冰冻解冻去甘油红细胞中甘油残留量

冰冻解冻去甘油红细胞中甘油残留量 高碘酸钠法检测冰冻解冻去甘油红细胞中甘油残留量 杨夏 关键词:高碘酸钠;冰冻红细胞;甘油 为了延长红细胞的保存期，国内外普遍采用甘油作为保护剂对红细胞进行深[1]低温冰冻保存，此项技术有效缓解了临床稀有血型紧急用血状况，对采供血机构调剂血液库存储备以应对血液偏型或突发事件所导致的“血荒”也起到了一定作用。需要注意的是:甘油具有保水作用，其意外进入人体会导致机体血容量增加，引起患者不适，在患者有妊娠、高血压等自身血容量比较高的情况下，不良症状会加重，严重者甚至有生命危险。在使用冰冻解冻红细胞之前，必需经过洗[2]涤去除甘油保护剂，要控制洗后红细胞中甘油残留量?10g/L作为底线，消除甘油对人体产生的不良作用，保证输注后的红细胞能够正常发挥生理功能。我站已在2009年将冰冻解冻去甘油红细胞中甘油残留量的监测作为质量控制的常规工作，开展此项检测工作中我们遇到过一些问，并对问题进行了探讨，现将我站的检测方法和经验介绍如下: 1材料与方法 2009,2011年本站制备的冰冻解冻去甘油红细胞血液。 1.1样品来源 1.2试剂与仪器 甘油(天津市百世化工有限公司)，钨酸钠(天津市河东区红岩试剂厂)，HSO(四川西陇化工厂)，高碘酸钠(天津市博迪化工有限公司)，乙二24 天津基准化学试剂有限公司)，氢氧化钠(天津市大茂化学试剂厂)，邻苯二甲醇( 酸氢钾(纯度为:99.8%，天津市光复精细化工研究所)，天平(精密到0.0001g，德国赛多利斯)。 1.3甘油标准溶液的配制 精密称取甘油10.1 g(纯度为99%) ，置于100 ml的容量瓶中, 用生理盐水溶解并稀释至刻度, 配成100 g/L 的储备液。分别取储备液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0ml置于100 ml的容量瓶中, 用生理盐水稀释至刻度, 制成含甘油2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0g/L的甘油标准溶液。 1.4 甘油含量测定 1.4.1 制备血滤液 准确吸取混匀后冰冻解冻去甘油红细胞5、7.5、10、15ml，依照表1所示加入相应量的蒸馏水，混匀，静置3,5分钟，再加入相应量的16.5%钨酸钠及1N HSO，充分混匀，用定性滤纸过滤制备得到血滤液。 24 1.4.2 甘油残留量的测定 精密吸取血滤液10ml，加入2.14%高碘酸钠溶液50 m l，摇匀，暗处放置15 m in后，加50%乙二醇溶液10m l，摇匀，暗处放置20m in，加酚酞指示剂0.5m l，用氢氧化钠(0.1mol/L)滴定至红色，30秒内不褪色，滴定结果用空白试验校正。每1ml氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)相当于9.21mg[3]的甘油。根据消耗氢氧化钠溶液的毫升数，依照下列公式计算样品甘油含量。 滴定NaOH浓度 V 甘油含量(g/ml)= NaOHml数(样品,空白)X0.00921X ?血滤液ml数× 0.1 S 注意:以上所用氢氧化钠(0.1mol/L)滴定液使用前要进行浓度标定，标定步骤为:取在105?干燥至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾0.6g，精密称定，加新沸过的冷水(避免水中的C02对标定的影响)50ml振摇，使其尽量溶解;加酚酞指示液2滴，用本液滴定;在接近终点时应使邻苯二甲酸氢钾完全溶解，滴定至溶液 显粉红色。每1ml的氢氧化钠滴定液(0.1mol,L)相当于20.42mg的邻苯二甲[3]酸氢钾。