枯草芽孢杆菌和约氏乳杆菌对仔猪T细胞免疫与肠道黏膜免疫的影响

枯草芽孢杆菌和约氏乳杆菌对仔猪T细胞免疫与肠道黏膜免疫的影响 四川农业大学 硕士学位论文枯草芽孢杆菌和约氏乳杆菌对仔猪T细胞免疫与肠道黏膜免疫的 影响 姓名:曹希亮 申请学位级别:硕士 专业:预防兽医学 指导教师:倪学勤曾东 20070501 摘要 本文通过刚出生仔猪的饲养试验，测定枯草芽孢杆菌和约氏乳杆菌对仔猪肠道黏膜免疫、,细胞免疫、肠道菌群、日增重和腹泻指数的影响。 采用双抗夹，,,,，,,方法，测定两种微生态制剂对仔猪肠道黏膜免疫的影响，比较不同处理组粪样中的,培脉平。结果不同处理组仔猪的,，,,水平没有显著差异，都随日龄增加而增加，,周龄达高峰，然后,，,,水平呈下降趋势。 仔猪前腔静脉采血，使用流式细胞仪检测微生态制剂对仔猪,细胞亚群的影响，通过测定,,,，,,,，、,?,,，,,,，、,,,，,,,，,,,,，,,,，、,,,，,,,，和,,,,,,,(的数量变化检测微生态制剂的作用效果。,,日龄和,,日龄时，约氏乳杆菌组,,,，,,,，和,,,，,,,，,,,,，,,,，显著高于对照组和枯草芽孢杆菌组(,(，,(,,)，说明约氏乳杆菌可以提高仔猪免疫力，增强抗病能力。,,日龄时，枯草芽孢杆菌组,,,，,,,，显著高于对照组和约氏乳杆菌组(,,,(,,)。其它指标与对照组差异不显著，说明枯草芽孢杆菌在增强仔猪免疫力方面没有明显作用，但是作为一种肠道外籍菌可以影响外周血,,,，,,,，的含量。仔猪外周血的,,,，,,,，数量只是,,日龄时，枯草芽孢杆菌组显著高于约氏乳杆菌组，同时约氏乳杆菌组,,,，,,,，和,,,，,,,，,,,,，,,,，显著高于对照组和枯草芽孢杆菌组(,,,(,,)。三个处理组的,,,,,,,,没有显著差异，随仔猪日龄的增加有稍微下降的趋势。 采集不同日龄的仔猪新鲜粪样，检测微生态制剂和对照组的厌氧菌和需氧菌的数量。,,日龄时，对照组大肠杆菌显著高于约氏乳杆菌组(,,,(,,)，其他时间各个处理组差异不显著;在,日龄、,,日龄和,,日龄时枯草芽孢杆菌组和约氏乳杆菌组梭菌显著高于对照组口,,(,,);在,日龄和,,日龄，约氏乳杆菌处理组消化球菌显著高于对照组(,,,(,,);肠球菌数量只是在仔猪断奶时，约氏乳杆菌组显著高于对照组口,,(,,);乳酸杆菌的数量只是在,日龄的时候显著高于对照组:双歧杆菌在不同处理组没有显著差异。说明添加微生态制剂一定程度上起到了增加肠道厌氧菌的数量，断奶时肠球菌数量的增加说明断奶应激时微生态制剂起到了平衡肠道厌氧菌和需氧菌比例的作用。 记录仔猪的每天腹泻情况，以检测微生态处理组在控制仔猪腹泻方面的作用效果。并于仔猪刚出生和试验结束时记录仔猪的窝重，用以计算仔猪的日增重。添加微生态制剂对仔猪日增重的影响效果显著，尤其是约氏乳杆菌末重和日增重都显著高于对照组口,,(,,)。而微生态制剂处理组在控制腹泻方面也起到了明显的效果，腹泻指数微生态制剂处理组显著低于对照组(,,,(,,)。说明微生态制剂可以很好的控制仔猪腹泻和提高仔猪的日增重。