热处理对乳铁蛋白理化特性及促成骨细胞增殖活性与影响论文

热处理对乳铁蛋白理化特性及促成骨细胞增殖活性与影响论文 烟台大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明: 所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工 作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体 已经发或撰写过的作品或成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已 在文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 论文作者签名: 日期: 年 月 日 学位论文使用授权说明 本人完全了解烟台大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即: 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本; 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务; 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文; 在非保密的论文范围内，学校可以公布论文的部分或全部内容。 (保密论文在解密后遵守此规定) 导师签名: 论文作者签名: 日期: 年 月 日 摘 要 乳铁蛋白是人乳中重要的蛋白质，占人乳中总蛋白量的 20%左右，但它并不是 人乳的特有成分，其广泛的存在于哺乳动物的乳汁和体液中，是一种多功能性的碱 性蛋白。随着乳铁蛋白独特功能性揭示，人们越来越关注在功能性食品中乳铁蛋白 的添加，婴儿配方奶粉就是乳铁蛋白的主要添加对象。但在婴儿乳粉的生产中，天 然牛乳需要经过多个热处理过程，因此牛乳铁蛋白的活性必将不同程度的受到影响， 这点是被大多数人所忽略的。大量资料显示，乳铁蛋白对热极敏感，且易发生热聚 集现象，本研究旨在加工过程中的必须热处理环节对牛乳铁蛋白理化性质，蛋白热 聚集的影响做了初步探索，并考察其在热处理后对成骨细胞促增殖活性的影响，以 便为乳粉的加工过程，特别是功能性乳粉的加工提供有效的温度控制工艺参数。 本实验选取粗提纯的天然牛乳铁蛋白进行再次分离纯化，纯度达到 90%，与 Sigma 公司乳铁蛋白标品相当。通过 SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳观察蛋白分子 量，用 Quantity One 软件进行蛋白条带的分析，得到纯度为 90%的乳铁蛋白样品， 其纯度与购于 Sigma 公司的 90%纯度乳铁蛋白标品相当。随后，将纯化后的乳铁蛋 白制备成铁饱和型乳铁蛋白(Holo-Lf)和完全缺铁型乳铁蛋白(Apo- Lf)，冷冻干燥， 备用。将三种不同铁饱和度的乳铁蛋白粉配制成相同浓度的蛋白溶液，确定三种蛋 白各自的铁饱和度。制得样品的铁饱和度依次为:常态乳铁蛋白铁饱和度为 15.32%， 铁饱和型乳铁蛋白的铁饱和度为 89.10%，缺铁型乳铁蛋白的铁饱和度为 3.73%。运 用示差扫描量热仪(DSC)，测定三种不同铁饱和度乳铁蛋白的热诱变峰值，为热处 理温度提供依据。通过示差扫描量热仪检测结果为，常态乳铁蛋白(Native- Lf)有 两个热诱变峰值，分别为 62.66?和 69.83?，缺铁型乳铁蛋白(Apo-Lf)的热诱变 峰值为 62.10?，而铁饱和型乳铁蛋白(Holo-Lf)的热诱变峰值为 70.18?，因此， 选取加热条件为 60?、65?、70?、80?、90?，水浴 5min。在此热处理后，通过 酶标仪测定加热后三种不同结合态乳铁蛋白的铁饱和度情况，与未加热前的数值进 行对比，考察热处理对乳铁蛋白铁饱和度的影响。实验结果显示，铁饱和型乳铁蛋 白受热后铁饱和度基本无变化，80?加热 5min 条件下，常态乳铁蛋白呈现失铁现象， i 缺铁型乳铁蛋白在 80?加热条件下铁饱和度降低也较为明显。通过 SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳观察加热后三种乳铁蛋白的分子量变化情况，通过软件分析， 确定热处理后蛋白质是否发生热聚集或热分解。同时，将热处理后的三种蛋白样品 5000g 离心处理 10min，提取上清液，通过酶标仪测定吸光度，与曲线结合，确 定热处理后蛋白浓度的变化。将此结果与电泳结果相结合考察蛋白质热聚集现象。 研究发现，常态乳铁蛋白在加热温度为 70?时开始发生热聚集现象，并且蛋白含量 开始降低。铁饱和型乳铁蛋白在加热温度为 90?时发生轻微热聚集现象。缺铁型乳 铁蛋白在加热温度为 70?时发生热聚集现象，且比常态乳铁蛋白现象明显，蛋白含 量也最低。 本实验成功分离及鉴定了新生 Wistar 大鼠头盖骨处的成骨细胞，并进行传代培 养。将热处理后的三种不同铁饱和度的乳铁蛋白分别与成骨细胞作用 48h，用四唑盐 比色法(MTT)检测增殖情况后发现，常态乳铁蛋白加热到 70?时活性下降，铁饱 和型乳铁蛋白加热温度为 80?时活性开始下降。缺铁型乳铁蛋白在加热温度为 70? 时，活性恢复. 时活性显著下降，但加热温度为 90? 关键词:乳铁蛋白，热稳定性，铁饱和度，热聚集，成骨细胞 ii Abstract Lactoferrin is one of the four proteins in human milk, accounting for about 20% of the total protein in it, but it is not milk-specific components, which are widely present in the milk and body fluids of mammals and is a multifunctional basic protein. But the production of infant milk powder, natural milk need to go through multiple heat t reatment process, the activity of bovine lactoferrin bound to varying degreesaffected, and this is ignored by most people. A large number of data have shown that Lactoferrin is very sensitive to heat and prone to thermal aggregation phenomenon.This study a ims to be hardened in the processing aspects of the physical and chemical properties of bovine lactoferrin,the protein thermal aggregation made a preliminary exploration, and investigate the after heat treatment, the proliferative activity of osteoblasts, so that processing of the milk powder, in particular, functional milk powder processing to provide effective temperature control of process parameters. In this study, the crude purified natural bovine lactoferrin re- isolation and purification, purity 90%, as to the lactoferrin standard products of Sigma. Molecular weight observed by SDS-PAGE gel electrophoresis analysis of protein bands using Quantity One software, we get a purity of 90% Lactoferrin sample, its purity is as tothe 90% purity Lactoferrin standard product purchased from Sigma. Subsequently, the purified Lactoferrin preparation of iron saturated Lactoferrin (Holo-Lf) and completely iron deficiency Lactoferrin (Apo-Lf), freeze-drying, spare. Preparation of three different iron saturation Lactoferrin powder into the same concentration of protein solution, the measured absorbance values in the 465nm wavelength, the experiment was repeated three times to obtain average to determine the three proteins of iron saturation. Iron saturation of the obtained samples were as follows: the iron saturation of the native Lactoferrin is 15.32%, iron saturation of the Holo-Lf is 89.10%, iron saturation of Apo-Lf is 3.73%, All in compliance with production standards. Three different iron saturation of Lactoferr in is measured by Disfenential Seanning Calorimetry (DSC) thermal mutagenic peak, and provide the basis for the heat treatment temperature. The results are as follows: the Native-Lf has two hot mutagenic peak, respectively are 62.66 ? and 69.83?， the heat mutagenesis peak of Apo-Lf is 62.10 ?， and the hot mutagenesis peak of Holo-Lf is 70.18?. According to the test results of DSC, the heating conditions of 60 ?, 65 ?, 70 ?, 80 ?, and 90 ? water bath for 5min were iii selected. After heat treatment, by three different microplate determinations of the three different kinds of Lactoferrin, combined with state lactoferrin iron saturation conditions, compared with the value of the unheated investigated the influence of heat treatment on the saturation of Lactoferrin. The experimental results showed that almost no change of iron saturation after the heat of the Holo- Lf, under the conditions of heating 80? for 5 min, Native- Lf shows the phenomenon of loss of iron, under 80? heating conditions, iron saturation reduction of Apo-Lf is more obvious. Molecular weight changes of the three heated Lactoferrin were observed by SDS-PAGE gel electrophoresis and software analysis, in order to determin the heat treatment after protein ther- -mal aggregation or thermal decomposition. Meanwhile, the three protein samples after heat treatment 5000g centrifugation for 10 min, the protein concentration in the extract supernatant was measured by microplate absorbance combination with the standard curve to determine the heat treatment. This result and electrophoresis were