依照下列公式计算滴定液浓度: 滴定NaOH浓度=邻苯二甲酸氢钾称取量X邻苯二甲酸氢钾纯度X0.1/(滴定ml数X0.02042) 2结果 2.1 对同一份冰冻解冻去甘油红细胞血液，分别取不同量(5ml、7.5ml、10ml、15ml)样品制备血滤液测定甘油含量，各取样量平行做5次，应用SPSS 13.0统计软件，做t检验，结果:7.5ml、10ml取样量与15ml取样量测定结果比较，P值,0.05，分别为0.3281、0.6785，结果无显著性差异，5ml取样量P值为0.000，有显著性差异。结果见表1。 表1 不同取样量制备血滤液检测甘油含量结果比较 试剂 ml(n=5) ml(n=5) ml(n=5) ml(n=5) 测定样品(S) 15 10 7.5 5 水 75 50 37.5 25 16.5% NaWO 6 4 3 2 24 1N HSO 7.5 5 3.75 2.5 24 总体积(V) 103.5 69 51.75 34.5 —9.766?0.0403 9.776?0.0334 9.791?0.028 9.0308?0.0654* 测量值(X?s)g/L 注:与15ml取样量比较，*P,0.05，有显著性差异 2.2 线性试验和回收率计算 用本法测定1.3配制的甘油标准液，将甘油浓度与滴定液消耗量进行线性回归，相关系数为0.9999，相关度高。在甘油含量测定为4.38 g/L的同一样品中按照甘油标准液浓度梯度加入不同量的甘油进行测定，计算回收率，见表2。 表2 回收试验结果(n=12) 甘油浓度(g/L) 回收率(%) RSD(%) 编号 理论值 测定值X 1 2 1.961 98.05 2.04 2 4 3.97 99.25 1.29 3 6 5.988 99.8 1.43 4 8 7.901 98.76 2.12 5 10 9.974 99.74 1.41 6 12 11.943 99.52 1.52 7 4.38+2=6.38 6.35 99.53 1.52 8 4.38+4=8.38 8.4 100.24 1.97 9 4.38+6=10.38 10.2 98.27 2.02 10 4.38+8=12.38 12.13 97.98 2.78 11 4.38+10=14.38 13.9 96.66 3.02 12 4.38+12=16.38 15.82 96.58 3.07 2.3 重复性试验 分别测定2份样品10次，计算CV值分别为2.8%和3.2%。 2.4 样品测定 采用本法检测10份本站冰冻解冻去甘油红细胞血液甘油残留量为:5.93、7.2、6.82、4.38、8.76、6.38、9.79、8.97、10.15、7.65 g/L。 3 讨论 [4]目前，检测甘油含量的方法主要有化学法、酶法和色谱法。酶法，专一性强，只与溶液中的甘油特异性反应，但需要购买试剂，市售一般无小包装试剂，一套试剂购买下来往往达千元以上，而冰冻红细胞血液作为血源调剂部分，用量[5]少，质量监测频率低，购买试剂往往会造成失效浪费。色谱法，精确度高，检 准确性较高，所测成本高，需要配备昂贵的设备。传统的检测方法为化学法，其需化学试剂可长期保存，随用随配，操作简单，较适用于血站工作。常用的化学法有两种:高碘酸钠法和高碘酸法。高碘酸法需要使用亚砷酸钠(砒霜化合物)，是一种剧毒物质，有危险性，目前此种方法已较少使用。 [6]国内文献报道的高碘酸钠法，我们在实际应用检测中发现，其用溴甲酚紫作为指示剂判定终点, 由橙色滴定至兰色的过程,临界点颜色变化模糊，肉眼难以判定终点，判定的重复性差;试验所用的14%高碘酸钠配制复杂，需要加入浓硫酸以帮助溶解，操作危险性大。我们采用《中华人民共和国药典》2010年版(二[3]部)甘油含量测定中使用易配制的低浓度2.14%高碘酸钠溶液检测,改用酚酞作 为无色变为红色, 临界点变化瞬间转换，颜色鲜明，易为指示剂，滴定反应终点 判定。