【doc】大鼠脊髓后角浅层初级伟入C纤维内μ阿片受体的免疫组织化学？…

【doc】大鼠脊髓后角浅层初级伟入C纤维内μ阿片受体的免疫组织化学？… 大鼠脊髓后角浅层初级伟入C纤维内μ阿片 受体的免疫组织化学,… 1999年7月 娲1解剖 ACTAANAToMICAS1N1CA Vo】.3O,No.3 Ju】.1999 ,0丫,r.一一; : 大鼠脊髓后浅层初级传人C纤维内u阿片受体 的免疫组织化学定位——光镜与电镜研究 V 丝三二』面.张亦农杨世明李肇春 (同济医科大学组织学旺胎学教研室,武汉430030)RlIl 【摘要】目的在光镜及电镜下观察大鼠脊髓后角内阿片受体(MOR)与C纤维的关系,为进一步揭示阿 片镇痛的突触机制提供形态学证据.根据辣椒素对初级传入神经中C纤维的特异性神经毒性.在大鼠蛛 网膜下腔注射辣椒素以毁损c纤维.用免疫组织化学ABC法比较脊髓后角内MOR免疫反应性的变化;根据西非 单叶豆同工凝集素I-B4(griEoniasimplicifollaisolectin1B4,I-B4)与初级传人c纤维选择性结合的特性,应用双标 (免疫)组织化学电镜技术(ABC一纳金法)分别标记脊髓后角内IB4结台位氨和MOR结果大鼠蛛阿膜下腔注 射辣般素3,7d后,其脊髓后角I,I层内的MOR免疫反应性较对照动物明显减弱;电镜下在夫鼠脊髓后角浅层 内观察到,MOR不仅定位于讨突内,也分布在含1一B4结合位点的C纤维终末内.无论在讨窘内还是在轴突终末内. MOR主要分布在非突触部位,仅少量MOR与突触前膜和/或突触后膜有关.结论脊髓后角中部分MOR来源 于辣般索敏感的c纤维,外源性吗啡或内源性吗啡样物质如内吗啡肽等MOR激动剂在脊髓后角内既可通过突触 后(树突内)的MOR发挥作用,也可通过突触前(轴突终末内)的MOR对C纤维产生突触前抑制敏应,而且在此过 程中,M0R激动剂在非突触部位的作用可能是主要的; I关键词】照兰墨垡越童.}单叶豆同工凝集素三.兰垡韧级传入堂堕量旦.免疫电镜1,? /;喃 IMMUN0HIST0CHEMICALLOCALIZATIONOFuOPIOIDRECEPTO R INPRIMARYAFFERENTCFIBERWITHINTHESUPERFICIAL LAYERS0FTHERATSPINALD0RSALH0RN —— ALIGHTANDELECTR0NMICROCOPICSTUDY LiHetWangXiaoli,ZhangYinong,YiangShiming,LiZhaochun (DepartmentHA~ologyandEmbr~logy,TaongjiMedicalUm~rsity,Bruhan) [Abstract]ObjectiveToprovidemorphologicalevidencesforfurtherrevealingsynapticmechanismofopiold analgesia,therelationofopioidreceptor(MOR)toprimaryafferentCfiberinthespinaldorsalhornoftheratwas lightandelectron—microscopicallyobserved.MethodsAccordingtothespecificneurotoxicltyofcapsaicintoCfiber, capsaicinwasinjectedsubarachn0da】 lyintheratandthechangeofMORimmunoreacfivitywasdetectedintherat spinaldorsalhornbyusingimmunohistochemistry(ABCmethod);Basedupontheseectvtyofisoleetin1-B4from griffoniasimplicifliabindingtoCfiber.theI-B4bindingsitesandMORinthespinaldorsalhornweredoublelabeled (immunohistochemica])histochemiealelectronmicroscopy(ABCNanogoldmethod).ResultsDuring3,7daysafter subarachnoida]injetionofcapsaieinttheMORimmunorecativityinthelaminae】,lofthespinaldorsalhornofthe rattreatedwitheapsaiclnwasmarkedlydecreasedascomparedwiththatoftheeontrolrat.Undere】ectronmicro— scope,itwasobservedthatinthesuperficiallayersofthespinalcord,MORwasdistributedinsomeaxona]terminals