combined to examine the protein thermal aggregation phenomenon. The study has found that the native Lactoferrin in the heating temperature of 70? arise thermal aggregation phenomenon and protein content starts to decrease. Holo-Lf in the heating temperature of 90? arise slight thermal aggregation phenomenon. Apo-Lf arise thermal aggregation phenomenon when the heating temperature is 70?, and that is more obvious than native Lactoferrin, moreover, accompanied by the lowest protein content. In this study, we successfully separate and determine the skull of osteoblasts by newborn Wistar rats, and subculture. After heat treatment of three different iron saturation of Lactoferrin, they were reacted with osteoblasts for 48h, and the osteoblast proliferation was determined by MTT assay. When native Lactoferrin heated to 70?, the activity decreased. When the temperature is 80?, the activity of Holo-Lf began to decline. When the heating temperature is 70?, the activity of Apo-Lf is significantly decreased, but when raise the heating temperature up to 90?, the activity recovered, which may be related to the proteolysis of Apo-Lf. Key words: Lactoferrin, thermal stability, Iron saturation, thermal aggregation, osteoblasts 4 目录 绪论 .............................................................................................................................................................................1 1 1.1 引言 ........................................................................................................................................................................1 1.2 乳铁蛋白及其理化性质 .....................................................................................................................................2 1.3 乳铁蛋白热稳定性的研究 ................................................................................................................................3 1.4 乳铁蛋白与铁结合状态的研究 .......................................................................................................................4 1.4.1 铁饱和型乳铁蛋白的结构 .........................................................................................................................4 1.4.2 缺铁型乳铁蛋白的结构 ..............................................................................................................................5 1.5 乳铁蛋白生物功能研究 .....................................................................................................................................6 1.5.1 乳铁蛋白促成骨细胞增殖活性影响的研究 ..........................................................................................6 1.5.2 乳铁蛋白其他生物活性的研究 ................................................................................................................7 1.6 本课题研究的立题背景、研究意义和内容 ...............................................................................................10 1.6.1 立意背景及研究意义 ................................................................................................................................10 1.6.2 研究内容 ......................................................................................................................................................11 牛乳铁蛋白样品的制备及热稳定性的测定 ....................................................................................................12 2 2.1 引言 ......................................................................................................................................................................12 2.2 材料与方法 .........................................................................................................................................................12 2.2.1 实验材料 ......................................................................................................................................................12 2.2.2 实验试剂 ......................................................................................................................................................13 2.2.3 实验仪器及设备 .........................................................................................................................................13 2.2.4 实验方法 ......................................................................................................................................................14 2.3 结果与分析 .........................................................................................................................................................17 2.3.1 乳铁蛋白纯化结果 ....................................................................................................................................17 2.3.2 三种不同结合态乳铁蛋白示差扫描量热仪图谱 ...............................................................................19 2.3.3 结果分析 ......................................................................................................................................................20 2.4 本章小结 .............................................................................................................................................................21 热处理对牛乳铁蛋白样品铁饱和度的影响 ....................................................................................................22 3 3.1 引言 ......................................................................................................................................................................22 3.2 材料与方法 .........................................................................................................................................................22 3.2.1 实验材料 ......................................................................................................................................................22 3.2.2 实验试剂 ......................................................................................................................................................23 3.2.3 实验仪器及设备 .........................................................................................................................................23 3.2.4 实验方法 ......................................................................................................................................................24 3.3 结果与分析 .........................................................................................................................................................25 3.3.1 样品加热前铁饱和度测试结果与分析 .................................................................................................25 3.3.2 样品加热后铁饱和度测试结果与分析 .................................................................................................25 3.4 本章小结 .............................................................................................................................................................26 热处理对牛乳铁蛋白聚合物的影响 .................................................................................................................28 4 4.1 引言 ......................................................................................................................................................................28 4.2 材料与方法 .........................................................................................................................................................28 v 4.2.1 实验材料 ......................................................................................................................................................28 4.2.2 实验试剂 ......................................................................................................................................................29 4.2.3 实验仪器及设备 .........................................................................................................................................29 4.2.4 实验方法 ......................................................................................................................................................30 4.3 结果及分析 .........................................................................................................................................................32 4.3.1 凝胶电泳结果 .............................................................................................................................................32 4.3.2 蛋白浓度的测定 .........................................................................................................................................35 4.4 本章小结 .............................................................................................................................................................37 热处理对牛 LF 促成骨细胞增殖活性影响的研究 ........................................................................................39 5 5.1 引言 ......................................................................................................................................................................39 5.2 材料与方法 .........................................................................................................................................................39 5.2.1 实验材料 ......................................................................................................................................................39 5.2.2 实验试剂 ......................................................................................................................................................40 5.2.3 实验仪器及设备 .........................................................................................................................................41 5.2.4 实验方法 ......................................................................................................................................................41 5.3 结果与分析 .........................................................................................................................................................44 5.3.1 成骨细胞的分离培养 ................................................................................................................................44 5.3.2 成骨细胞的鉴定 .........................................................................................................................................47 5.3.3 四唑盐比色法(MTT)检测促成骨细胞增殖活性 ................................................................................48 5.4 本章小结 .............................................................................................................................................................51 及展望 .............................................................................................................................................................52 6 6.1 主要结论 .............................................................................................................................................................52 6.2 创新点 ..................................................................................................................................................................53 6.3 展望 ......................................................................................................................................................................53 参考文献 ...........................................................................................................................................................................55 致谢 ....................................................................................................................................................................................60 附录 1 攻读学位期间发表的论文目录 .....................................................................................................................61 版权声明 ...........................................................................................................................................................................62 vi 1 绪论 1.1 引言 乳品工业在食品工业中占据着十分重要的地位，呈现出强劲的发展势头，乳品科学与技 术的相关基础研究也突显出重要意义。近年来，国内外科学家们开始深入研究关于牛奶非常 规成分的基础科学知识，其中对乳蛋白，尤其是乳铁蛋白的深入研究成为一个非常热门的课 题。乳铁蛋白(Lactoferrin，LF)是从牛乳乳清中分离出来的一种具有生物活性的多功能蛋 白质，是国内外研究最广泛的乳蛋白之一。 随着乳铁蛋白的开发研究，近年来，多次有关乳铁蛋白的国际研讨会相继召开。主要探 讨了乳铁蛋白的结构、性质、生理活性、体外表达、临床应用等方面的最新进展[1, 2]等。这 些充分表明，乳铁蛋白特有的生物学意义已经受到世界范围的广泛关注。