应用此方法测定甘油含量，检测甘油含量与滴定液消耗量显著正相关，检测回收率在96%,100%，平均为98.7%，检测CV值?3.2%，检测我站10份冰冻 甘油残留量结果为4.38,10.15g/L之间。 解冻去甘油红细胞制品 国内有文献报道:将解冻红细胞洗涤后进行离心，直接检测上清液测定甘油残留量。我们认为:不可取。因为，在解冻红细胞洗涤后的一段时间内，红细胞[7]内仍存有部分甘油。检测前要先使红细胞内的甘油释放，并去除红细胞碎片和蛋白对检测的干扰，即制备血滤液之后再做检测才能得到准确结果。2012年版[8]《血站技术》(以下简称《规程》)血液质量控制检查方法做了明确规定:分析测定甘油含量之前要先制备血滤液。对于《规程》中要求制备血滤液需要血液样品15ml，笔者认为需要商榷，如果计算冰冻解冻去甘油红细胞其他质量监测项目及样品损耗量合计至少需要留取血样18ml，众所周知，血站1U冰冻解冻去甘油红细胞制品容量一般为180ml左右，血液容量本身较少，留样18ml[2]后的血液制品质量处于国家容量标准边缘(标识量?10%)，若如控制不好，势必会造成血液容量不合格而被判定为不合格品。虽然部分血站用Rh阳性血液做模拟制备用于质量监测，但这种替代方式代表性差，更不能做到随机化抽样，且此血液的制备仅用于质量监测，会造成血液资源、人力、物料的浪费，得不偿失。为此，我们设计实验:用留样量分别为5ml、7.5ml、10ml、15ml血液样品制备血滤液测定甘油含量，实验证明:10ml取样量与15ml取样量检测结果在统计学上无显著性差异，5ml取样量与15ml取样量检测结果比较偏差较大。分析原因可能为:该实验本身是微量检测试验，样品取量少会导致样品的代表性差，检测灵敏度下降所致。本实验证实:选择10ml作为留样标准，可以避免以上矛盾。 此外，在制备冰冻红细胞的过程中，按比例加入的甘油浓度会影响冻存效果和终产品中的甘油残留量。复方甘油制剂是血站的关键物料之一，为了保证血液质量，除监测血液制品中甘油残留量之外，血站质管部门还应在进货验证中监测复方甘油制剂的甘油含量。我们建议依照以下做监测:复方甘油制剂甘油标 识量为570g/L，精密量取制剂10ml，加生理盐水定容至100ml，充分混匀后精密吸取10ml，用1.4.2方法测定。依据下列公式计算,评价实际测量甘油含量与标识量是否一致。 滴定NaOH浓度 甘油含量(g/ml)= NaOHml数(样品,空白)X0.00921X ?样品ml数X10 0.1 综上所述，通过我们建立的甘油含量检测方法，可以达到操作简单、准确监控冰冻解冻去甘油红细胞中甘油残留量的目的，此监测流程更符合血站实际工作需要，值得推广并做进一步探讨、规范。 参考文献 [1] 王培华主编.输血技术学[M].第2 版.北京:人民卫生出版社,1998:62-67. [2] 中华人民共和国质量监督检验检疫总局.全血及成分血质量要求(GB 18469-2001)[S].北京:中国标准出版社,2001:7-8. [3] 中华人民共和国药典.中国医药科技出版社,2010,2部. [4] 刘春燕,张孝山,李浩泷,等.丙酮酸激酶法检测冰冻红细胞解冻后残留甘油 天津医药,2007,35(10):794-795. 含量研究. [5] 黄海涛,杨力佳,丁中涛,等.高效液相色谱法测定果酒中的糖、甘油和乙醇.云南大学学报,2002,24(5):375-377. ,徐蓓,邱颖婕,等.冰冻红细胞中甘油残留量不同测定方法的比较.中[6] 林俊杰 国输血杂志,2002,15(5): [7] 陈均,杨通汉,王云华等.冰冻红细胞解冻后残留甘油含量测定方法初探.中国输血杂志,2004,2(17):97-98. [8] 卫医发[2012]1号,血站技术操作规程[S].北京:中华人民共和国卫生部,2012.