includingtheterminalsofCfiberscontainingI-B4bindingsitesaswellasinthedendritesInboththedendritesand theaxona[terminals—MORsweremaogy,Toa8liMedicalUniversity,Wuha n蚰0030,China 解剖3O卷.3期 originatesfromtheprimaryafIerentCfibersandmorphineOrendogenousmorphine—likesubstancessuchasendo morphinmayactnotonlyonpostsynaptieMORinthedendritesbutalsoOnpresynaptJcMORintheaxonalterminal ofClibertOinhibittheinputofCfiber,andintheseprocesses,thenonsynapficactionofMORagonistsislikelyes— sentia1_ [Keywords]Opioidreceptor}Capsaicin;Griffoniasimplieifliaisolectin}Cfiber;Primaryafferent}Spinaldot— saJhorn;]mmunoelectronmicroscope 阿片物质可在脊髓后角产生明显的镇痛效应, 这一作用既与对脊髓后角第二级痛觉神经元的突触 后抑制有关],也可能涉及到对传递痛觉的初级传 入神经元的突触前抑制.一些功能实验表明,阿片 物质能抑制初级传入神经元释放P物质],但由于 实验技术的限制,目前尚无令人信服的形态学资料 能阿片物质以突触前抑制方式抑制传人痛党的 初级传入C纤维释放P物质等痛觉递质或调质的 结构基础.阿片物质通过相应的受体实现其生理作 用.在哺乳动物神经系统,包括脊髓后角,至少存在 ,8和K3种阿片受体],其中阿片受体(MOR)在 脊髓后角介导吗啡及内源性阿片物质的镇痛作用中 尤其重要口].有资料表明,初级传入神经元可表达 MOR,脊髓后角内的一些轴突终末也呈MOR 免疫反应阳性],但这些轴突终末是否属于初级传 入纤维及初级传入神经中与痛觉传入有关的c纤 维是否也含有MOR还不能肯定因此,本实验根据 辣椒素对初级传人C纤维的特异性神经毒性CsJ和西 非单叶豆(griffoniasimplicifolia)同工凝集素I—B4 (I—B4)与C纤维选择性结合的特性0],应用免疫组 织化学光镜,电镜技术,观察大鼠脊髓后角浅层内 MOR免疫反应性与C纤维间的关系. 材料和方法 雄性Wistar大鼠l4只,体重2..,25Og其中10 只用于辣椒素毁损实验,另4只用于电镜实验.在辣 椒素毁损实验中,将1o只大鼠随机分成5对,以腹腔 注射苯巴比妥钠(40mg/kg体重)麻醉后按Yaksh 和RudyDo]的方法行蛛网膜下腔瘘管埋植术,瘘管 从小脑延髓池处插入,下端达脊髓腰膨大上缘(插入 约7cm).每对大鼠中,】只经瘘管缓慢注入0.25%辣 椒素(溶于含jO二甲基亚砜的消毒等渗液l_—— 溶媒中)25(辣椒素注射组),另1只注射溶媒25 作为对照组手术后动物存活3d或7d.3d或7d后, 大鼠在深麻醉(按100mg/kg体重腹腔注射苯巴比 妥钠)下,用含4多聚甲醛和1苦味酸的 0.1mol/L磷酸缓冲液(PB,pH7.3)灌注固定,取L2 ,4段脊髓,用上述固定液后固定4h,25蔗糖过 夜.第2d进行恒玲箱切片,片厚30.um.切片时,将每 一 对脊髓置于同一载物台上同步切片,以保证同一 对脊髓的各对切片厚度相同切片在细胞培养板中 以飘浮法行MOR免疫组织化学反应(ABC法).每 对动物同步切下的切片始终处于同等条件下反应. 用于电镜观察的大鼠在深麻醉下,经左心室用 古4多聚甲醛,0.75苦味酸和0.075戊二醛的 PB灌注固定灌注结束后立即取L2,4段脊髓,用 不含戊二醛的上述固定液后固定4,6h,继而以 0.o1mol/L磷酸盐缓冲液(PBS;pH7.3)漂洗1,2h 后进行振动切片(片厚5O,70um).切片经防冰晶 处理(切片在含l5甘油,2O庶糖的PBS中振摇 沉底)后.以液氮速冻0.5,1min,并以PBS迅速回 温接着对切片进行包埋前电镜单标或双标染 色口:(1)I—B4单标染色:2mg/L生物素化的I—B4 (BsI一134,Sigma)4?下孵育40~45h,ABC复合物(】 :i00)室温孵育2h,含0.03DAB和0.003H2O 的Tris—HCI缓冲液(TB,pH7.6)呈色15,20min; (2)I—B4与MOR双标染色:2mg/L生物素化的I— B4与0.4mg/L的豚鼠抗MORc末端多肽抗体的 混合物4?