏 朱珠 傅强 等 紫 杉醇 用于 卵巢癌化疗的临床药 效 学 5的沉淀效 果 较 好 取得的数据稳 定可 靠 由 120 L 研究 I 中国药学杂志 : J. 1999 34 5 25-28. 于 患者样 品 采集 不同于 动物 试验和健康 受试者试 I 蔡讯 薛鹏 宋 卫 峰 等 氟 尿喀睫血药 浓度监测在进一 步提 6 验 须符合医学 伦 理学的 要求 同时 本研究 所 有 I高晚 期胃癌化疗疗 效 及减少不良反 应预测中的 作 用 J.肿瘤 : 步骤 都是在不干 扰 临床治疗状况的前提下进行 采 2011 31 10 930-936. 集的样 本量较 少 因此 接着 的工 作是 收集更 多的 实验研究 实 时 荧 光定 量 法测定 福州 地 区 高危型 感染 型别 与病 RCP HVP 毒载量 1 1 1 ! " 福建省第二人民医院二化 e院妇产科 福州 林 玲 林 fg 陈秀清 郭 h民 徐榕青 350003 ! ! ! ! ! ! 摘 要 目的 利用实时荧光 定量 技术进行 分 型定量检测 观察 亚型感染 的分 布情况 初 步 PCR HPV-DNA HPV ! ! ! 探 讨 感染主要基因型 别及病毒载量 与宫颈病变的关系 随机收集 本院 妇 科 门诊患者 例 建立病 历档案 采 HPV ! 108 集患者宫颈脱落细胞样 本 进行 分 型定量检测 结果 例门诊患者检出 阳性 例 阳性率为 HPV-DNA !108 HPV 143 3 12.96% 其 中 单纯HPV次要高危阳性感染9例 占 64.28% 单纯HPV-16阳性感染2例 单纯HPV-31阳性感染1例 和 次高危型三重感染 例 和 / 的二 重感染 例 结论 本组患者 次高危 HPV-16 HPV-31 HPV 1 HPV-16 HPV-1845 1 ! HPV 型感染亚型 几 率最大 高危型 和次要高危型 的感染与宫颈病变有高度的相关性 且病毒 的感染量与病变的程度有一定 HPV 的相关性 同时也显示HPV实时荧光 定量PCR 技术是一 种 有效 的HPV检测手段 关键词 荧光 定量 3 人乳头瘤 病毒 3 高危型 3 次高危型 3 病毒载量 PCR 中图分类号 文献标识码 文章编号 7R11.7 ! A! 04-0070-04 福建省医学科学研究院 1! 万方数据福建医药杂志 年 月第 卷第 期2O2l 8 34 4 !FujianMeJd A2utO2gslu .V3l4o N.o4 7 l n i t c e t eD namnehefchodntaetocolslneearroinvdlnfaeemi-tl a e rh t iwnohz nfn is n r i v amo lal i -a t i t nan g g py p p CPeRv i t ILNn iL g IL-Nn eW nji HC-NEu iX n9i g n-iGnmOuUhs URnXo g-n9i got.n eDmetPradnas c i r t eft Os b !!o l oGc$eohnc narab$ughrEe h t o edpno c esefh t ePl sHs o ol a tPi e c n ifooFrnpuaji uohFzu Fnuaji 35OOOa3n i hC " t c a r t As b e v iOtbc e du tTso ihsnieaoehtlrt amno Pni~oVtecfin P~ Vmain teone.shInitenosalilecvercadn ! j ! y p g g pyasmeimt e o t iepmlrairn ev ryuPs~f Voniiobtrmuetyaihsidtn gteon py eehitn eiea.ivsstcps o s dohMt e iealdt!oafeiTlcexvehrc