关键词;微生态制剂,细胞免疫黏膜免疫肠道菌群生产性能 ，,,,,,,;, ,, ,,,,,,,,; ,,;,,,,, ,,,,,,,, ,,, ,,;,,,,;,,,,,,,,,,,,,, ,, ,,;,,,—,,,,,,,, ,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,, ,,;,,,, ,,,,,,,, ,,, ,,—,,,,,(,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,,,;,,,) ,,,,;,,, ,, ,, ,,,,？,, ,,, ,,,,,,,,, ,,,仃,;, ,, ,,,,,,,;, ,, ,,, ,,,, ,,,,, ,,;,,,,,, ,(,,,,,,,, ,,, ,(,,,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,,,,,,,，,,,,,,,,,, ,,;,,,,,, ,,,,,,,,,,，,,,,,,, ,,,,, ,,,,,,,,,, ,,,, ,,, ,,,,,,,, ,;,佗,,,, ,,,,,,,,,, ,, , ,,,,,,, ,,,,,,,,,,谢,, ,,,,,,,(,,,,,,, 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微生态制剂对动物免疫性能的影响，国内外已做过大量的研究，并取得了重大成果。微生态制剂可作为非特异免疫调节因子，通过细菌本身或细胞壁成分刺激宿主免疫细胞，使其激活，促进吞噬细胞活力或作为佐剂发挥作用，从而提高动物免疫力。 ,,,,等,,,(,,,,)发现仔猪饲喂酵母菌和蜡样芽孢杆菌后小肠绒毛长度增加。饲喂双歧杆菌,,,,可以降低因大肠杆菌和轮状病毒引起的断奶腹泻【,】。然而，健康状况的改善是否是免疫激活的原因或者这些免疫激活是否是微生态制剂引起的，大多数动物试验仍未研究清楚。同样，猪的免疫性能是否受微生态制剂影响也没有研究清楚。 肠道黏膜不仅是消化、吸收营养物质的场所，而且还具有重要的免疫功能。这是由于肠道中存在着多种微生物，可在那里形成菌丛(一般有,,,,,,,种之多):肠道在与这类微生物共存的同时，还可识别入侵的有害微生物以及被肠黏膜上皮吸收的异己物质，并加以排除。因此肠道黏膜免疫是机体防止感染的第一防线。 ,细胞是由胸腺的淋巴干细胞分化而成，是淋巴细胞中数量最多，功能最复杂的一类细胞。流式细胞仪研究,细胞亚型，一般使用,,,或,,,单标单抗或,,,与,,,双标抗体，而不用,,,抗体进行限定，这使得试验结果出现误差。,细胞主要包 括,辅助细胞(,?和,抑制细胞(,,)细胞亚群。,,,细胞代表外周血中总的成熟,细胞。理论上应约等于,,,，细胞和,,,，细胞的总和。但往往出现,,,，与,,,，细胞之和大于,,,的情况。这是因为,,,，细胞其实包括两部分:,,,，,,,，(真正的,,细胞)和,,,(,,,，细胞(非,,细胞);,,,细胞也包括两部分:,,,，,,,，细胞(真正,,细胞)和,,,一,,,，细胞(非,,细胞);而后者又可以分为两组:一组为,,,,,,,，,,(,,，,,)，细胞(即,,细胞的一部分)，另一组为,,,,,,,，,,(,,，,,),(一群未知细胞)。