下孵育40,45h;ABc复合物(1:lOO)与 纳金标记的羊抗豚鼠IgGFab’片段(1:100,15O, Nanoprobes)的混合物室温孵育2h,银加强液(HQ silver,Nanoprobes)室温反应5,10raini含 0.03DAB和0.003H2O2的TB呈色15,2O rain在上述单标及双标染色中,IB,各种抗体和 AB复合物等试剂均以含3牛血清白蛋白的PBS 稀释标记反应结束后,在第?层中最强,第 1层中呈中等强度(图1).在高倍镜下可见少数 MOR阳性胞体存在于第1层中,但在第1层中未 见阳性胞体.在辣椒素注射组,在大鼠蛛网膜下腔注 射辣椒素后第3d天,脊髓后角I,?层内的MOR 免疫反应性即已减弱,在第7d减弱更明显(图2),但 分布均无变化. 2.MOR免疫反应性的超微结构定位 在I—B4单标切片中,电镜下可见脊髓后角浅层 内一些轴突终末被标记,反应产物弥散性分布在阳 性轴突终末内的囊泡膜上,使囊泡膜的电子密度明 显增高(图3).在双标切片上,代表MOR的阳性标 记信号呈大小不一,电子密度很高的颗粒(银加强后 的纳金?银颗粒),其形状多为圆形.颗粒较大者形状 稍不规则(图4,6).MOR既存在于一些树突内,也 定位在一些轴突及其终末内(包括部分呈I-B4结合 反应阳性的轴突终末)(图4,6).在树突中,MOR 多定位于树突膜上,少数可见于树突胞质中(图4, 6).在树突膜上的颗粒除少数与突触后膜有关(图4) 外,多数定位在非突触膜上(图4,6).MOR免疫反 应性在I—B4阳性和I-B4阴性的轴突或轴突终末上 的定位基本一致在IB4阳性轴突终末中,M0R既 存在于轴膜上也存在于终末胞质内(图4,6).在胞 质中的MOR多与突触小泡有关,而分布在轴膜上 的MOR除极少数存在于突触前膜上外,绝大多数 位于突触前膜以外部位(图4,6). 讨论 阿片受体是一组(蛋白偶联受体,至少包括, 和3个亚型一,其中亚型(MOR)与外源性阿片 类物质一吗啡或其内源性配基?内吗啡肽具有极高的 亲合力”..随着MOR分子克隆和相应抗体制备 的成功,使MOR的原位杂交和免疫组织化学研究 成为可能.原位杂交研究显示,部分脊神经节细胞 (包括小细胞)可表达MOR一;免疫组织化学研究 则观察到一些中小型脊神经节细胞呈MOR阳性免 疫反应口;脊神经后根切断后,后角浅层MOR免疫 反应性明显减弱【l.由此表明初级感觉神经元含 MOR,后角浅层内部分MOR来自初级感觉神经 元.辣椒索是一种对传人痛觉的小神经节细胞具有 特异性毒性的神经毒剂一,蛛阿膜下腔注射辣椒素 可导致来自初级传入神经元的c纤维变性】5l,因 而辣椒索是选择性研究c纤维的一种有用的工具 药.在本研究中,当蛛网膜下腔注射辣椒素后,脊髓 后角I,1层内的MOR免疫反应性因C纤维变性 而明显减弱,表明脊髓后角内的MOR有相当一部 分系来自小的初级传入神经元,并定位在终止于后 角浅层的c纤维中枢突中. 已有免疫电镜观察发现在脊髓后角浅层内有轴 突终末含MOR,但这些含MOR的轴突终末是否为 初级传人C纤维的终末则未加以鉴定”].griffonia simplicifolia的同工凝集素IB4能与小的初级传入 神经元上的D半乳糖残基选择性结合.在脊髓后角 中能鉴别包括P物质能纤维在内的无髓初级传人 纤维即C纤维],I—B4与D一半乳糖残基的结合反应 是c纤维上的一种特异性组织化学标记0’].在本 实验的双标电镜研究部分.我们观察到在脊髓后角 浅层,部分呈I?B4结合反应阳性的轴突终末含有 MOR免疫反应性.这一结果进一步证明了MOR存 在于包括C纤维在内的初级传人纤维终末中.为 MOR激动剂能对C纤维的传人或其中递质的释放 进行突触前抑制的观点提供了直接的形态学证据. 后根切断术后.脊髓后角内仍保留一定强度的 MOR免疫反应性;含脑啡肽的轴突终末与脊髓 后角神经元的树突问存在轴树突触..;阿片受体激 动剂可抑制离子电泳导入的P物质,兴奋性氨基酸 对后角神经元的兴奋作用’].这些资料均提示阿片 受体存在于后角神经元的树突或胞体上,Cheng 等口的报道和本研究观察到的MOR在脊髓后角中 的一些树突上的定位则进一步证明了这一点. 无论是在轴突终末中,还是在树突中,MOR极 少定位于突触处(前膜或后膜).而主要定位于非突 触部位.在孤束核等处,MOR的超微结构定位也 是如此.我们以前曾在以辣椒素导致C纤维变性的 大鼠脊髓后角内观察到,含脑啡肽的轴突终末与C 纤维的变性终末间极少形成典型的轴轴突触,而非 突触性的轴轴接触则相对较多.因此,吗啡或内 源性吗啡样物质的非突触释放和弥散及在非突触部 位通过MOR发挥作用可能更为重要. 收稿199804修回1998—10 本文圉1,6.插图第1页 ?l96?