mo r fs lelc o gl yoecn iicnlgacilc eeabpwsreiiot.andtetnTeahsm Ps~eVp'l-DNAebedteeewrctd iynsu gie-amrtle -ueliavifttIatun eecPnceRsCr o RT-FG-PRC inhect s teul.n s eR eetnrTeeuerheowrf eiOiheicealin8ivtlssntcsco easscsiatetn alt o t i-s o I ! p p p eiewav2tatr.ls96% indu l cIn geinn aPefi~rdeaivoVnstscpsoeocs yihtkig-srh py emneiuxd owt Pefi~eaivoVstscps-6ol mneiuxd eno Pef~ieaivoVstscps-mo3neiulxd eno Pefi~eaivoVsts6cpslo 3alrdnoecsadn yihtkig-srh py emeixd adn / eno Pef~ieaivoVs6tscslo 8l 45nmoeii.xds n l cCno ardTneoehcs ih ki-srh teon ePf~eoVihahths eeahtritetnsh p ! y g g py g / aPni~omVtneocfin beutssohgtlal paeyihvshneie.ossaliTlcevehrc ihsniaoegtlrh 6plhitw 8l 4a5rdnoe3csadln yih kig-srh gteon pyemuhahetfno .psmoauRiaplrvTil-FGiPf~-neioVheniPvcoRttetCieeacsfctednf IeuKs ed r ow tee-ncaerTlsriomuel f eiavittPatRCun RT-FG-PRC muahn smoauialrvil P~ V ih ki-srh teon e y I p p g g py ardnoecs ih ki-srh Srh teon eaiLalrvod y g g py 宫颈癌是最常见 的严重危害 妇 女健康 的恶性肿 荧 光定 量 检测 !! 2.3! CPR 瘤之一 其 发病率 居女性恶性肿瘤 的第 二 位 全 球 阳性标 准 溶 液 的配制 取反 应 的阳性标 2.3.l l ! 6 5 宫颈癌发病 人数 逐年 增加 尤其 在发展中国 家更 为 准 液原液 / 稀 释 借 至 Ol o c ies mL Ol Ol o c - p p [ ] -2l 5 4 突出 其 中 的病例发生在发展中国 家 我 / 浓度 再取 浓度稀 释 借 得 浓度 8O% ies mL Ol Ol Ol 3 2国 作为 一 个发展中国 家亦 是宫颈癌的高发地 区 进 ~ 也依 此 稀 释得到 反 应 和反 应 的阳性 Ol Ol 2 3 行正确 的早期 筛查~ 早期诊断及早期治疗 将 其 阻 标 准 液也照此 法稀 释得到 断在癌前病变阶段 是预防 和控制宫颈癌的关键配制 混合液 混合液组成按试剂 盒说 2.3.2! PRC 研究发 现 人乳头瘤 病毒 是引起妇 女生 殖器 明 配制 P~ V [ ] 3 疣和诱 发宫颈癌的 重 要病原之一 国内外 已 有大 加样 配制完 毕 混合液后 按每 管 2.3.3 PRC 8l ! [ ] 4-8 量相关文献 报道 本文 采 用实时荧光 定量 PRC 分 装至相应的各 管 中 用移液器往装有反 应母 L 卜 法对我 院 例妇 科 门诊患者进行高危型 感 Ol8 P~ V 液的反 应管 中 依 次加 处理好 的样 品 溶 液 2 L DNA 卜染型 别与病毒载量 初 步探 讨 感染主要 或 阳性对照 液或 P~ V ~ O 2 基因型 别及病毒载量 与宫颈病变的关系 为进一 步 上机 测定 检测分 两步进行 第 一 步 2.3.4 PRC ! 