由此可见，真正的,,细胞是,,,，,,,，细胞，真正的,,细胞是,,,，,,,，细胞，若使用,,,或,,,单标单抗或,,,与,,,双标抗体来检测,,和,,，而不用,,,抗体进行限定，则测出的结果必然会偏离真实值。尤其当,,细胞明显增加时 崾梗茫模聪赴 停茫模赶赴 淖芎驮洞笥冢茫模常 赴 ,虼耍 欢ㄓ萌 獗昙遣拍芊治稣嬲 母ㄖ 裕韵赴 鸵种菩裕韵赴 常薄,保 蔽? 萍撩庖叩幕 ?现在对微生态制剂引起免疫的原因，主要是细菌易位造成的。细菌易位是原籍菌群离开自己所处的生境，进入其他生境，如双歧杆菌由肠内到肠外的过程。而外籍菌进入肠道被认为是一种特殊的细菌易位。 肠道微生物群是一个复杂多变的生态系统，到目前为止，被鉴定的大约有,,,个菌种【,】。多变而稳定的肠道微生物群对宿主的健康和生产性能起着非常重要的作用。断奶对仔猪造成的应激，严重破坏了胃肠道微生物群的平衡。断奶前，母乳生物活性成分提供了丰富的肠道免疫保护，这些保护降低了环境和营养改变对仔猪的影响。 ,,,,,,)描述细菌易位就是胃肠道活的原籍菌离开胃肠道进入其他通道。,,,,等【,】陈述肠道附近的淋巴结或者其他组织可检测到活菌。细菌易位的原因可能与细菌的过度生长、肠道屏障的破损和宿主免疫应答降低三个因素有关,,】。大量的研究显示，断奶过程都与以上三个因素有关，因此，仔猪在断奶初期很容易出现细菌易位。 ,,,,,〔,,报道仔猪饲料添加粪肠球菌,,,,没有影响肠系膜淋巴结的细菌数，但是,,天断奶时，,,降低，说明这种菌影响全身免疫。尽管肠道屏障上易位的细菌和进入肠系膜淋巴结的细菌数量没有差异，但是细菌的精确组成成分可能改变了，导致肠相关淋巴样组织免疫细胞与细菌及其产物发生作用，以至于细胞因子发生了微小的变化。细胞因子是宿主免疫的主要调节因子【,,。由于抗原和淋巴细胞的相互作用在肠相关淋巴样组织释放的细胞因子可以调节全身免疫系统嗍，因此，口服粪肠球菌,,,,可以诱导全身，,,的产生。微生态制剂对宿主庖哂Υ鸬男Ч 驯还惴罕ǖ馈荆敢弧?,,,,,提出尽管胃肠道的原籍菌成分只是少量的不间断的易位，但是肠系膜淋巴结和其他肠外部位，通过宿主的免疫应答仍然保持无菌。而,,,,,掣,】在肠系膜淋巴结发现比较多的活菌，他发现肠系膜淋巴结的细菌主要是双歧杆菌。,,,,,,等,,,】指出生长肥育猪的肠系膜淋巴结、肝和脾可能存在,,,,(,的细菌。,,,,等【,,报道小鼠口服化学药物可以诱导细菌易位到肠系膜淋巴结，导致淋巴细胞和巨噬细胞受损。因此，肠系膜淋巴结存在大量活的，非致病性的双歧杆菌对肠道原籍菌的耐受性是一个非常重要的影响因素。胃肠免疫力的成熟需要免疫系统的驯化，这样才能产生良好的免疫应答。原籍菌与肠相关淋巴样组织不断发生相互作用。如果这些相互作用诱导不合适的免疫应答，那么胃肠道就可能产生炎症【,”。为了保持宿主健康，胃肠道免疫系统必须 拥有迅速的免疫应答能力和恰当的抗原免疫激活。免疫系统的发展和成熟过程中，已易位的双歧杆菌并没有产生抗体，它的作用还需进一步研究。,,(,猪,细胞免疫的研究 ,细胞在胸腺内的分化发育经历,,,,,,,(细胞的早期阶段、,,,，,,,，细胞的中期阶段、经过阳性选择和阴性选择分化发育成只表达,,,，或,,,，的细胞的后期阶段【,,,。 