牛乳是目前婴儿配 方奶粉的主要原料，其中乳铁蛋白在婴幼儿的生长发育过程中发挥着重要作用，尤其是增强 免疫力和促进骨骼发育等方面。随着乳铁蛋白的分离纯化技术的完善，生产成本的下降，乳 铁蛋白的应用也将更加广泛。乳铁蛋白可以作为功能性成分添加到各类食品中，具有代表性 的是在婴幼儿配方奶粉中的应用广泛，是使其接近母乳的一个重要方面，能够有效促进婴幼 儿的生长发育。目前，婴幼儿奶粉的研究重点是模拟母乳中具有生物免疫活性的功能因子， 其中最重要的有乳铁蛋白及溶菌酶等。日本于 1986 年最先开发出添加了乳铁蛋白的婴儿配 方乳粉、脱脂乳粉等产品。美国及日本的公司已开发了含免疫球蛋白或乳铁蛋白等活性物质 的婴儿配方奶粉。我国也已经开始了这方面的工作，卫生部在国家标准《食品添加剂使用卫 生标准 GB2760,1996》2004 年增补品种中批准允许在婴儿配方奶粉中添加乳铁蛋白，添加 量上限是 50mg/100g 奶粉。近年来，国内外科学家们开始不断深入研究关于牛奶非常规成分 的基础科学知识，其中 2010 年 8 月，由中国卫生监督协会和中国食品科学技术学会共同 主办，中国院陈君实院士主持的乳碱性蛋白和乳铁蛋白研讨会在北京召开，探讨了乳铁 蛋白的最新研究动态。国外的科学家们早已将牛奶的成分做了细分，我国对于乳碱性蛋白的 深入研究则刚刚起步。随着乳铁蛋白作用、功能、机制的不断阐明和开发应用范围的不断扩 大，乳铁蛋白的相关产品已经广泛应用于乳制品和其他食品中。我国卫生部 2009 年第 18 号 公告中，正式批准乳铁蛋白为新资源食品，而非食品添加剂。但目前我国对乳铁蛋白的生理 功能及其在乳制品加工过程的变化规律尚未开展深入系统的研究。 1 烟台大学硕士学位论文 牛乳作为完善的天然食品对改善我国膳食结构显示出越来越重要的地位， 使得我国奶 业每年以 20%以上的增长速度快速发展。由于生活水平的提高，饮食营养与安全日益受到重 视，人们越来越关注食品中影响健康的可能因素。乳铁蛋白是从牛乳乳清中分离出的具有生 物活性的蛋白质，具有促进人体成骨细胞增殖和调节破骨细胞的功能，调节机体的免疫功能， 抑制脂肪过氧化的抗氧化作用，广谱抗菌、抗病毒感染等生物活性。目前国外对乳碱性蛋白 的研究主要致力于乳铁蛋白及其对骨质疏松的研究、开发与利用，乳铁蛋白的许多生物活性 已被世界公认， 并被广泛地应用于母乳化婴儿奶粉或其它功能性食品中。在我国，近几年， 对乳中生物活性物质的研究有所重视，但对乳铁蛋白的开发研究和应用尚属空白。对于牛乳 铁蛋白的功能性成份、种类及含量的差异，以及在生物体内的消化吸收和对生长发育的生理 功能影响还不十分清楚。因此，解决乳制品加工过程中乳铁蛋白发生的变化及对生理作用的 影响，使我国母乳化奶粉的研究上一个新台阶，对促进我国乳制品加工向精深方面发展具有 深远意义。 牛乳在采集、运输和加工过程中面临着诸多环节，尤其在加工过程中，热处理环节是必 不可少的，例如原料乳的热杀菌、真空浓缩、喷雾干燥等。其中巴氏杀菌是处理牛乳原料最 常用的热处理方式之一，本实验主要研究背景即为在巴氏杀菌温度条件下，对牛乳铁蛋白造 成的理化性质、化学性质的变化及生物活性的影响做出一定的研究。 1.2 乳铁蛋白及其理化性质 乳铁蛋白是从乳或乳清蛋白中分离出来的一种天然的复合蛋白质组分，以微量形式存在 于牛乳和人母乳中，占乳碱性蛋白总蛋白含量的 34.3%。在人乳中， 乳铁蛋白是人乳中的 四种主要蛋白质之一，约占人乳总蛋白的 20%，其营养价值至少有二方面:一是作为氨基酸 的膳食蛋白源，二是有利于铁的生物利用。几乎所有动物的乳汁中都含有乳铁蛋白，但不同 动物含量不同。它尽管有―乳铁蛋白‖的称谓，它并非乳汁所特有，在哺乳动物的许多外分泌 物中都存在，如:眼泪、唾液、精液等，只是除乳中外，其他分泌物中含量甚微。而牛的初 乳中含有这种生物活性物质，是提取和利用乳铁蛋白的最适来源之一。通常随着泌乳过程的 进行，乳中的乳铁蛋白的含量开始迅速下降，到达常乳时趋于平稳，人初乳中含量 5~7g/L， 常乳中 1~3g/L，牛初乳中 0.8 g/L 左右，牛常乳中 0.1~0.4g/L，含量较母乳低许多。因此， 在婴儿奶粉中添加乳铁蛋白，才能更好的模拟人乳成分，达到婴儿膳食要求。 早在上世纪 60 年代，乳铁蛋白相继的从人乳和牛初乳中被纯化分离出来，起初它被作 2 烟台大学硕士学位论文 为一种粉红色的碱性蛋白被人们所知，但其典型特征是非血红素类蛋白，是转铁蛋白家族中 的一员，并且紧密的结合着铁离子，由此而得名[1-3]。天然的乳铁蛋白铁饱和度为 15%~20%， 为粉红色粉末状。常态乳铁蛋白对铁有很强的亲和作用，但是这种作用是可逆的，粉红色也 随着铁的多少而变深变浅。乳铁蛋白结合铁离子的同时也伴随着结合碳酸根离子，并且这种 结合是可逆的[4,5]。乳铁蛋白和其他转铁蛋白一样，都有一条单一的多肽链，在肽链上连接有 两个球状叶片，这两枚叶片分别代表着 N-末端和 C-末端，这两枚叶片是同源的，且两端由 10~15 个氨基酸残基连接，在乳铁蛋白结构中形成有三个拐点的 α 螺旋结构。每一个 N-端和 C-端又分别连接两个蛋白配体，N-端结合着 N1 和 N2 配体，C-端结合着 C1 和 C2 配体，他 们都可以结合铁离子。N1端可以代替氨基酸序列中的 1~90 和 251~233;N2 端代替 91~259; C1 端代替 345~431 和 593~676;C2 端代替 432~592[6]。序列中的 334~344 代表着乳铁蛋白 肽链的连接链,包含三个转折点，起着打开和闭合 N-端 C-端的作用[7]。通过 X 射线结晶学分 析检测乳铁蛋白的全铁(Holo)和缺铁(Apo)结构发现，由图 1-1[8]可以看出，全铁型乳铁 蛋白(A)和缺铁型乳铁蛋白(B)的 C1 和 N1 端是完全相同的，但是铁饱和型乳铁蛋白的 N2 配体比缺铁型乳铁蛋白结合紧密，C2 配体也是同样，因此，从蛋白的二级结构上分析， 铁饱和型乳铁蛋白呈闭合状态，而缺铁型乳铁蛋白则呈开放状态，前者也更为稳定。 图 1-1(A)为铁饱和型乳铁蛋白结构图;(B)为缺铁型乳铁蛋白结构图 1.3 乳铁蛋白热稳定性的研究 随着对乳铁蛋白的研究不断深入，其功能不断被揭示，有研究表明乳铁蛋白具有多方面 3 烟台大学硕士学位论文 生物学功能特性而且安全无副作用，功能特性具有广谱抗菌、抗病毒感染的效果;对铁吸收 有调节作用;对人体肠道菌群改善作用;可参与调节机体的免疫功能，增强机体的抗病能力; 有很高的抑制脂肪过氧化的抗氧化作用;抗癌症的作用;有刺激生长的效果等。除此之外， 乳铁蛋白还具有促进人体成骨细胞增殖和调节破骨细胞的功能。有研究报道称，常态的乳铁 蛋白在碱性条件和中性条件下，容易失活。 牛乳铁蛋白在 pH=6.6 的条件下，加热温度为 65~69 ?时就发生失活。人们发现， 乳铁蛋白的热稳定性随着铁饱和度的增加而增加，而 且铁饱和型乳铁蛋白的两叶也具有不同的热稳定性，这可能是由于它的结构更紧密因而更难 以失活。 但是在酸性条件下缺铁型乳铁蛋白(Apo -Lf)非常稳定，在 pH =4. 0 环境下 90? 热处理 5min，其铁结合能力、抗原活性以及抗菌活性与未处理前相同。在 65~95?的加热 温度范围内，乳铁蛋白的热变性程度随温度升高而逐渐增加。此外，缺铁型乳铁蛋白在 pH 2.0~pH3.0 条件下 100~200 ?处理 5min 时明显发生降解，而其抗菌活性却有所增强。这是 由于乳铁蛋白水解后成为乳铁蛋白活性多肽(LfcinB)。据资料显示，这种活性多肽也具有 特殊的生理功能，它的抑菌效果是乳铁蛋白的 400 倍，由此说明乳铁蛋白的活性部位是很稳 定的，能耐受酸性降解[9]。牛乳铁蛋白的热稳定性取决于环境因素，如 pH 、盐和乳清蛋白 等。牛源性的缺铁型乳铁蛋白和铁饱和型乳铁蛋白在牛乳体系中比在磷酸缓冲液中对热更敏 感。而在磷酸缓冲液中，缺铁型乳铁蛋白和铁饱和型乳铁蛋白变性得更快 [10]。 1.4 乳铁蛋白与铁结合状态的研究 铁饱和型乳铁蛋白的结构 1.4.1 乳铁蛋白的一条多肽链上连接两枚银杏叶状的末端，分别为 N-端和 C-端，N-端和 C- 端又分别连接两个配体:N1、N2 和 C1、C2。铁饱和型乳铁蛋白(Holo-Lf)的 N1、N2、 C1、C2 四个蛋白配体都能够结合铁离子，因此使它的结构呈半闭合状态，有效的使其和外 部环境隔绝起来。并且这四个蛋白配体可以发生协同作用结合碳酸根离子，与金属离子形成 共价结构，这就揭示了铁饱和型乳铁蛋白结构紧密且不易失铁的原因[4]。乳铁蛋白的四个配 体是典型的铁结合位点和阴离子(碳酸根)结合位点，这四个蛋白配体分别是两个酪氨酸， 一个门冬氨酸，一个组氨酸。碳酸根离子与精氨酸残基结合，位于 Helix5(5 号螺旋)的 N- 端负责更紧密的结合碳酸根离子(见图 1-2)[11]。铁饱和型乳铁蛋白稳定性非常好，仅在酸 性条件下和金属螯合剂的作用下才会失铁。研究表明，在 pH,4 时，铁饱和型乳铁蛋白开 4 烟台大学硕士学位论文 始失铁，最终在 N-端和 C- 端形成完全的去糖基化，并且失去一半甚至全部的铁结合能力[12]。 乳铁蛋白可以结合各种类型的金属离子，质量分数小到铝离子[13]，中到过渡金属锰铜锌[14]， 大到镧系稀土元素，乳铁蛋白都可以与他们发生结合，但他们的亲和力都小于三价铁离子[15]。 图 1-2 缺铁型乳铁蛋白结合碳酸根离子图 缺铁型乳铁蛋白的结构 1.4.2 通过生物物理学的研究发现，缺铁型乳铁蛋白的稳定性和配体紧密程度相较于铁饱和型 乳铁蛋白都相差许多，多数构象上的变化都伴随着金属的结合和流失[16]。这种构象同时也造 成缺铁型乳铁蛋白更容易发生热诱变和蛋白质水解。缺铁型乳铁蛋白铁结合能力低与两枚叶 片同时相关，也就是说，当乳铁蛋白缺铁时，四个配体同时发生折叠和扭转，并不是某一个 区域单独作用的结果[17-19]。乳铁蛋白多肽链 由 α 螺旋和 β 折叠构象，N 叶和 C 叶都折 叠成相似的结构，大约有 40% 的相似性，不同之处在于环状结构 。每叶都有 2 个相似的 α / β 配体(N1 和 N2 ;C1 和 C2 )， 其中一叶基于 6 束 β 层状结构，另一叶基于 5束 β 层状结构。每个叶片结构能够协同一个碳酸根离子，结合一个金属离子。铁的结合位点是一 个深深的裂缝。目前 X 衍射的最大分辨率( 2.8Å)尚不能分辨这 2 个铁结合位点的不同 之处[20]。乳铁蛋白的一级结构中，半胱氨酸(Cys)的数量和位置决定着分子内二硫键的形 成，而 N-端和 C-端的天门酰胺则是几个潜在的 N- 糖基化位点。分子中非共价的链接大多 数是疏水的，给两叶提供了一个缓冲部位，而 C-末端的螺旋( 第 678~691 位氨基酸残基) 5 烟台大学硕士学位论文 可以相互的作用。螺旋的 N-末端对着域间的裂缝，使得裂缝处带正电荷，另一个螺旋， N2 或 C2 )是碳酸氢根的结合部位。通过晶体学分析，三价铁离子释放时 N 叶和 C 叶上都 发生了四个蛋白配体的移动，每个配体都与另一个分离，并进行折叠，开放铁结合的裂缝。 这样的移动可能是由两枚叶片(N-端和 C-端)间的铰链的快速移动造成的[21]。由图 1 中的 B 不难看出，乳铁蛋白分子多肽链结构中 N-端在左边，C-端在右边。缺铁型乳铁蛋白(Apo-Lf) 的 N 叶(左边)是开放的，在铁结合位点后有一个 54?旋转的铰链，而 C-端是关闭的，即 使在没有铁结合的状态下，N-端和 C-端同时关闭或开放，而这两个状态之间的转变，正是 转运铁的过程[22]。 1.5乳铁蛋白生物功能研究 乳铁蛋白促成骨细胞增殖活性影响的研究 1.5.1 人的骨骼在不断地的生长发育，这依赖于成骨细胞和破骨细胞功能的平衡，一旦失衡成 骨细胞减少, 而破骨细胞活性增强，骨骼正常发育就会被破坏。日本雪印乳业技术研究所发 现了乳中功能性成分——乳铁蛋白。此后多个研究小组先后报导了牛乳碱性蛋白对骨健康的 有益作用[23-25]。乳铁蛋白是铁转运蛋白家族中的一种铁结合蛋白，是初乳形成阶段、泌乳期、 涸乳期和患乳房炎期间乳牛乳房腺体分泌物中主要的糖蛋白之一。它最初于 1939 年由 Sorensen 等人在从动物乳中分离乳清蛋白时首次发现，1953 年 Polis 等在制各乳过氧化物酶 时得到了它的粗制品，1960 年由 Groves 用色谱法首次人乳和牛乳中分离获得了这种红色蛋 白的纯品，并确认它是一种含铁蛋白质，将其命名为乳铁蛋白[26]。根据铁饱和度不同，可将 其分成铁不饱和或缺铁型乳铁蛋自(Apo-Lf)、铁半饱和型或单铁型乳铁蛋白(包括 C-端单铁 乳铁蛋白和 N-端单铁乳铁蛋白)、铁饱和型或全铁型乳铁蛋白(Holo-Lf)[27]。乳铁蛋白是一种 具有抑菌、抗菌、抗病毒以及免疫功能的多效因子。2005 年，乳铁蛋白被发现具有促骨生 长的功效[28]。 Azuma 等(1989)报道了 LP 对鼠 3T3 成纤维细胞有促进作用。乳铁蛋白可调控细胞增殖， 作为反馈因子参与骨髓生成调控。在大鼠成纤维 L-M 细胞中表现出促进神经生长因子和分 泌的作用，另外也可促进细胞内质增殖。乳铁蛋白可以促进成骨细胞增长，增强胸腺嘧啶结 合形成骨细胞，降低成骨细胞的凋亡 50%~70%。东北农业大学的肖晖，刘宁[29]通过实验证 明乳铁蛋白能促进骨细胞增殖分化，并且能够调节成骨细胞 RAKKL/OPGmRNA 的表达， 6 烟台大学硕士学位论文 从而抑制破骨细胞介导的骨吸收。体内研究表明，乳铁蛋白能促进骨骼生长，在生理浓度下 能有效刺激骨细胞增殖和分化，抑制破骨细胞形成，在骨生长和代谢中起到一定作用。 由于乳铁蛋白具有多种生物活性功能，对人体有广泛的营养价值，因此具有较大的工业 利用价值。但是在乳品加工中，热处理是极为常见的操作单元，乳铁蛋白的热稳定性对热处 理的承受能力也成为目前研究的热点。牛乳铁蛋白的等电点为 8.0，易于与具有酸性特征的 大分子结合。有研究表明，乳铁蛋白能和其它蛋白质如酪蛋白、乳清蛋白、β-乳球蛋白、α- 乳白蛋白、IgA、溶菌酶等形成复合物[30, 31]。这也是其在加热过程中活性稳定性下降的重要 原因之一。早在 1977 年，Ruegg 等就研究了牛乳超滤透过液中的牛乳铁蛋白的热稳定性， 在 pH 值为 6.6、温度为 65~69?时乳铁蛋白开始失活[32]。此后，有人报道了人乳铁蛋白的热 失活特点。