制定治疗方案 与疗效 评价提 供 参考 是 聚 合酶的激 活 循环数 温度 孵 DNA l 95C 仪 器与试剂 1! 育时间 第 二步是 扩增 共 个循环 3min DNA 4O 型荧 光 定量 仪 美国 公 ABI75OO PRC ABI 分 段 进行 第 段 温度 第 2 l 94C 5lecs 2 司 高速 离 心机 德国 公司545l D Ef r oedn 段 温度 设置 好 各 参 数 后开 始运行 pp 57C 4Oecs人乳头瘤 病毒基因 分 型定量检测 试剂 盒 意大利 检测 公司 ABaiiAcatln 检测结果和数 据 分析 3! 试验方法 2 判定 宫颈上皮细胞参考 量为 ! 3.1 l O ! 样 本的 采集 与 处 理 采 用宫颈刷 或 细胞刷 取 2.1! 内 标 没有起跳 提示为该 标 本内 无宫颈上 oc ies p样 本 收集到 的细胞连同刷子 放入适 当 的收集液中 皮细胞 即该 宫颈分 泌 物 标 本取样 不合格 若 送检 生理 盐 水或 其他 介 质 样 本管 可 Xl PBS 检测的定量值 提示为阴道 P~ V $.lOE+2o c pies 以在 条件下保存 2 8C~ 或 非宫颈 感染 宫颈上皮细胞参考 量 P~V 2 $ 样 本 的 提取 将 样 本管置 振 摇 器 2.2! HVP-AND 内 标 起跳 分 型定量 值 Oo c ies El +2o c ies p # p 上适 当 振 摇 从管 中 取 液体 至 管 置 / / / / lmL .l5EP 时 提示为未感染高危型 P~ V-6l 8l 3l 33 离 心机 中 / 离 心 弃去上清液 3lOOOr min Ol min / / /高危 感染检验阴性 45525867 P~ V 3 如无沉淀 留少许液体 加 细胞裂 解液 置 5O L 绝对定量值 时 提示 .lOE+2 .lOE+5o c ies 卜 # # p / 水浴锅中 裂 解 后取出 OlOC Ol min 3lOOOr min 为感染该 型 别高危型 有宫颈癌的风险 P~ V 4 离 心 上清液即为 的 溶 液 Ol min P~ V DNA 定量值 时 提示为高度感染该 型 $.lOE+5o c ies p 万方数据 别高危型 病毒量 极大 提示患宫颈癌的风 P~ V 福建医药杂志 年 月第 卷第 期 2O12 8 34 4 !FnMJudajei A2utOgs1u2 .V3l4o N.o4 72 险 属高度 和 次高危型三重感染 例 HVP-31 HVP 1 HVP-16 阳 性病例数及 年龄 分布 统计情况 例门诊 和 的二 重感染 例 阳性亚 型 和 2. 3 ! 1O8 HVP-18 45 1 HVP 患者样 本中 共 检出 HVP 阳性14例 见表1 应用 病毒载量 的分 布如表 2所 不 2 软件处理数据 经 检验 似 然 比 SSPS18.O M X表 患者的 年龄 与 阳 性结果分布 显不 组差异 无统计 学意义 线形与线性 l ! O.693 3 年龄 样 本百 分 阳性 阳性百 分 各年龄 段 阳性组合 显不 组升 降趋 势 差异 无统计 学 MO.7O9 3 样 本数段 岁 比 例数 比 患者百 分 比 意义 岁 21~ 3O 26 24.O7 3 21.43 11.54 阳 性结果型别 与病 毒载量 及临床诊断 例 3. 3 14 ! 