猪的免疫与其他物种有明显的不同，尤其是,细胞亚群。除了,,,,,,,，(抑制性,杀伤性,细胞)和,,,，,,,((辅助性,诱导性,细胞)外，,,,,,,,(和,,,，,,,，亚型在血样和淋巴组织中也比较多„”一兜。,,,,,,,,(细胞作用还不清楚，可能由不同的细胞群组成，如,,,，，(俩),细胞和,,细胞„,,,。猪的,细胞群包括大量的,,,，,,,，和,,,细胞，但是他们在免疫应答方面的作用还不是很清楚。而在外周血中,,,的,细胞是;,,,,细胞，只表达,,受体，如,,,,,,,，、,,,，,,,(和,,,，,,,，。,,,，,,,(报道比较多，这里不再介绍。,(,(, ,,,，,,,，细胞 ,,,，,,,，细胞的产生依赖于微生物的刺激【,,,，在切除胸腺后的新生猪外周血中，存在着大量的,,,，,,,，细胞,堋。新生猪在切除胸腺后的近,年时间内，外周血中大部分,,,，,,,，细胞表达,,,?类抗原、,,,,,和高水平的粘附分子【,,】,在体外，静止的,,,，,,,，细胞能对回顾性病毒抗原发生反应，并表达高水平的,,,,分子、,,整合素和,,,抗原(猪静止,细胞的标志)„,,，,,,。据报道，猪,,,，,,,，细胞亚群 。能产生高水平的，,,,丫,,,,。 猪的非胸腺,,,，,,,，细胞被认为是成熟的记忆细胞,效应细胞【,,，,?。猪的,,,，,,,，,细胞被报道随日龄增加而大量增,,,,,”】，从仔猪的百分之几增长到成年猪的,,,。然而，研究发现,,,，,,,，细胞在患痢疾的病猪体内并未检测出，而健康猪则存在，据此推测,,,，,,,，细胞可能与年龄无关嘲。在,,,,,,掣,,,研究过程中，痢疾猪体内的,,,，,,,，细胞没有增加，，但是经过体外再次免疫后发现，这些细胞有所增殖。,,,，,,,，细胞的增加，可能有助于记忆细胞和效应细胞发挥作用【, ,，,?。,,,,掣矧报道，,,,，,,,十细胞是记忆性辅助,细胞，可以有效的诱导伪狂犬病毒疫苗的记忆性应答。,,,,,,,,,,等〔,,,报道外周血,,,，,,,，细胞参与抵抗传染性病原体的免疫应答，增加了,细胞亚群参与抗病毒免疫应答的敏感性。,,,，,,,，细胞能够产生，,,,,，而,一,,可以激活,细胞，使其生长和分化，并参与抗体的产生【,,】。猪是唯一具有非常高的,,,，,,,，细胞的动物，因此，猪发生痢疾时，这些细胞的 ,作用非常重要田,。,(,(,俩,细胞 ,,,,,,,(细胞可能由,,,，，(,,),细胞和,,细胞组成【,,,。 不同动物，受到不同的感染后，俩,细胞均有所增加，例如小白鼠【,,,、犊牛〔,,,、雏鸡【,,,和人【,,,。这些细胞在早期免疫应答的过程中是非常重要的，可防止上皮细胞感染【,舢,,,;在仔猪其它免疫细胞亚群成熟之前，在免疫应答方面起着非常重要的作用【, ,,。 俩,细胞被认为对仔猪非常重要，随日龄增加，百分含量逐渐降低;而,,,细胞增多，对免疫系统的作用也越来越重要【,,,。小白鼠体外试验中，肠上皮细胞的俩,细胞激发上皮细胞的增殖与分化,儿。