结果表明，70?加热处理 15~30 min 已使它完全降解[33]。上述的结果大都是在中 性或碱性条件下进行的。Riroaki 等[34]和 Marie 等[35]研究了牛乳铁蛋白在酸性条件下的热稳 定性，研究结果表明在酸性条件下缺铁型乳铁蛋白较为稳定，在 pH 值为 4.0 和 90?下加热 处理 5min 其铁结合能力、抗原活性以及抗菌活性与未处理的乳铁蛋白相同;在 pH 值为 2.0~3.0 和 100?热处理 5min 后，乳铁蛋白发生部分降解，但其降解后片段也具有抑菌活性， 整体抑菌活性有所增强。另据研究表明，乳铁蛋白经 72?处理 15 s(巴氏杀菌)，与未加热 135?处理 4s(UHT)，则破坏了铁饱和型 的对照组相比，其抗菌活性几乎未受影响;而经 乳铁蛋白与细菌的结合能力，以及缺铁型乳铁蛋白的抑菌活性[35]。Sanchez 等[36]认为，乳品 工业中所采用的标准巴氏杀菌法也不会影响乳铁蛋白的分子结构。 上述这些热处理对乳铁蛋白活性的影响研究，仅限于对乳铁蛋白免疫调节活性、抗菌活 性、铁离子结合能力等方面，但在热处理对乳铁蛋白促进成骨细胞增殖活性的影响方面未见 报道。鉴于上述分析，本课题拟开展温度时间效应对乳铁蛋白促成骨细胞增殖活性的影响机 制研究。该研究结果将为生产实际中有效保护乳铁蛋白活性的加工工艺提供有力的理论基 础。 乳铁蛋白其他生物活性的研究 1.5.2 1.5.2.1 刺激和强化铁吸收 许多研究已经表明，由于乳铁蛋白结构的特殊性使其具有多种生物功能，在机体中，乳 铁蛋白对维持细胞的铁离子水平也起着至关重要的作用。多年前的研究已表明，母乳喂养的 婴儿不会产生铁缺乏症，而那些食用无添加婴儿配方奶粉的儿童则在日后的生活中大都发生 7 烟台大学硕士学位论文 铁缺乏症，这正是因为母乳中含有乳铁蛋白所致[37,38]。由于乳铁蛋白耐受胃酸，可以在肠道 中运载铁离子，提高肠细胞对铁的生物可利用性。其依据之一就是人乳中铁的生物利用率要 远远高于牛乳或是婴儿配方食品中铁的生物利用率。乳铁蛋白是一种有效的铁增补剂，研究 表明，作为铁强化剂，其吸收强于其他 Fe3+和 Fe2+等补铁制剂。早年的研究就已表明，对患 有缺铁性贫血的大鼠饲喂铁结合乳铁蛋白，红细胞和血红蛋白的数目增加，饲喂普通 FeSO4 [39] 欲达到相同效果，摄入量则需提升 4 倍 。但采用高剂量的乳铁蛋白对断奶后小鼠进行灌 胃实验则发现其肝脏中铁含量呈下降趋势[40]。 1.5.2.2 广谱抗菌性 大量体内和体外实验已经证实，乳铁蛋白具有广谱抗菌性。抑菌活性的极限浓度范围是 0.2~1.0 mg/ml 之间，抑菌效果取决于乳铁蛋白的饱和度、微生物对铁的需求程度、外源铁的 生物利用率、盐类、抗体和其他免疫物质等因素。乳铁蛋白的抑菌效果与 pH 范围也密切相 关:在中性 pH 条件下具备较强的活力;体系的 pH 为 7.4 时，抑菌效果明显强于 pH 为 6.8 时;当 pH,6 时，基本无抑菌作用[41,42]。 乳铁蛋白既可抑制革兰氏阴性菌，如大肠菌群、沙门氏菌、志贺氏菌等;也可抑制革兰 氏阳性菌，如金黄色葡萄球菌、单细胞李斯特菌等;同时还对耐酸耐醇菌(结核杆菌)有抑 制作用。乳铁蛋白的抑菌性得力于其高度的铁结合能力，限制了细菌感染部位的铁离子供应， 并抑制这些微生物的生长和毒性因子表达。乳铁蛋白能直接作用于细菌表面，毁坏革兰氏阴 性菌外膜的脂多糖(LPS)，其主要机理是，乳铁蛋白带电的 N-端抑制 LPS 与细菌代谢所需 的 Ca2+ 和 Mg2+等阳离子结合，LPS 从细胞壁脱落，细胞通透性增加，进而造成细菌细胞凋 亡。同时，乳铁蛋白与 LPS 的交互作用也增强了溶菌酶这类天然抗菌剂的抗菌性[43]。 乳铁蛋白对革兰氏阳性菌的抑菌机制则是基于其自身净余正电荷可以结合细菌表面脂 磷壁酸所带的负电荷，引起细胞壁负电荷的减少，有利于溶菌酶与底层肽聚糖反应，发挥溶 菌酶的抑菌特性[44]。另有研究表明，乳铁蛋白可以阻止某一细菌直接接触宿主细胞。抑制连 接的机制现不明确，但有推断是乳铁蛋白的低聚甘露糖结合细菌细胞表面配基，阻止其与宿 主细胞受体接触[45]。 1.5.2.3 抗病毒特性 近年来对乳铁蛋白(LF)的抗病毒特性的研究成果显著，结果表明乳铁蛋白对感染人类 及动物的 RNA 和 DNA 病毒具有广泛的抗病毒活性，这一研究成果在 2001 年首次被提出。 8 烟台大学硕士学位论文 研究证实，连续 8 周摄入牛源乳铁蛋白可以降低血清中丙型肝炎病毒(HCV)核糖核酸的含 量，其作用原理可简单概括如下:HCV 病毒有两个包膜糖蛋白 E1 与 E2，E1 与 E2 易形成 异低聚物，牛源乳铁蛋白能够抑制 E1 与 E2 键断裂，并直接作用于 E2。牛源乳铁蛋白能有 效地抑制病毒对肝细胞和淋巴细胞的吸附，且牛源乳铁蛋白与 HCV 作用速度要比病毒吸附 到受体细胞快，从而有效的抑制病毒感染[46,47]。 牛源乳铁蛋白还可抑制艾滋病毒(HIV)，对大鼠的类艾滋病有预防作用，起码在病毒 感染的前 20 天左右对其有抑制作用(即病毒刚吸附到靶细胞上时)，与此同时，金属元素饱 和的乳铁蛋白对 HIV 病毒的作用比常态乳铁蛋白的作用弱[48]。 除此之外，乳铁蛋白还可通过与病毒蛋白结合或更快速的结合宿主细胞等方式来抑制病 毒感染，因此可以有效的阻止巨细胞病毒、脊髓灰质炎病毒、轮状病毒、肠病毒以及人乳头 瘤病毒等的感染[49]。 1.5.2.4 调节机体免疫及抗炎症的活性 Wakabayashi 等使用的定量逆转录聚合 乳铁蛋白是一种天然的机体免疫调节剂，2006 年 酶链反应(RT -PCR)方法检测小鼠肠道内 20 个相关免疫基因的表达，发现牛乳铁蛋白可以 对这些基因进行特异和非特异性的表达[50]。乳铁蛋白属于人体中性粒细胞的分泌物，可以调 节巨噬细胞活性和刺激淋巴细胞合成等作用，各种免疫细胞表面都有人乳铁蛋白的受体存 在。通常情况下血清中乳铁蛋白的浓度是较低的，约为 0.3~0.5μg/ml，但当细胞受到感染时 乳铁蛋白将从活化的嗜中性白细胞中释放到血液中，含量可升高到原来的 6~20 倍，因此乳 铁蛋白具有抗炎症的作用并抑制粒单系祖细胞生长，这种抑制作用与分子中铁饱和程度有 关，铁完全饱和的乳铁蛋白抑制作用最强。乳铁蛋白的活性作用机理依赖于靶细胞以及乳铁 蛋白结合特异分子的能力，机体释放出的乳铁蛋白可以结合致病菌细胞膜上的 LPS 造成其 死亡，从而调节机体免疫反应。有研究表明，乳铁蛋白可以促进抗体的生成，通过诱导体液 免疫反应影响 T 细胞和 B 细胞的成熟，促进淋巴细胞增生，从而减轻炎症。 1.5.2.5 抗癌作用 自 1997 年开始，国外多个研究小组着手展开对乳铁蛋白抗癌活性的研究，并取得了突 破性的进展，通过多次的动物实验结果表明乳铁蛋白对特定的癌症，比如结肠癌具有非常显 著的治疗效果。分别对大鼠和家鼠的日常饮食中加入一定量的牛乳铁蛋白发现:乳铁蛋白对 结肠、食道、膀胱、肝脏等器官上能引发癌症的肿瘤具有抑制作用;对自发性肠息肉有抑制 9 烟台大学硕士学位论文 其增长的作用;并且对家鼠体内的肿瘤细胞注射有抑制其转移和发展的作用[51]。乳铁蛋白的 铁结合能力阐释了它背后具有多种生物活性的原因:游离铁可作为诱变的启动子，通过诱导 氧化损伤的核酸结构，因此，当乳铁蛋白结合组织中的铁时，就降低了氧化剂诱发癌和结肠 腺癌的风险。 除上述生物活性功能外，乳铁蛋白还具有很高的抑制脂肪过氧化作用，因此在随后的研 究中指出，口试乳铁蛋白能降低老鼠血清和肝脏中的脂肪含量。乳铁蛋白保证炎症部位的嗜 中性粒细胞免受氧化损伤，实验证明其抗氧化能力高于过氧化物酶 SOD，与褪黑素(MLT) 和维生素 E(VE)的能力相当，成为机体内非常重要的抗氧化剂。乳铁蛋白还起到肠道菌 群的改善以及促进双歧杆菌吸收的作用[52]。 1.6本课题研究的立题背景、研究意义和内容 立意背景及研究意义 1.6.1 乳铁蛋白特有的生物学意义已经受到世界范围的广泛关注。牛乳是目前婴儿配方奶粉的 主要原料，其中乳铁蛋白(Lactoferrin, LF)在婴幼儿的生长发育过程中发挥着重要作用，尤 其是增强免疫力和促进骨骼发育等方面。随着乳铁蛋白的分离纯化技术的完善，生产成本的 下降，乳铁蛋白的应用也将更加广泛。乳铁蛋白可以作为功能性成分添加到各类食品中，具 有代表性的是在婴幼儿配方奶粉中的应用广泛，是使其接近母乳的一个重要方面，能够有效 促进婴幼儿的生长发育。目前，婴幼儿奶粉的研究重点是模拟母乳中具有生物免疫活性的功 能因子，其中最重要的有乳铁蛋白及溶菌酶等。日本于 1986 年最先开发出添加了乳铁蛋白 的婴儿配方乳粉、脱脂乳粉等产品，近几年在印尼、韩国、日本等国家，乳铁蛋白在婴幼儿 奶粉中的应用也有所增加。美国及日本的公司已开发了含免疫球蛋白或乳铁蛋白等活性物质 的婴儿配方奶粉。美国食品药品管理局 FDA 允许乳铁蛋白作为食品添加剂用于运动功能性 食品。但在我国，婴儿配方奶粉中基本不含这种物质。近年来随着我国乳制品工业的快速发 展，乳铁蛋白的研究也越来越受到重视。卫生部在国家标准《食品添加剂使用卫生标准》 ( GB2760-2007)中批准允许在婴儿配方奶粉中添加乳铁蛋白，添加量允许范围是 0.3~1mg/g;但就在2011年6月 1日我国刚出台了新的《食品营养强化剂使用标准》GB14880) ( 中，将乳铁蛋白从食品添加剂调整到了食品营养强化剂里，这对乳铁蛋白的研究是一个极大 的推动。 10 烟台大学硕士学位论文 另外，骨质疏松已成为一个全球性的问题。骨质疏松是全身骨量减少，骨组织显微结构 破坏，骨密度降低，引起骨折危险性增加的一种疾病[53-55]。已有多个研究表明乳铁蛋白能够 减少去卵巢大鼠股骨干骺端的骨量丢失，抑制破骨细胞介导的骨吸收和破骨细胞的形成，从 而提高骨密度，减少和防止骨质流失[56,57]。然而在现今的乳品加工中，对原料乳进行热处理 是不可避免的，很多工艺过程应用了高温处理。这就会导致乳铁蛋白发生变性，从而丧失各 种重要的生理活性。在目前的婴幼儿配方粉生产中，这种情况更为明显，因此乳铁蛋白活性 不同程度的损失，这也是婴幼儿配方粉的产品质量与母乳相差甚远的重要原因之一。同时， 在牛乳受热的过程中，乳铁蛋白的结构性质和活性变化必然受到影响。迄今为止，不但这些 方面的研究缺乏系统性，而且在热处理对乳铁蛋白促成骨细胞(Osteoblast)分化活性的影响 未见报导。因此，如何能从机制上阐明热处理的温度和时间效应对乳铁蛋白活性的影响，对 于产品开发中选择恰当的工艺，或有针对性地进行活性保护，提高产品质量，都具有重要的 意义和作用。 研究内容 1.6.2 本研究选用粗提纯的乳铁蛋白样品，采取 Superdex G200 凝胶色谱层析方法进一步提纯 分离出高纯度乳铁蛋白样品，用 SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳确定其纯度。同时将样品 配制成铁饱和型乳铁蛋白和缺铁型乳铁蛋白。对三种不同构象的乳铁蛋白进行相同时间不同 加热温度的方法，考察其特性。首先用示差扫描量热仪(DSC)检测未加热前三种乳铁蛋白的 热稳定性，以此为依据确定加热温度为 60?，65?，70?，80?，90?，均为 5min。以未 加热的乳铁蛋白为参照，通过分光光度计检测加热后的乳铁蛋白样品吸光度，找出其铁饱和 度的变化规律。并通过 SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，考察受热后三种不同乳铁蛋 白的热聚合现象，用 Quantity One 软件分析其蛋白纯度的变化。制定蛋白标准曲线，通过酶 标仪的检测结合标准曲线考察三种乳铁蛋白在不同加热条件下蛋白浓度的变化趋势。最后进 行促成骨细胞增殖活性影响的研究，目的是考察热处理引发的乳铁蛋白铁结合力的变化和蛋 白的变化是否对促成骨细胞增殖活性有影响。 11 2 牛乳铁蛋白样品的制备及热稳定性的测定 2.1引言 在牛初乳中，乳铁蛋白的质量浓度为 1.00 g/L，比牛常乳高近 50 倍，但就目前国内外 牛初乳产品制造情况看还只停留在粗加工阶段。目前我国奶牛存栏数超过 1000 万头，每年 除喂养乳牛外剩余 50 多万吨牛初乳，可年产近 500 吨乳铁蛋白，但它们并没有得到很好的 利用而是白白浪费掉了。乳铁蛋白的纯化方法有很多种，其中最常用的有离子交换层析法、 超滤和固定化单克隆抗体法、盐析法以及酸沉淀法等方法。固定化单克隆抗体法分离效果好， 得到的乳铁蛋白纯度可达 90%以上，但是技术水平要求高，成本昂贵。盐析法操作简单，技 术要求较低，成本低，但得到的乳铁蛋白样品纯度低，约为 50%左右，适合工业化大生产。 酸沉淀法对乳铁蛋白的活性有影响，本实验考察在 pH=7.2 时乳铁蛋白的生物活性，因此不 适用。实验室较常用的乳铁蛋白分离方法有超滤法和凝胶层析法。超滤法分离效果较好，但 是超滤膜造价较高，且膜的清洗和反复利用效率低。离子交换层析法分离效果好，纯度可达 到 98%左右，但是层析柱造价较高，且分离量小，不适合工业化大生产[58]。因此，本实验选 用本研究采用哈尔滨康普乳品有限公司生产的牛源乳铁蛋白粗品，纯度为 70%左右。本研究 采用 Superdex G200 分子筛对乳铁蛋白粗品进行分离纯化，该方法原理是根据离子交换剂对 不同的离子或离子化合物的结合力不同而实现目标物质的分离，其结合力的大小是由离子交 换剂的选择性决定的。再用进一步的分离提纯，通过蛋白质单向电泳结果可知，自行纯化的 乳铁蛋白样品纯度达 90%，并将洗脱液冻干成粉，备用。 将纯化后的乳铁蛋白按方法分别配制成铁饱和型乳铁蛋白[59]和缺铁型乳铁蛋白[60]，纯化 后的乳铁蛋白记为常态乳铁蛋白(Native-Lf)。将自制的两种乳铁蛋白样品透析后冷冻干燥， 备用。用示差扫描量热仪(Disfenential Seanning Calorimetry)测试三种不同铁饱和度乳铁蛋 白样品的热诱变峰值，为下一步热诱变的梯度设计做参照。 