岁 31 4O 46 42.59 6 42.86 13.O4 ~阳性患者中 单纯 次高危型 HVP HVP-33 52 岁 41~ 5O 36 33.33 5 35.71 13.89 合计 1O8 1OO.OO 14 1OO.OO 12.69感染 例 占 单纯 阳性 5867 9 64.28 HVP-16 感染 例 单纯 阳性感染 例2 HVP-31 1 HVP-16 表 阳 性样 本临床诊断与检测结果 2 !HVP 编号 年龄 岁 病情 内 标 !! HVP-16 HVP-18 45 HVP-31 HVP-Srh 宫颈肥大 重度 糜烂 1 24 O O O 3.2OE+O3 3.13E+O5 宫颈轻度糜烂 2 28 O O O 7.8E9 +O4 6.7OE+O4 3 3O ASSUC 2.39E+O4 3.73E+O2 O O 5.42E+O74 34 阴道炎 宫颈炎 O O 6.3OE+O4 O 6.2E9 +O4 子宫肌瘤 宫颈糜烂 中 度浅 表型 5 35 O O O 8.82E+O4 2.3OE+O5 卵巢巧 克 力囊肿破裂 术后 -菌性阴道炎 6 38 O O O 2.16E+O3 2.O1E+O5宫颈肥大 重度 糜烂 7 38 O O O 2.OE9 +O8 1.51E+O48 39 ASSUC 宫颈轻度糜烂 O O O 2.45E+O7 4.16E+O5 阴道炎 宫颈炎 9 4O 2.3E9 +O8 O 1.19E+O8 5.O4E+O5 5.6OE+O3 级 1O 41 ICN I O O O 4.12E+O3 5.66E+O5 宫颈尖 锐湿 疣 11 43 1.3E9 +O5 O O O 5.81E+O5 12 48 ICN 级 O O O 2.15E+O6 2.72E+O5 I 宫颈肥大 13 49 O O O 2.28E+O6 2.O3E+O5 级 14 5O ICN I .985E+O6 O O O 1.3OE+O4 注 病毒载量 为绝对定量 单位为宫颈上皮内 瘤 变 是宫颈癌前病变 包括 宫颈不典型增 生及宫颈 原 位癌!! csoepi Lm ICN ASSUC 鳞状上皮细胞病变 内 标 指宫颈上皮细胞参考 量讨论 关联 4 ! l. 4 HVP 感染 的 年龄 特征 本文 测定的1O8例样 感染 的型 别 特征 从 例样 本检出的 ! 3. 4 !HVP 1O8 本患者的年龄 从21 5O岁不等 从表1可 以看 出 例阳性的 亚型 分 布可 见 次高危型 ~ 14 HVP HVP 岁的患者阳性率最高 占 这 可 能 31 4O 42.86 占 在 感染亚 ~ HVP-33 525867 64.28 HVP 与该 年龄 段 的女性性生 活活跃 有关 但从 各年龄 段 型 中 几 率最大 且远远超 过 HVP-16 HVP-18 -193 阳性患者百 分 比比较 不同组别间无 明 显差异 感 的感染几 率 与文献 报道 的福州 45 HVP-31染率均 在 11 ~ 14 地 区或 福建省患者 感染情况比较 有较 大差异 HVP 感染 与官颈病 变之间 的关系 检出 2. 4 !HVP HVP 文献 报道 均 以 型 占 最大比 例 而 我 们 本次发 现 16 阳性的患者 均 表现 不同程度的女性生 殖道 疾 病 以 次高危型 为主 可 能与我 院 门诊患者多以 HVP 如宫颈鳞状上皮细胞内 瘤 变 宫颈糜烂 宫颈肥 东城区居民有关 值 得指出的 是与文献 比 -193 大 阴道炎 子宫肌瘤 或 卵巢巧 克 力囊肿等 且病 较 我 们 不仅提供 了患者感染 型 别还提供 了 HVP 毒载量 大致与病变严重 程度呈 正相关 由于 样 本数 病毒载量 的信息 这 为进一 步制定治疗方案 与疗效 有限 虽然 不能得出 感染的型 别 浓度与宫 HVP 评价提 供 了较 好参考 依 据 颈病变之间 的确 切关系 但从 结果 可 以初 步看 出 参考文献的感染病例基本都有不同程度的宫颈病变 HVP 万方数据 且病变类 型 及程度与感染的 型 别及浓度有 HVP nMa1mf fSich EPe.elhtt s aC f oe s imopr rc-ecnlcaai v rclbeoagl