俩,受体发生变异的小白鼠由于缺少俩,细胞，造成,,细胞应答失败，导致上皮细胞增殖 减少，肠损伤扩大【,,】。?,,,能调节牛的,,,，细胞的抗原激发增殖反应【,,,，说明似细胞起到免疫调节作用。也就是说，具有高水平俩,细胞的猪对感染不敏感。 然而，,,,,,,,,〔,,,研究发现，具有大,,?,,细胞的猪更易腹泻，这与,,,,,等,,,】所做的小白鼠的研究是相符的。,,,,,发现低水平,,,细胞的小白鼠对猪霍乱沙门氏菌不如高水平,,,细胞的敏感。因此，为了更好的抵制感染，丫,,细胞对动物是不利的。而且其他微生物的研究过程中，克氏锥虫感染后，丫,,细胞贫乏的小白鼠显示更低的发病率和死亡率〔,,,。通过,,,细胞功能下降，感染过程？,,,,，,细胞的作用开始表现出来。 ,,,,,,,,,,〔,,,发现,日龄仔猪的,,,，和,,,，上皮内淋巴细胞的数量明显少于,,,，，说明仔猪上皮内淋巴细胞主要是,,,，,,,,,,,(细胞。免疫组织学研究揭示了即使,月龄的猪，其上皮内淋巴细胞也主要是,,,,,,,(细胞，这与存在于基底膜附近的上皮内淋巴细胞是,,,(,,,，的情况截然相反。,(,(, ,,,，细胞 ??因为;,,瑚胞主要激发细胞因子田晰【,,】，而吲二讨巨噬细胞的激活和增殖非常重要,,,。大量的,,,，存在于肠上皮内,，,？，局部分泌玎,,吖。即使,,,细胞可以产生,((,,?,,，,(,,,，然而丫,,细胞缺乏的小白鼠比一般的小白鼠产生更多，,,吖,,,】。因此，可以推断，具有高水平,,,细胞的动物比高水平的,,,，细胞的动物对感染更敏感，这说明存在一种可能性，猪痢疾的康复主要依赖的不是体液免疫，而是,,,，细胞和巨噬细,胞免疫。由于缺少,细胞的增殖和保护性抗体的产生，可能有另外一条抗猪痢疾螺旋体的重要途径来提高或调理吞噬细胞反应瞄,。通过使用猪痢疾螺旋体康复的血清处理的猪结肠袢的培养物可以预防结肠感染，而灭活的血清作用不明显【”。这或许说明补体的参与是非常重要的，是主要的调理途径。 研究发现添加了微生态制剂的断奶仔猪上皮内的,,,，显著低于一直不断奶的仔猪。上皮内的,,,，主要具有细胞毒性，含有破坏受感染的或受应激的靶细胞的细胞溶解酶【“。小肠靶细胞的鉴定一定程度上是通过受刺激细胞表面的非,,,分子，刺激包括应激和感染,,,,。,,,,,,,,,等,,,】发现,(,,月的猪空肠和回肠的免疫细胞几乎所有的都是,,,，上皮淋巴细胞。 而微生态制剂对肠绒毛长度的影响方面的研究还比较少【,,，免疫组织学数据也没有很显著的差异，说明,,,，细胞的减少不是由于肠上皮细胞的增加引起的„,,,。同样，在?饼品中，没有发现大量的,,,，淋巴细胞〔,,,，这排除了分离过程中淋巴细胞固有层进入细胞混悬液的可能【,“。上皮层,,,，细胞的减少可能是由于添加微生态制剂的仔猪上皮内的,,,，细胞绝对数的减少,,,,。,,,,,,〔,,,发现小白鼠饲喂不同种的乳酸菌后小肠,,,，细胞数量减少，然而,,,,,,认为乳酸茵不能降低细胞毒性。 上皮内淋巴细胞,,,，的减少可能是因为微生态制剂对仔猪有免疫抑制作用，还有,种可能是因为,,,(,,,一增加的缘故，粪肠球菌对未知功能的,,,,,,,(细胞群具有增生作用,,,〕。