2.2 材料与方法 实验材料 2.2.1 牛源乳铁蛋白，哈尔滨康普乳品有限公司;1000μl，200μl，10μl移液枪，德国 eppendorf 12 烟台大学硕士学位论文 公司;1000μl、200μl枪头若干;螺口瓶，哈尔滨伊世达公司;透析袋，哈尔滨伊世达公司; 烧杯若干;2ml、10ml 离心管若干;铝坩埚 20 对; 实验试剂 2.2.2 表 2-1 实验试剂 Tab.2-1 Reagents used in experiment 试剂名称 纯度 生产厂家 Sigma 丙烯酰胺 电泳级. 甲叉双丙烯酰胺 电泳级. Sigma Sigma A.R. Tris 十二烷基硫酸钠 A.R. Sigma Sigma 过硫酸铵 A.R. Amresco TEMED 四甲基乙二胺 A.R. Sigma 甘氨酸 A.R. 巯基乙醇 A.R. Amresco 考马斯亮蓝 R-250 A.R. Sigma 甲醇 天津市广成化学试剂有限公司 A.R. 冰醋酸 天津市大茂化学试剂厂 A.R. 天津市大茂化学试剂厂 硫酸亚铁铵 A.R. 天津北方天医化学试剂厂 乙酸 A.R. 天津北方天医化学试剂厂 乙酸钠 A.R. 天津市广成化学试剂有限公司 磷酸二氢钠 A.R. 天津北方天医化学试剂厂 A.R. 盐酸 天津市大茂化学试剂厂 氯化钠 A.R. 天津市大茂化学试剂厂 碳酸氢钠 A.R. A.R. Amresco EDTA A.R. Fermentas Marker 乳铁蛋白标准品 A.R. Sigma 实验仪器及设备 2.2.3 13 烟台大学硕士学位论文 表 2-2 实验仪器及设备 Tab.2-2 Instruments used in experiment 仪器名称 产地 YC-1 型层析试验柜 北京博医康实验仪器有限公司 RLPHR1-4 型 冻干机 德国 Marin Christ 公司 DHG-9245A 型电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科技有限公司 DK-S26 电热恒温水浴锅 上海精密实验设备有限公司 MILLIQ-A MILLIPORE超纯水纯化系统 密理博中国有限公司 BS124S 型电子天平 梅特勒,托利多公司 LUBY 电磁炉 东莞电磁炉有限公司 BIO-RAD PROTEAN IEF 电泳仪 美国 Bio-Rad 公司 ChemiDoc XRS 凝胶成像仪 美国 Bio-Rad 公司 Pyris 6 DSC 示差扫描量热仪 美国 PerkinElmer 公司 压盖器 美国 PerkinElmer 公司 Mettler pH Mete 梅特勒,托利多公司 AKTAPURIFIER100 快速蛋白纯化仪 美国 GE公司 实验方法 2.2.4 2.2.4.1 乳铁蛋白的纯化及纯度的测定 称取 4g葡聚糖凝胶 G200，加 50ml乙醇不断搅拌，溶胀 24h，再用超纯水煮沸水浴 2h， 是凝胶颗粒充分溶胀并除去乙醇残留，除去凝胶上层水即细小颗粒，用蒸馏水反复洗涤数次， 再以 ph=7.2 的 Tris-HCl缓冲溶液洗涤 3 次，使 pH 和离子强度达到平衡，抽真空除去溶液及 凝胶颗粒内部气泡，将凝胶浸泡在缓冲液中。将洗脱液注入洗干净且固定好的层析柱上，有 薄膜端为层析柱下口，将下口接上乳胶管并用螺旋夹夹紧，打开螺旋夹让洗脱液流出，排除 残留气泡，最后保留 2cm 高度的洗脱液，旋紧螺旋夹。将凝胶轻轻搅拌均匀，用玻璃棒沿 层析柱内壁缓缓注入柱中，待凝胶沉积到柱床下超过 1cm 时，打开下口螺旋夹，继续装住 至柱床高度达 10cm，关闭出口，再用洗脱液平衡 5 个柱体积[61]。上样量为 2ml，乳铁蛋白 14 烟台大学硕士学位论文 浓度为 20mg/ml，流速为 1ml/min，收集洗脱液，每 3ml自动换管。将收集的全部洗脱液注 入 5ml平皿中，每皿 4ml，上覆封口膜密封，在-20?冰箱中预冻 2h后将所有盛有样品的平 皿移入冻干机，冻干条件为-70?(冷阱温度)，真空度为 1.53 kg/cm2冻干 12h 后，将样品移 入螺口瓶中备用。 将制备好的样品和乳铁蛋白标准品用洗脱液配制成浓度为 1%的溶液，分别向每支离心 管中加入 100μl 蛋白溶液，加入同体积的上样缓冲液后和标记物(marker)一同在 100?水 浴锅中热处理 5min 后，上样。 5ml 浓度为 12%分离 SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液的配制如下表: 表 2-3 5 ml SDS-PAGE 分离胶溶液 Tab.2-3 5ml SDS-PAGE separating gel solution 5ml 12%分离胶所需溶液比例 (ml) 水 1.6 30,丙烯酰胺溶液 2 1.5mol/L Tris(PH8.8) 1.3 10,SDS 0.05 10,过硫酸氨 0.05 TEMED 0.002 2ml 浓度为 5%浓缩胶的配制方法见表 2-4: 表 2-4 2 ml SDS-PAGE 浓缩胶溶液 Tab.2-4 2ml SDS-PAGE stacking gel solution 2ml 5%浓缩胶所需溶液比例 (ml) 1.4 水 0.33 30,丙烯酰胺溶液 0.25 1.5mol/L Tris(PH8.8) 0.02 10,SDS 0.02 10,过硫酸氨 0.002 TEMED 2.2.4.2 不同饱和度乳铁蛋白的制备 铁饱和型乳铁蛋白(Holo-Lf)的制备方法参照[62]，称取 0.2g 已纯化的乳铁蛋白样品溶 15 烟台大学硕士学位论文 于 10mM、pH=7.2 的 Tris-HCl缓冲液中，10mM Tris-HCl中包含 75mM 的 NaCl，配置成浓 度为 1%(W/W)的溶液。理论上，1 个 LF 分子可以结合 2 个 Fe3+，纯化后的乳铁蛋白分 子量为 78kDa，因此 100%铁饱和的 Lf 吸光度应为 0.57(A0)，铁含量为 1.40 μg/mg(55.85 X2/78000)。取 0.9 ml该溶液，加入 0(1 ml新鲜配制的 0.1 mol/L NaHCO3溶液，混合均匀 后加入 1.0 ml 0.6mM 的(NH4)2Fe(SO4):溶液，反应 1 h，5000 g 离心 15 min，去除沉淀，经 超纯水透析 48 h，冷冻干燥，备用。 缺铁型乳铁蛋白(Apo-Lf)的制备方法参照[61],将纯化后的 LF 溶于 1.05M pH=4.0 的乙 酸-乙酸钠缓冲溶液中(乙酸-乙酸钠离子强度为 0.2)，其中包含 40mM EDTA 和 0.2M 磷酸 二氢纳，在 4?平衡 12h后，将此溶液用超纯水在 4?下透析 72h，冷冻干燥，备用。 2.2.4.3 DSC 法检测乳铁蛋白样品的热稳定性 采用示差扫描量热法(DSC)研究乳铁蛋白在热处理前后结构变化情况[62]。将仪器先校 准，待基线平衡后将冻干后的三种不同结合态的乳铁蛋白样品配制成浓度为 20%(W/V)的 溶液，缓冲液为纯化蛋白时所用的 Tris-HCl 洗脱液。取 15μl 上述液体于铝质样品盘中，空 白对照为不添加蛋白样品的 15μl 洗脱液，用压盖器密封后置于样品舱中。设置加热温度从 30?至 90?，温度上升速度为 1?/min，每个样品进行 3 次重复，将三次曲线重合后得到图 谱。 16 烟台大学硕士学位论文 2.3结果与分析 乳铁蛋白纯化结果 2.3.1 2.3.1.1 Superdex G200 蛋白纯化图谱 1400 1200 1000 800 mA600 U 400 200 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 ml 图 2-1 蛋白纯化图谱 Fig.2-1 Protein purification map 流速 1ml/min，上样量 2ml，样品浓度:20mg/ml。 17 烟台大学硕士学位论文 2.3.1.2 乳铁蛋白纯化后 SDS-PAGE 凝胶电泳结果 图 2-2 蛋白纯化后凝胶电泳结果 Fig.2-2 Protein purification results by SDS-PAGE 第二泳道为纯化后 LF 样品;第六泳道为 Sigma 公司标品(纯度为 90%) 18 烟台大学硕士学位论文 2.3.2 三种不同结合态乳铁蛋白示差扫描量热仪图谱 图 2-3 常态乳铁蛋白 DSC 扫描图谱 Fig.2-3 Native-Lf DSC scan map 图 2-4 缺铁型乳铁蛋白 DSC 扫描图谱 Fig.2-4 Apo-Lf DSC scan map 19 烟台大学硕士学位论文 图 2-5 铁饱和型乳铁蛋白 DSC 扫描图谱 Fig.2-5 Holo-Lf DSC scan map 结果分析 2.3.3 2.3.3.1 乳铁蛋白纯化结果分析 乳铁蛋白经 Superdex G200 葡聚糖凝胶层析分离，收集的洗脱液冻干后制成蛋白浓度 为 1%的溶液进行电泳分析，见图 3。经 Quantity One 软件分析可知，图 4 中，泳道第二， 第六条带分子量均为:72.98kDa。第六条带为 Sigma 公司纯度为 90%的乳铁蛋白标准品。以 90%为基准，通过 Quantity One 软件分析可得，纯化后的乳铁蛋白纯度也为 90%，且最佳上 样量为 10μl，蛋白浓度为 1mg/ml。 2.3.3.2 乳铁蛋白 DSC图谱结果分析 通过 DSC 示差扫描量热仪的分析图谱可知，常态乳铁蛋白(Native-Lf)有两个热诱变 峰值(见图 5)，分别为 62.66?和 69.83?，此结果可能与乳铁蛋白的二级构象有关。缺铁 型乳铁蛋白(Apo-Lf)的热诱变峰值为 62.10?(见图 6)，继续加热并没有其他峰值的出现， 此现象的出现可能与失去铁离子，蛋白结构变为开放状态，分子链不稳定有关;而铁饱和型 乳铁蛋白(Holo-Lf)的热诱变峰值为 70.18?(图 7)，明显高于缺铁型乳铁蛋白，也高于常 20 烟台大学硕士学位论文 态乳铁蛋白。因此，通过 DSC 检测可以对三种结合态的乳铁蛋白从热稳定上得出结论，铁 饱和型乳铁蛋白,常态乳铁蛋白,缺铁型乳铁蛋白。 2.4本章小结 通过 Superdex G200 葡聚糖凝胶层析的分离纯化技术，设定流速 1ml/min，上样量 2ml， 样品浓度:20mg/ml，得到纯度为 90%乳铁蛋白样品，确定最佳蛋白浓度为 1%，上样量为 10μl。以纯化后的乳铁蛋白为原料，成功制备成全铁型乳铁蛋白和缺铁型乳铁蛋白。通过示 差扫描量热仪(DSC)分析，确定三种乳铁蛋白的热诱变峰值，通过图谱可以明确，铁饱和 型乳铁蛋白的热稳定性最高，其次为常态乳铁蛋白，缺铁型乳铁蛋白热稳定性最低。 21 3 热处理对牛乳铁蛋白样品铁饱和度的影响 3.1引言 天然乳铁蛋白分子的主体是一个相对分子质量约为 80kDa 的单肽链，分别在分子的 N- 端和 C-端形成 2 个环状结构，且在内部隙缝处都有一个铁结合位点。因此每个乳铁蛋白分 子可以结合两个铁离子，除此之外也可以结合两个亚铁离子或铜、锰等离子。但是天然乳铁 蛋白的铁结合度在 15%-20%之间，并且对铁有着很强的亲和能力[63]。因此，乳铁蛋白可根 据铁结合度的不同分为铁饱和型乳铁蛋白(Holo-Lf)和缺铁型乳铁蛋白(Apo-Lf)[64]。天 然乳铁蛋白(Native-Lf)呈粉红色，且颜色随着铁饱和度的增加而变深，缺铁型乳铁蛋白几 乎是无色的粉末状。Apo-Lf在酸性条件下非常稳定，在 pH=4，90?条件下加热 5min，铁结 合能力和抑菌特性基本无变化[65]。已有研究证实，缺铁型乳铁蛋白的热稳定低于铁饱和型乳 铁蛋白，失活速率也比铁饱和型快。三种不同结合态的乳铁蛋白抗巴氏杀菌热变性的能力依 次是铁饱和型乳铁蛋白强于常态乳铁蛋白强于缺铁型乳铁蛋白，因此铁饱和型乳铁蛋白和缺 铁型乳铁蛋白在二级结构上稍有不同[66]。缺铁型乳铁蛋白的结构呈完全开放式，铁饱和型乳 铁蛋白的结构则相对紧密。同样已有研究证实:缺铁型乳铁蛋白的失活速率比铁饱和型快， 并且乳铁蛋白的热稳定性随着铁饱和程度的增加而增加。铁饱和型的抗巴氏杀菌热变性能力 强于缺铁型乳铁蛋白[67]。 本实验目的在于考察 pH=7.2 条件下，以常态乳铁蛋白为参照，铁饱和型乳铁蛋白和缺 铁型乳铁蛋白两种不同铁饱和度的乳铁蛋白在在 60?，65?，70?，80?，90?加热 5min 条件下铁饱和度的变化情况，与促成骨细胞增殖活性结果结合起来，阐述在加热后乳铁蛋白 铁含量的变化情况与其活性功能的关系。 3.2材料与方法 实验材料 3.2.1 铁饱和型乳铁蛋白(Holo-Lf)，自制;缺铁型乳铁蛋白(Aplo-Lf)，自制; μl离心管若干，购于 纯化后常态乳铁蛋白(Native-Lf)，自制，纯度为 90%;1,5ml，10 22 烟台大学硕士学位论文 哈尔滨伊世达公司;96 孔板，美国 Costar 公司;冰袋。 实验试剂 3.2.2 表 3-1 实验试剂 Tab.3-1 Reagents used in the experiment 试剂名称 纯度 生产厂家 Sigma 丙烯酰胺 电泳级. Sigma 甲叉双丙烯酰胺 电泳级. Sigma A.R. Tris 十二烷基硫酸钠(SDS) Sigma A.R. Sigma 过硫酸铵 A.R. Amresco TEMED 四甲基乙二胺 A.R. Sigma 甘氨酸 A.R. 巯基乙醇 A.R. Amresco 考马斯亮蓝 R-250 A.R. Sigma 天津市广成化学试剂有限公司 甲醇 A.R. 天津市大茂化学试剂厂 冰醋酸 A.R. A.R. Fermentas Marker 实验仪器及设备 3.2.3 表 3-2 实验仪器及设备 Tab.3-2 Instruments used in the experiment 仪器名称 产地 YC-1 型层析试验柜 北京博医康实验仪器有限公司 DHG-9245A 型电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科技有限公司 DK-S26 电热恒温水浴锅 上海精密实验设备有限公司 MILLIQ-A MILLIPORE超纯水纯化系统 密理博中国有限公司 BS124S 型电子天平 梅特勒,托利多公司 23 烟台大学硕士学位论文 LUBY 电磁炉 东莞电磁炉有限公司 BIO-RAD PROTEAN IEF 电泳仪 美国 Bio-Rad 公司 ChemiDoc XRS 凝胶成像仪 美国 Bio-Rad 公司 UV-5100 型分光光度计 上海元析仪器有限公司 AAnal 型原子吸收光谱仪 美国 PerkinElmer 公司 550 型酶标仪 美国 BIO-TEK公司 实验方法 3.2.4 3.2.4.1 三种不同结合态乳铁蛋白加热前铁饱和度的测定 因为 1%(W/W)铁饱和型乳铁蛋白在 A465 处吸光度值为 0.57[68]，则有: 铁结合能力=A465?0.57×100% ?