[word doc]青钱柳种子无菌萌发研究

[word doc]青钱柳种子无菌萌发研究 青钱柳种子无菌萌发研究 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2010VO L.21NO.8时珍国医国药2010年第21卷第8期 青钱柳种子无菌萌发研究 徐庆,吴群英,李伯林 (1.桂林医学院,广西桂林541004;2.广西师范大学生命科学院,广西桂林541004) 摘要:目的探讨不同处理方式对青钱柳种子无菌萌发的影响.方法浓硫酸对种子进行预处理后,采用正交设计对影响 其萌发的GA3浓度,浸种温度和浸种时间进行研究,再将外植体进行消毒,接种于不同激素组合的MS培养基中进行无 菌培养.结果青钱柳种子萌发的最佳处理为:浓硫酸酸蚀9.5h+lO00mg/L的GA溶液+浸种24h+浸种温度35?;种 子萌发的最优激素组合为:MS+6一BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+GA30mg/L;对青钱柳幼苗进行离体培养,液体培养 基比固体培养基更有利于青钱柳的离体培养.结论对青钱柳种子进行了综合处理再进行无茵培养,可以提高青钱柳种 子的发芽率. 关键词:青钱柳种子;激素;萌发;无菌培养 DOI标识:doi:10.3969/j.issn.1008-0805.2010.08.092 中图分类号:$567文献标识码:B文章编号:1008-0805(2010)08—2045-02 青钱柳Cyclocaryapaliurus(Bata1.)Iljinskaja又名摇钱树,山 沟树(浙江),麻柳(湖北),青钱李等,系胡桃科青钱柳属植物, 为我国特有的珍稀树种,是国家重点保护的濒危植物之一., 在广西桂林等地也有分布.青钱柳有降血糖,降血压,降血脂等 作用,被认为是治疗2型糖尿病的安全低毒的良药. 现有的青钱柳多零星分布于深山老林和一些自然保护区中, 主要是天然林,青钱柳种子发育差,种子败育很严重且具有深休 眠特性,人工育苗出苗率低,一般播种后需隔年甚至2年后才萌 发,坚硬种壳是阻碍种子萌发的因素之一,这在一定程度上 制约了青钱柳人工资源的培育和开发利用,严重影响了青钱柳的 开发与产业化进程.目前有关青钱柳种子萌发的研究报道并不 多,本试验以青钱柳种子为外植体,采用浓硫酸软化种子种壳,结 合赤霉素浸泡后进行无菌培养,探讨浓硫酸,赤霉素综合处理及 培养基激素等因素对青钱柳种子萌发的影响,探讨提高青钱柳种 子发芽率的方法. 1材料 青钱柳种子由桂林医学院药理教研室提供(2005年采集于 桂林资源县中峰乡野生青钱柳植株). 2方法 2.1种子的预处理4?条件下,用浓硫酸分别浸泡种子4.5, 9.5,13.5h,自来水下将种子面黑色碳化物搓洗干净,经消毒 后接种于不含激素的固体培养基中,以清水浸种作为对照. 2.2种子的综合处理采用正交实验设计,对GA,浓度,浸种时 间和浸种温度均设3个水平,分别为:GA浓度设100,500,1000 mg/L;GA浸种时间设12,24,48h;浸种温度设5,25,35?.种 子综合处理方案见表2. 2.3种子的消毒和接种将处理过的种子用清水洗净,于75% 酒精中浸泡1min,转入0.1%升汞浸泡15min,无菌水清洗4次 后,接人培养基,每一处理接种20颗种子. 2.4初代培养培养基为固体培养基,激素组合采用正交实验设 计,设计方案见表3. 