,(,微生态制剂对猪肠道黏膜免疫的影响 ,，,,是肠黏膜免疫系统中免疫细胞产生的最主要的抗体，能防止病原微生物从肠黏膜入侵机体。发生在肠道中的黏膜免疫反应是由肠黏膜表面附着的抗原引起的。 ,，,,在黏膜上以细胞组织中的淋巴或浆细胞合成后便被上皮细胞运输到黏膜表面，并与原籍菌混在一起，保护原籍菌不受侵犯，而对外籍菌予以抑制。,，,,分子落 入肠腔便组成粪抗体，对外籍菌和肠道致病菌产生抑制作用。,〔,,与分泌片相结合可以保持，,,分子在肠腔内的稳定性。这就使其在自然生境内具有保护原籍菌，抑制外籍菌的作用。例如,，,,可以干扰霍乱弧菌对肠上皮细胞的接触。这种保护作用与原籍菌群相互作用可引起更有效的生物拮抗效应。 黏液中的,，,,可封闭微生物的粘附位点，使毒素失活，从而抑制细菌定居。小肠隐窝的潘氏细胞通过产生溶菌酶和隐凹素参与黏膜防御【,,】。 ， 分泌型，,,保护原籍菌、抑制外籍菌的原因还不清楚。但这些免疫球蛋白的产生，与正常微生物的存在是有联系的。无菌动物的,,,,水平是比较低的。 由于微生态制剂具有良好的效果，有人建议使用微生态制剂代替抗生素，来改善动物的健康和抵抗传染病【,,,。长双歧杆菌和其他一些乳酸菌被发现具有增加肠道,，,,的作用,,,。类似的情况还有，干酪乳杆菌被报道具有免疫佐剂的作用„,,,。植物乳杆菌可以增加抗大肠杆菌的抗体水平筘射。 ( 据报道，出生仔猪免疫系统不断发育，但到,周龄甚至更久才能有较完整的主动免疫功能。如果,周龄前断奶，由于仔猪黏膜免疫系统发育还不健全，饲料中往往缺乏调节因子，易形成断奶综合症，如仔猪腹泻、生长缓慢等。 ,,,,,, ，,等【,,】发现出生,天的仔猪，每天饲喂,次芽孢杆菌或者乳酸杆菌，饲喂一个月，可以显著增加血液中免疫球蛋白的浓度，提高嗜中性粒细胞中过氧化物酶的活性及血清的杀菌力;粪中双歧杆菌和乳酸杆菌的数量增加，从而提高了仔猪的健康水平。,(,本研究的目的和意义 目前，有关微生态制剂对动物,细胞免疫和肠道黏膜免疫的研究，微生态制剂的选择主要是肠道原籍菌，而外籍菌国内外没有报道;通过流式细胞仪研究微生态制剂对动物,细胞免疫的影响，使用的是单色单标记或双标抗体，国内外没有三色荧光标记的报道;双抗夹心,,，,,法研究微生态制剂对仔猪肠道黏膜免疫的影响，一般选择肠黏液、肠黏膜和肠道内容物，本研究选择新鲜粪样国内也是首例。有鉴于此，本课通过流式技术和双抗夹心,,，,,方法研究枯草芽孢杆菌和约氏乳杆菌对仔猪,细胞免疫和肠道黏膜免疫的影响，从而全面、系统地揭示外籍菌和原籍菌对仔猪,细胞免疫和肠道黏膜免疫的影响，为微生态制剂的研究和开发提供理论依据;三色荧光标记对,,,进行限定，使得试验结果更加准确，从而对实践有更好的指导意义;双抗夹心,,，,,法增加了试验结果的准确性，采集仔猪新鲜粪样，降低了试验成本。, ,试验材料与方法 ,(,试验材料 ,(,(,试验动物 刚出生的杜×长×大健康仔猪,,头，日龄相差不超过,天，成都蓉都养殖有限 公司提供。 ,(,(,试验日粮 采用玉米一豆粕基础日粮，基础日粮参,硬，,,,,,,,)猪营养需要，基础日粮 配方见表,。 表,基础日粮组成及营养水平 ～兰～～:～竺竺翌～～兰竺竺坚～:～:坐坐:堡～～些堕型虫竺 原料名称 含量(,) 营养水平 ,,, .