，65?，70?，80?， 通过 DSC 示差扫描量热以检测图谱，确定乳铁蛋白加热温度为 6090?，各 5min。分别称取已冻干的三种不同结合态的乳铁蛋白粉 0.2g，配制成浓度为 1%的 蛋白溶液 20ml。每组以超纯水的吸光度值为零点，通过 UV-5100 型分光光度计在 465nm处 测吸光度值，每个样品进行三次重复。 3.2.4.2 三种不同结合态乳铁蛋白加热后铁饱和度的测定 以一种结合状态的乳铁蛋白为一组，把所有样品分为三组，每组 5个样品，将样品分别 溶于超纯水中。分别向每只 1.5ml 离心管中加入 100μl 不同结合态的乳铁蛋白样品，放入 60?，65?，70?，80?，90?的水浴锅中加热 5min，取出后插入冰袋中迅速冷却。待样 品冷却后，分别将不同饱和度，不同加热温度的蛋白样品注入 96 孔板中，测定吸光度。用 Gen 5 软件系统分析，本实验重复三次，平均值。 24 烟台大学硕士学位论文 3.3结果与分析 样品加热前铁饱和度测试结果与分析 3.3.1 表 3-3 三种结合态乳铁蛋白加热前吸光度值和铁饱和度 Tab.3-3 Absorbance value and iron saturation of three different kinds of Lf before heating Lf 吸光度平均值 铁饱和度(,) Native-Lf 0.0873 15.32 Holo-LF 0.508 89.10 Apo-LF 0.0213 3.73 -3可知，常态乳铁蛋白(native-Lf)吸光度为 0.0873，铁饱和度为 15.32%。铁饱 由表 3 和型乳铁蛋白(Holo-Lf)吸光度为 0.508，铁饱和度为 89.10%，理论意义上说，铁饱和度高 于 85%的乳铁蛋白即为铁饱和型乳铁蛋白。本研究重复 6 次后也无法做到百分之百饱和，其 原因可能与样品纯度有关，也可能与蛋白二级结构有关，有待于进一步进行蛋白结构分析。 缺铁型乳铁蛋白的吸光度值为 0.0213，铁饱和度为 3.73%，根据文献记载，铁饱和度低于 5% 的即为缺铁型乳铁蛋白。 样品加热后铁饱和度测试结果与分析 3.3.2 表 3-4 三种结合态乳铁蛋白加热后吸光度值 Tab.3-4 Absorbance value of three different kinds of Lf after heating 60? 65? 70? 80? 90? 0.504 0.506 0.503 0.5 0.499 N-Lf 0.507 0.506 0.504 0.501 0.498 0.508 0.504 0.502 0.503 0.498 平均值 0.506 0.505 0.503 0.501 0.498 0.0847 0.0843 0.0847 0.0787 0.0767 0.0849 0.0845 0.0844 0.0788 0.0764 H-Lf 0.0851 0.0846 0.0851 0.0786 0.0766 平均值 0.085 0.084 0.084 0.079 0.076 0.0214 0.201 0.019 0.0167 0.0149 25 烟台大学硕士学位论文 0.0211 0.206 0.0198 0.0167 0.0151 A-lf 0.0214 0.0202 0.0196 0.0164 0.0151 平均值 0.0213 0.0203 0.0195 0.0167 0.0150 表 3-5 加热后三种乳铁蛋白铁饱和度 Tab.3-5 Iron saturation of three different kinds of Lf after heating 未加热 单位为% 60? 65? 70? 80? 90? 15.32 14.89 14.82 14.81 13.81 13.43 N-Lf 89.1 88.83 88.66 88.25 87.95 87.43 H-Lf 3.73 3.71 3.50 3.42 2.91 2.63 A-Lf 由表 3-4和表 3-5 可知，常态乳铁蛋白在未加热条件下铁饱和度为 15.32%，当加热温度 上升到 80?时，铁饱和度明显降低，变为 13.08%，加热温度为 90?时，铁饱和度为 13.42%， 与未加热时相比较，铁饱和度降低了约 2%。铁饱和型乳铁蛋白未加热时铁饱和度为 89.10%， 随着加热温度的升高铁饱和度缓慢降低，当加热温度为 90?时，铁饱和度降低了约 1.5%， 达到 87.43%，但铁饱和度仍相对较高，为铁饱和型乳铁蛋白。缺铁型乳铁蛋白在未加热状 态下的铁饱和度为 3.73%，符合缺铁型乳铁蛋白的制作要求，加热后，在 70?之前的样品吸 光度基本无变化，只有在加热到 80?时，吸光度明显降低加热到 90?时，铁饱和度降低约 1%。 因此可以推断，常态乳铁蛋白在 pH=7.2 条件下加热温度为 70?时，吸光度值明显减少， 说明在 70?条件下加热 5min，铁饱和度为 15.32%的常态乳铁蛋白会迅速失铁，铁结合能力 明显下降，铁饱和度降低，但是，直到加热到 90?时，常态乳铁蛋白的铁饱和度也未达到 缺铁型乳铁蛋白的制作要求。铁饱和型乳铁蛋白随着加热温度的升高，铁饱和度稍有降低， 但变化幅度较小，铁饱和度仍然很高。缺铁型乳铁蛋白在 80?左右加热 5min，热稳定性下 降，铁饱和度明显降低，铁离子的损失较大，但应考虑到的是，缺铁型乳铁蛋白未加热时铁 饱和度为 3.73%，基本没有铁离子可以失去。可以考虑下一步实验增加对各样品的铁结 合能力的测定。 3.4本章小结 本实验选用自行分离提纯的乳铁蛋白及自制的铁饱和型和缺铁型三种乳铁蛋白为研究 对象，通过测定吸光度值，结合公式的计算，测定它们在加热前的铁饱和度。以此为参照， 26 烟台大学硕士学位论文 选取五组不同加热温度处理 5min 后的样品进行吸光度值的测定，同样计算出铁饱和度值。 通过比较铁饱和度的变化情况从而确定热处理对三种乳铁蛋白铁饱和度的影响。通过酶标仪 的测定，运用 Gen 5 软件进行分析得出，铁饱和型乳铁蛋白受热后铁饱和度基本无变化，80? 加热 5min 条件下，常态乳铁蛋白呈现失铁现象，缺铁型乳铁蛋白在 80?加热条件下铁饱和 度降低也较为明显，但值得注意的是，由于缺铁型乳铁蛋白自身结合铁离子的量很少，因此， 在不同加热温度下，铁的饱和度无明显变化属于正常现象。 27 4 热处理对牛乳铁蛋白聚合物的影响 4.1引言 现已有研究证实，常态乳铁蛋白在酸性条件下非常稳定，且在 pH=4 下 90?加热 5min 条件下铁结合能力几乎无变化。但乳铁蛋白的抑菌活性与 pH 条件密切相关，在中性 pH 条 件下，常态乳铁蛋白具备较强的活力，当 pH 小于 6 时，蛋白基本无抑菌活力。当体系的 pH 为 7.4 时，常态乳铁蛋白的抑菌活性明显强于 pH 为 6.8 时。本实验以 DSC 图谱结果为依据， 本实验考察了三种不同结合态乳铁蛋白在 60?，65?，70?，80?，90?加热 5min 条件下 热诱变峰值发生的变化，进而考察热处理对蛋白结构早成的影响，考察发生热聚合或热分解 现象时的温度[69]。本实验选用五种不同加热温度处理后的三种结合态乳铁蛋白为研究对象 (18 个样品，三组，每组 6 个样品)，体系 pH 为 7.2，使其活性达到较强程度热聚合现象通 过两个实验手段进行分析，分别为 SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白浓度的测定。样 品选取 1%浓度的蛋白，10μl上样量，进行同组间不同温度的横向比对，不同组间相同温度 处理的纵向比对，进而说明乳铁蛋白发生热聚集或热分解现象。每种蛋白以加热前的样品为 参照，通过电泳条带分析，考察在何种温度下蛋白条带发生变化。蛋白浓度的测定为:加热 后的蛋白样品进行 5000g 离心 5min 的处理，若有蛋白聚集现象，则会沉降在离心管底部， 提取上清液通过酶标仪测定其吸光度值时，蛋白浓度会有所降低。三次平行取平均值。 4.2材料与方法 实验材料 4.2.1 铁饱和型乳铁蛋白(Holo-Lf)，自制;缺铁型乳铁蛋白(Apo-Lf)，自制; 纯化后常态乳铁蛋白(Native-Lf)，自制纯度为 90%;1.5ml，10ml 离心管若干，购于哈 尔滨伊世达公司;1000μl、200μl、10μl 移液枪，eppendorf 公司;枪头若干，哈尔滨伊世达 公司;烧杯;试管;吸量管;漏斗;滤纸;96孔板，美国 Costar 公司。 28 烟台大学硕士学位论文 实验试剂 4.2.2 表 4-1 实验试剂 Tab.4-1 Reagents used in experiment 试剂名称 纯度 生产厂家 Sigma 丙烯酰胺 电泳级. 电泳级. 甲叉双丙烯酰胺 Sigma Sigma Tris A.R. Sigma 十二烷基硫酸钠 A.R. Sigma 过硫酸铵 A.R. Amresco A.R. TEMED 四甲基乙二胺 Sigma 甘氨酸 A.R. 巯基乙醇 A.R. Amresco A.R. Sigma 考马斯亮蓝 R-250 天津市广成化学试剂有限公司 甲醇 A.R. 天津市大茂化学试剂厂 A.R. 冰醋酸 A.R. Fermentas Marker 标准胎牛血清白蛋白 A.R. Amresco 天津市广成化学试剂有限公司 A.R. 95%乙醇 天津市广成化学试剂有限公司 A.R. 85%浓磷酸 A.R. 考马斯亮蓝 G-250 Sigma 实验仪器及设备 4.2.3 表 4-2 实验仪器及设备 Tab.4-2 Instruments used in experiment 仪器名称 产地 YC-1 型层析试验柜 北京博医康实验仪器有限公司 DHG-9245A 型电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科技有限公司 DK-S26 电热恒温水浴锅 上海精密实验设备有限公司 29 烟台大学硕士学位论文 MILLIQ-A MILLIPORE超纯水纯化系统 密理博中国有限公司 BS124S 型电子天平 梅特勒,托利多公司 LUBY 电磁炉 东莞电磁炉有限公司 BIO-RAD PROTEAN IEF 电泳仪 美国 Bio-Rad 公司 ChemiDoc XRS 凝胶成像仪 美国 Bio-Rad 公司 TGL-16LG 型离心机 湖南星科科学仪器有限公司 UV-5100 型分光光度计 上海元析仪器有限公司 QT-1 旋涡混合器 上海琪特分析仪器有限公司 550 型酶标仪 美国 BIO-TEK公司 实验方法 4.2.4 4.2.4.1 电泳溶液的配制及样品的处理(表 4-3，4-4) 表 4-3 聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液的配制方法 Tab.4-3 SDS-PAGE gel Solution preparation 试剂 30%聚丙烯酰胺贮液 1.5mol/L Tris 碱 pH8.8 0.5mol/L Tris 碱 pH6.8 10% SDS 名称 丙烯酰胺 150g Tris 碱 90.75g Tris 碱 12g SDS10g 甲叉双丙烯酰胺 4g MilliQ 水 400ml MilliQ 水 120ml MilliQ 水 100ml 配置 MilliQ 水 500ml 方法 用 1mol/L HCl 调 pH至 用 1mol/L HCl 调 pH至 8.8，加 MilliQ 水定容至 6.8，加 MilliQ 水定容至 混匀后，室温保存 滤纸过滤后，棕色瓶 500ml。4?冰箱保存。 200ml。4?冰箱保存。 4?冰箱保存 试剂 2×SDS-PAGE 上样缓冲 SDS 10g 10% Ap 名称 液 0.5M pH6.8 Tris 碱 用 MilliQ 水定容至 1L， Ap 0.1g 2.0ml 4?冰箱保存 MilliQ 水 1ml 10% SDS4.0ml SDS 10g 溶解后，4?冰箱保 用 MilliQ 水定容至 1L， 甘油 2.0ml 配置 存。 4?冰箱保存 方法 1%溴酚蓝 0.05ml 10% Ap SDS 10g 用 MilliQ 水定容至 1L， MilliQ 水定容至 10ml 4?冰箱保存 DTT 0.154g(用时现加) 30 烟台大学硕士学位论文 表 4-4 10ml 分离胶和 4ml浓缩胶的配制方法 Tab.4-4 Method of preparation of 10ml separating gel solution and 2ml stacking gel solutio n 分离胶(10ml，12%) 浓缩胶(4ml，5%) 试剂 双蒸水/ml 3.3 2.1 4 0.67 30%聚丙烯酰胺溶液/ml 1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8)/ml 2.5 - 0.5mol/L Tris-HCl(pH6.8)/ml - 0.5 10%(W/V)SDS/ml 0.1 0.04 10%(W/V)过硫酸铵溶液/ml 0.1 0.04 TEMED/ml 0.004 0.004 依据 DSC 测定结果，选取加热温度为 60?，65?，70?，80?，90?。将自制的三种 结合态乳铁蛋白配制成蛋白浓度为 1%的溶液，分别取上述样品 20μl于离心管中，放置于上 述不同温度的水浴锅中加热 5min，取出后迅速冷却。 4.2.4.2 SDS-PAGE 凝胶电泳的操作方法 将玻璃板洗净、晾干、固定。根据乳铁蛋白分子量配制浓度为 12%的分离胶。将分离胶 注入玻璃板夹层中，上部用 MilliQ 水封面，保持胶面平整，待分离胶聚合后，配制浓缩胶。 