解剖学摄30卷.3期 图睡说明 圈1对照组太鼠脊髓后有i,I层内的MOR免疫匣应性 图2辣椒翥处理组脊髓后角【,I层内MOR免疫反应性较对照 组明显减弱 图3脊髓后角浅层内一1一阱标记的轴突终末(A1)和一非I—B4标记 的轴突终末(A2)与同一树突(D1)形成非对称性轴一树突齄r Al还与另一树寰(D2)形成非对称性轴一树突触三有示特化的 突触后膜 图4脊髓后角浅层内一轴突整末(A)与3个树突(D1,D3)分别彤 成轴树突触.在DI,D2中可见代表MOR免疫反应性的纳盘一 银颗粒主要分布在树突的非突齄部位.D1中还可见蚋金一银颗 粒位于突齄后鹿(箭头) 图5脊髓后角浅层内1一B4与MOR职标轴突终来(A)rMOR免疫 反应性(纳金一银囊粒)定位于安齄前膜(大三有),非寞触部位 的轴膜(小三角)厦轴质中.并见一纳金一银颗粒定位于树突的 突触后膜上(箭头) 图g脊髓后角浅层中一古MOR的1一B4阳性轴突终末(A),一 MOR阳性树突(D1)与3十MOR阴性树突(D2,D4).纳盘一银 囊粒标记的MOR在轴突终来和树突中均定位于非窦触部位. 三角示特化的突触后膜.标尺:图1.2中为800mr图3,6中为 0-5? Expanationoffigures F.1MOR[mmunoreactivitynthelaminae1一Iofthespinal dorsalhornofcontrolrat. Fig2MORimmunoreaetivitydecreasesmarkediyinthelami~e 【一IofthespinaldorsalhornoftherBttreatedwithcap— saicln,aBcomparedwiththatofcontrolrat. Fig.3AnIB4一positiveaxometerminal(AI)andanI-B4一negative axonalterminal(A2)inthesuerficiallayersofthespinal dorsalhornformasymmertlcaxodendrificsynapseswitha 8allledendrite(D1)andA1synapsesasymmetricallywith anotherdendrite(D2).Trigo啮pointtothespecializedpost— synaptieilfftel2xbr~ine$. Fig.4Anaxona]terminal(A)formedaxodendritiesynaps~with3 dendrites(D1,D3)}respectively,inthesuperficiallayersof thespihaldorsalhon.InD1andD2,MORimmunoreae- silverparticlesafemainlydl tivitiesindicatedbynanogold— tributedinthenonsynaptiemembranes,butinD1,a nmangold-silverparticlepointedthanarf.wislocatedon postsynaptiemembrane. Fig.6Anaxonalterminal(A)double—labelledwithI-B4andMOR inthesuperficiallayersofthespinaldorsalhorninwhich MORimmunoreaetivitiesindicatedbynanogoldsilverparti— clesarelocalizedoDpresynapti~membraneflargetrigon),oD axonaimembraneofnomyttapticpotion(s口11tfigun)arm inaxoplas~Onenanogold—silverparticleisalsoseentobe Iocal/xed.力thepo*tsynaptiemembrane(arrow). Fig.8An1B4postiveaxonicterminal(A)containingMORanda MOR—positivedendrites(DI)armthreeMOR—negativeden— drites(D2一D4)inthesuperficiallayersofthespinaldorsal horn.MORlabeledbynanogu]dsilverparticlesarenonsy napdeallylocahzedinbothaxonalterminalanddendrites. Trigonpointstothespecializedpostsynaptiernembrane Scalebar,200儿】ninFig.1and2,0-6txminFig36. 