2.5继代培养当青钱柳幼苗长至4,6cm高时,将根尖和萌发 芽剪下(长度约为2cm左右),分别接人激素水平为6-BA 收稿日期:2010-02-03;修订日期:2010-05—11 基金项目:广西壮族自治区科学研究与技术开发计划项目(No.0424008—1L) 作者简介:徐庆(1956一),男(汉族),山东胶州人,现任桂林医学院药理 学教研室教授.硕士学位,主要从事抗病毒与抗肿瘤天然药物科研工作. 通讯作者简介:李伯林(1964-),男(汉族),广西柳州人,现任广西师范 大学生命科学院副教授,硕士生导师,博士学位,主要从事植物细胞工 程, 植物生理等领域的研究和开发工作. 2.0mg/L+NAA0.1mg/L的固体培养基和液体培养基中. 2.6培养基的设计MS为基本培养基,附加3%的蔗糖,固体培 养基附加0.7%的琼脂,培养基灭菌前将pH值调至5.8—6.0. 2.7培养条件接种后先进行暗培养,种子萌芽后转为光照培 养,光照时间12h/d,光强1500,2000Lx,培养温度为(25? 0.5)oC. 2.8实验结果的统计和计算每一处理在接种后定期观察,记录 种子的污染情况和生长情况,分别记录接种20,40,60d种子的 发芽情况,接种60d时统计发芽率:发芽率(%):萌芽种子数/ 未受污染的接种数×100%. 3结果 3.1浓硫酸酸蚀时间对青钱柳种子萌发的影响青钱柳不经酸 蚀,种壳对种子的萌发产生了很大的阻力,发芽率为0(结果见表 1).用浓硫酸进行不同时间的酸蚀后,酸蚀4.5,9.5h两个处理 中均有种子发芽,以9.5h的发芽率最高,在一定范围内,随 酸蚀时间的延长,种子的发芽率升高,但酸蚀时间过长,酸蚀 13.5h,会导致种子胚的损坏,最终导致种子无法萌发. 表1浓硫障对青钱柳种子萌发的影响 处理时间第1颗种子20d发芽数40d发芽数60d发芽数污染数发芽率 t/h发芽时间t/d(颗)(颗)(颗)(颗)(%) 对照 4.5 9.5 13.5 39一 l91 3.2不同浓度GA浸种时间和浸种温度对青钱柳种子萌发的 影响不同浓度的GA浸种可显着促进种子萌发,有效解除种子 休眠J.正交实验结果表明,综合处理可促进种子萌发,但发芽 时间和发芽率有差异,A8处理的青钱柳种子发芽时间最早,17d 就可以看到种子发芽,60d时发芽率可达42.11%,A9处理发芽 时间最迟,1个月才发芽,且发芽率仅为10.53%(见表2),说明 A8处理能较快地打破青钱柳种子休眠和提高青钱柳的发芽率; 极差分析表明,GA浓度产生影响的极差最大,浸种温度的极差 值最小,浸种时间次之,说明GA的浓度对青钱柳种子发芽率影 响最大,温度对青钱柳种子的发芽率影响最小,优化组合为GA lO00mg/L+浸种24h+浸种温度35?. 3.3不同激素种类及浓度对青钱柳种子萌发的影响不同的外 源激素及其不同处理浓度对种子发芽势有明显影响o,本试验 通过正交设计探讨不同激素组合对青钱柳种子萌发的影响,结果 表明,B6处理种壳出现裂缝及发芽时间最早(15d),发芽率最高, 可达66.67%,B7和B9发芽率次之(36.84%);发芽数率最低的 为B2,发芽率仅为10.53%(见表3).极差分析表明,6一BA产 ? 2045? O加0 一一一一 时珍国医国药2010年第21卷第8期LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2010VO L?21NO?8 生的影响极差最大,其次是NAA和GA,,说明三者对青钱柳种子钱柳种子萌发的最优培养基配方是:MS+6一BA0.5mg/L+ 萌发影响的大小依次为:6一BA>NAA>GA3,比较均值可得青NAA0.1mg/L+GA330mg/L. 