参考文献 [1]YoshimuraM.NorthRA.Substantiagelatinosabehooveshyper polarizedinvitrobyenkephailn.Nature}1989.305(5934):629 [2]MacDonaldRL}NelsonPGSpecificopiate—induceddepressionof transmitterreleasef.rmdorsalrootganglioncellsincultufe-Sci— ence.1978,199(4驺6):1449 [3]JesseilTM,lversenLL.OpiateanalgesicsinhibitsubstancePre leasefromrattrigemina]nucleus.Nature,1977,268(5620)549 [4]Minam[M,BatchM.Molecularbiologyoftheopioidreceptors; structfuntionsanddistrlbutinDsNeurosciRes,1996,23(1) 121 [5]ChengPYtMoriwakiA.WangJB.eta1.Ultrastructura1]ocaliza— tiDnofopioidreceptorsinthesuperficiallayersoftheratcervi colspinalcord:extrasynapticlocalizationandproxEmit~oLeu一 enkephalinBrainRes,l996,731(1);141 [6]MansourA}FoxCA}BurkeS,etai.Mutdelta}andkappaopioid receptormRNAexpressionintheratCNS:Aninsltuhybridiza— tionstudy.JCompNeurolt1694,360(3):412 [7]DingYQ}KanekoT}.X~omuraS}etallmmunohistochemica[】. cali~tionofg~opioidreceptorsinthecentralne~voHssystemof therat.JCompNeurol,1998,367(3)375 [8]FitzgeraldM.CapsaicEnarmsensory…mAreview.Pain} 1983.16(1):106 [~]StreitW】,SehulteBA,BalentEneJDtetalEvidenceforglyeoeon一 1ugateinnociceptiveprimarysensoryneur0nsanditsoriginfrom theGoig[complex.BrainRes,1986,377(1);1 [10]yakahTL,RudyTA.Chroniccatheterizationofthespinalsub— suherachnoidspace.PhysiolBehav}1976t17(3):1031 [113BpampinatoS.RomualdP,CandalettiS,etalDistinguishable effectsofintrathecaldynorphins,somatostatin,neurotensinand s-calcitoninont1.ciceptionandmotorfunctionintherat.Pain, 1988,35(1)95 [1Z]Ed~丽,李宏莲,杨世民,等.P物质与Griffoniasimplicifolia1 B4结合位点在太鼠一级传入神经元内井存神经解剖学杂志, 1698,14(3):(印刷中) [13]韩济生,万有.”内吗啡肚的发现是阿片肽研究的一次突破.生 理科学进展,1997t28(3):237 [14]DingYQ,NomuraS,KanekoT,etai.Cc~locabzationofopi— oldreceptor—likeandsubstanceP—1Lke te~finaiswithinthesuperficia1]aynrsofthemedullaryarmspinal dorsalhorDoftherat.NeuroscienceLett,1995,198(1):45 [15]李和,水野升大鼠脊髓后角内甲啡肚标记与非标记结构与c 奸维间关系的免疫电镱研究.神羟枰剖学杂志.1996,12(4)401 ~lg]ChengPY,LinChenLY,ChenC,eta1.1mmunolabe[ingofo— pioidreceptorsLntheratnucleusofthesohtaryt~actextrasynaW ticplasmalemmallocalizationandassociationwithleu enkephehn.JCompNeurol,1996,371(4):522