表2GA,浓度,漫种时间和浸种温度对种子萌发的影响 3.4培养基状态对青钱柳幼苗继代的影响当青钱柳幼苗长至 4cm高时,将根尖和萌发芽剪下(长度约为2cm左右),分别接入 激素水平为6一BA2.0mg/L+NAA0.1ms/L的固体培养基和液 体培养基中,其生长情况见表4.在固体培养基中,所转接的根 和芽在接种21d后均发生褐变和死亡.在液体培养基中,所转 接的根在培养7d后,根基部即产生愈伤组织,并逐渐膨大,培养 至21d时愈伤组织变黄;芽转入增殖培养基后,生长良好,培养 至14d就长出两个侧芽,继续培养则形成丛生芽,说明同一激素 配方,液体培养基更有利于青钱柳幼苗的继代培养. 表4培养基状态对青钱柳幼苗继代的影响 时间/垦堡堑鲞墨鱼垫焦皇量况堕堡堕鲞堇鱼塑焦生堕塑 堡茎堡茎—— 7颜色变黄无变化基部产生愈伤组织叶柄j萌动 芽伸长,基部膨大 14颜色变黄无变化愈伤组织膨大形成愈伤组织,叶 柄处抽生2个侧芽 芽继续伸长, 2l死亡芽褐变,死亡愈伤组织变黄叶柄处形成丛生芽, 怠组继笙麈 4讨论 青钱柳是我国特有的,集药用,材用和观赏等多种价值于一 身的单种属珍贵树种,其种子具有深休眠特性,一般播种后需隔 年甚至2年后才萌发,研究表明,综合处理措施可以有效解除种 子休眠,缩短发芽时间,尚旭岚等通过浓硫酸酸蚀再剥取离 体胚进行培养,获得了一定数量的再生植株,为青钱柳的快速繁 殖提供了一种新的方法,但该试验对于GA的影响,仅考虑了其 浓度,并未将浸种温度,时间的影响因素考虑在内;在培养基的设 计方面,激素水平也只涉及GA;此外,由于青钱柳种子较小且坚 ? 2046? 硬,剥取离体胚具有一定的难度,本试验通过酸蚀预处理,浓硫酸 对种子进行预处理后,采用正交设计对影响其萌发的GA,浓度, 浸种温度和浸种时间进行研究,再将消毒的种子直接接种于正交 设计的不同激素组合的MS培养基中进行无菌培养,经比较分析 得出适合青钱柳萌发的最佳处理为:浓硫酸酸蚀9.5h+100omg/ L的GA溶液+浸种24h+浸种温度35~C;种子萌发的最优激素 组合为:Ms-4-6一BA0.5mL+NAA0.1mg/L+GA330mg/L. 本试验对种子进行酸蚀和综合处理后直接进行无菌培养,不 仅减少了剥离种胚的操作步骤,而且与传统的通过沙子层积打破 种子休眠获得种苗相比,可直接得到无菌苗进行快速繁殖,为进 一 步探讨青钱柳种苗的规模化生产奠定了基础. 参考文献: [1]谢明勇,李磊.青钱柳化学成分和生物活性研究概况[J].中草 药,2001,32(4):365. [2]方升佐,杨万霞.青钱柳的开发利用与资源培育【J].林业科技开 发,2003,17(1):49. [3]杨万霞,澈香香,方升佐,等.青钱柳种子的种皮构造及其对透水性 的影响[J].南京林业大学(自然科学版),2005,29(5):25. [4]史晓华,徐本美,黎念林,等.青钱柳种子休眠与萌发的研究[J].种 子,2002,5:5. [5]刘自刚.外源激素破除桔梗种子休眠的方法研究[J].安徽农业科 学,2008,36(2O):8458. [6]潘学军,张文娥,樊卫国,等.外源激素处理对贵州毛葡萄种子发芽 的影响[J].种子,2007,26(1):25. [7]ShengzuoFang,JiayuanWang,ZhaoyangWei,eta1.Methodsto breakseeddormancyinCyclocaryapaliurus(Bata1)l~inskaja[J]. ScientiaHorticulturae,2006,110:305. [8]尚旭岚,徐锡增,方升佐青钱柳离体胚的培养及快速繁殖[J].南 京林业大学(自然科学版),2007,31(1):101.