配制好浓缩胶后，倒去分离胶表面的少量水分，然后灌入浓度为 5%的浓缩胶，插入点样梳。 将冷却后的样品分别加入等体积 2×SDS-PAGE 上样缓冲液，同 marker 一起在 100?水浴锅 中煮沸 5 min 后，插入冰水浴中冷却，待加样。 在电泳槽中加入 600ml 电极缓冲液后，小心拔去上样梳，然后用注射器洗干净加样孔， 检查一下电路连通状况(注意正负极)，然后关闭电源。用微量加样器分别吸取待分析样品 10ul。加样完毕后，接通电源，起始时用的低电流或低电压，待样品在浓缩胶部分浓缩成一 条线后，再加大电流(或电压)，待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。 电泳结束 后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以作记号。脱色液的配制是甲醇:乙酸:水 =227:37:236。染色液的配制方法为:称取 R-250 考马斯亮蓝 0.15g，加入 500ml脱色液。染 色 4h 后脱色 12h，凝胶成像仪拍摄凝胶图片，用 Quantity One 软件进行分析。 31 烟台大学硕士学位论文 4.2.4.3 三种不同结合态 LF蛋白浓度的测定 将标准胎牛血清白蛋白配制成 0.1mg/ml 的溶液称取 0.1g 考马斯亮蓝 G-250，溶于 95% 乙醇溶液 50ml中，再加入 85%的浓磷酸 100ml，用水稀释至 1000ml，混匀，备用; 在酸性溶液中染料考马斯亮蓝 G-250 与蛋白质结合，此时考马斯亮蓝 G-250 颜色从红色 变为蓝色，吸收高峰从 465nm 移至 595nm，利用这个原理可测定蛋白浓度。标准曲线的绘 制方法见表 4-5 表 4-5 标准曲线的绘制方法 Tab.4-5 Standard curve method 管号 0 1 2 3 4 5 标准蛋白溶液/ml 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 水/ml 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 染料溶液/ml 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 按表 4-5分别向各种试管中加入相应试剂，充分混匀，反应 5min 后在波长 595nm处以 0 号试管调零点。测定各管吸光度值 A，以吸光度值为纵坐标，蛋白浓度为横坐标绘制标准 曲线。 取 200μl样品溶液，蛋白浓度为 100μg/ml，加入染料溶液 1000μl，20 分钟之内用酶标仪 测定其在 595nm处吸光值，用 Gen 5 软件系统收集数据。每个样品做 5个平行,去掉最大值 和最小值后求平均值。依照标准曲线求得蛋白浓度。 4.3 结果及分析 凝胶电泳结果 4.3.1 由图 4-1可以得出，常态牛乳铁蛋白热稳定性较强。随着加热温度的升高，同样出现了 蛋白聚集的现象，小分子蛋白逐渐消失不见，大分子蛋白条带增粗。加热到 70?时 IgG 蛋 白条带明显增粗，当温度达到 80?和 90?时，这种现象更为明显。说明，常态牛乳铁蛋白 的热稳定性低于铁饱和型乳铁蛋白，蛋白分子发生热聚集温度为 70?左右。 32 烟台大学硕士学位论文 图 4-1 常态乳铁蛋白凝胶电泳图 Fig.4-1 Native-Lf gel electrophoresis 图 4-2 铁饱和型乳铁蛋白凝胶电泳图 Fig.4-2 Holo-Lf gel electrophoresis 33 烟台大学硕士学位论文 图 4-3 缺铁型乳铁蛋白凝胶电泳图 Fig.4-3 Apo-Lf gel electrophoresis 由图 4-2可以看出，铁饱和型乳铁蛋白本身的分子量看不出有变化，但在 marker 分子两 条带 66.2kDa 和 45kDa 之间的杂蛋白条带，随着加热温度的增加而变浅。当加热温度为 90? 时，116kDa 上方的大分子蛋白条带明显增粗，据同课题组研究得出，该蛋白条带为乳中另 一功能性成分 IgG。而 66.2kDa 和 45kDa 之间的杂蛋白条带几乎消失不见。由此可以分析， 随着加热温度的升高，Holo-Lf 发生了热聚集现象，蛋白分子量明显增大，90?时此现象最 为明显。 由图 4-3可以看出，缺铁型乳铁蛋白在加热温度为 60?时，上方 IgG 蛋白条带明显颜色 明显加深，当加热温度为 80?时，此种现象最为明显，且乳铁蛋白条带明显变小，当加热 温度为 90?时，整个蛋白条带颜色都变浅，说明大部分蛋白已受热分解。又图可以推断， 缺铁型乳铁蛋白在 60?加热 5min 条件下已发生热聚合现象，当加热温度为 80?时，蛋白发 生变性。 34 烟台大学硕士学位论文 蛋白浓度的测定 4.3.2 4.3.2.1 蛋白标准曲线 图 4-4 牛血清白蛋白标准曲线 Fig.4-4 Bovine serum albumin standard curve 根据标准曲线得到蛋白浓度见表 4-6，表 4-7，表 4-8 表 4-6 常态乳铁蛋白加热后蛋白浓度测定 Tab.4-6 Determination of protein concentration after heating of Native-Lf 未加热 A595 60? 65? 70? 80? 90? 1 0.278 0.259 0.292 0.296 0.291 0.277 2 0.28 0.259 0.284 0.298 0.288 0.276 3 0.277 0.262 0.288 0.301 0.291 0.278 4 0.277 0.261 0.284 0.3 0.292 0.28 5 0.279 0.258 0.286 0.299 0.291 0.277 6 0.28 0.26 0.291 0.298 0.29 0.275 平均值 0.279 0.260 0.288 0.299 0.291 0.277 35 烟台大学硕士学位论文 表 4-7 铁饱和型乳铁蛋白加热后蛋白浓度测定 Tab.4-7 Determination of protein concentration after heating of Holo-Lf 65? 70? 80? 90? 未加热 60? A595 1 0.248 0.263 0.251 0.26 0.275 0.276 2 0.277 0.246 0.263 0.248 0.256 0.276 0.248 0.26 0.254 0.261 0.274 3 0.278 4 0.278 0.245 0.259 0.254 0.256 0.279 5 0.28 0.246 0.26 0.249 0.257 0.278 6 0.28 0.247 0.261 0.25 0.262 0.274 平均值 0.278 0.247 0.261 0.251 0.259 0.276 表 4-8 缺铁型乳铁蛋白加热后蛋白浓度测定 Tab.4-8 Determination of protein concentration after heating of Apo-Lf 60A595 未加热 ? 65? 70? 80? 90? 1 0.281 0.248 0.25 0.243 0.239 0.259 2 0.259 0.284 0.248 0.247 0.244 0.24 3 0.259 0.279 0.247 0.25 0.244 0.236 4 0.258 0.284 0.247 0.249 0.246 0.235 5 0.261 0.286 0.247 0.248 0.245 0.242 0.259 6 0.283 0.248 0.247 ,0.247 0.241 平均值 0.259 0.283 0.248 0.249 0.244 0.238 根据蛋白浓度标准曲线(图 4-4)，结合三种不同铁饱和度乳铁蛋白蛋白在不同温度下， 吸光度值的测定，根据公式 Y=0.0038X+0.0055，其中 Y 为吸光度值，X 为蛋白浓度，计算 出的蛋白浓度见表 4-9: 表 4-9 蛋白浓度值 Tab.4-9 Protein concentration 未加热(mg/ml) 60? 65? 70? 80? 90? 66.97 74.34 77.24 75.13 71.45 N-Lf 71.97 H-lf 71.71 63.55 67.24 64.61 66.71 71.18 A-Lf 66.71 73.02 63.82 64.079 62.76 61.18 由表 4-9可以看出，常态乳铁蛋白未加热时蛋白浓度为 71.97mg/ml，当加热温度为 70? 36 烟台大学硕士学位论文 时，蛋白浓度呈现最大值为 77.24mg/ml，随着加热温度的继续升高，蛋白浓度逐渐降低，重 新回到 71.45mg/ml，说明常态乳铁蛋白在 70?加热 5min 条件下，蛋白发生水解现象，降解 为小分子蛋白质，加热温度升高之后，聚集的蛋白出现水解，但是蛋白总量并无变化，由此 可见，常态乳铁蛋白在 pH=7.2 条件下是比较稳定的，其功能性有待下一章进行继续考察， 考察重点为 70?和 90?。铁饱和型乳铁蛋白未加热条件下，蛋白浓度为 71.71mg/ml，较常 态乳铁蛋白略有下降，但并不显著。当加热温度为 60?时，蛋白浓度开始降低，说明在此温 度下离心过程中，由铁结合的较大蛋白分子已经沉降，但随着加热温度的升高，蛋白浓度回 升，加热温度为 90?时，蛋白浓度回到 71.18mg/ml，总体蛋白含量变化极小，由此可以推 断，随着加热温度的升高，铁饱和型乳铁蛋白蛋白分子发生部分水解，重新水解为小分子蛋 白，这也解释了在 SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳图片中，铁饱和型乳铁蛋白分子条带无显 著变化的原因。未加热条件下缺铁型乳铁蛋白的蛋白浓度为 66.71mg/ml，明显小于常态乳铁 蛋白和铁饱和型乳铁蛋白，一旦开始加热，缺铁型乳铁蛋白的蛋白浓度就上升为 73.02mg/ml， 高于其他两种蛋白未加热时的蛋白浓度，说明缺铁型乳铁蛋白对热及其敏感，易发生蛋白水 解现象，加热温度升高时，蛋白浓度也随之降低，缺铁型乳铁蛋白聚集为大分子蛋白，沉降。 加热温度为 90?时，蛋白浓度最低，为 61.18mg/ml，约 10%的蛋白发生热聚集现象。 4.4本章小结 SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示，常态乳铁蛋白在加热温度为 70?时开始发 生热聚集现象，并且蛋白含量开始降低。铁饱和型乳铁蛋白热稳定性最佳，加热 90?时发 生轻微热聚集现象。缺铁型乳铁蛋白在加热温度为 70?时也发生热聚集现象，且比常态乳 铁蛋白现象明显，蛋白含量也最低。由此可以推断出，缺铁型乳铁蛋白极易发生热聚集现象， 加热后蛋白浓度降低，其次为常态乳铁蛋白，铁饱和型乳铁蛋白只在 90?时发生热聚集， 蛋白含量稍有降低。 蛋白浓度测定显示，常态乳铁蛋白在 70?时开始不稳定，发生蛋白质水解现象，但随 着温度的升高，水解的小分子蛋白又重新聚集，最终蛋白浓度基本无变化。铁饱和型乳铁蛋 白在加热温度为 60?时就发生蛋白分子热聚集现象，加热温度升高后，已经聚集的大分子 蛋白发生水解，总体蛋白浓度无变化。缺铁型乳铁蛋白在加热温度为 60?时就发生蛋白水 解现象，加热温度升高后，缓慢发生热聚集现象，加热温度为 90?时，蛋白浓度为最低， 热聚集现象最明显。 37 烟台大学硕士学位论文 将 SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析结果和蛋白浓度测定值相结合发现，常态乳铁 蛋白较稳定，蛋白变性温度为 70?左右，铁饱和型乳铁蛋白热稳定性最强，90?时蛋白稍 有变性，缺铁型乳铁蛋白对热最为敏感，加热温度为 60?处理 5min 条件下即发生蛋白水解 现象。 38 5 热处理对牛 LF 促成骨细胞增殖活性影响的研究 5.1 引言 婴儿配方奶粉是一种十分特殊的食品，其营养成分和质量显得格外重要。从进化的角度 讲人乳是最完善的天然食品，含有婴儿早期发育的全部营养，被认为是配方奶粉的最佳参照 标准。牛乳在成分上和营养功能上与人乳最为接近，也是目前婴儿配方奶粉的主要原料。乳 铁蛋白是乳中等电点处于碱性范围内的一种碱性蛋白，虽然在乳中含量甚微，但对于婴儿的 发育具有极为重要的生理活性功能，例如有促进人体成骨细胞增殖和调节破骨细胞的功能， 并且可以增强免疫力和促进骨骼发育等，因此也成为目前国际上研究的热点。 婴幼儿配方奶粉在生产过程中，牛乳需经过多个热处理过程。如原料乳的热杀菌、真空 浓缩、喷雾干燥等等。在热处理过程中，牛乳铁蛋白的活性必将不同程度地受到影响，但目 前国内外相关研究很少，几乎是空白。所以为了更好地以人乳为参照、 牛乳为原料， 开发 婴幼儿配方粉，有效控制工艺参数，最大限度地发挥牛乳铁蛋白的生理活性，研究热处理过 程中温度——时间效应的影响具有重要意义。 本研究选取自制不同饱和度的乳铁蛋白样品，进行五种不同温度 5min 的热处理后，通 过 MTT 法检测受热后的三种乳铁蛋白对促成骨细胞增殖活性的影响是否有变化。 5.2 材料与方法 实验材料 5.2.1 2d 龄 Wister 大鼠 10 只，哈尔滨医科大学附属第二医院;平板 2 个，160?干热灭菌 2h 后备用;手术用剪刀，160?干热灭菌 2h 后备用;镊子，160?干热灭菌 2h后备用;试剂瓶 5 个，160?干热灭菌 2h 后备用;10ml、5ml、2ml 离心管若干，121?湿热灭菌 30min 后备 用;0.22μm 微孔滤膜;细胞培养瓶，哈尔滨伊世达公司;螺口瓶，哈尔滨伊世达公司;容 量瓶，100ml;封口膜;1000μl移液枪，德国 eppendorf公司;枪头若干，哈尔滨伊世达公司， 121?湿热灭菌 30min 后备用;96 孔板，美国 Costar 公司; 加热后铁饱和型乳铁蛋白(Holo-Lf)，自制;加热后缺铁型乳铁蛋白 Aplo-Lf)，自制; 加热后常态乳铁蛋白(纯度为 90%，native-Lf)，自制;MTT 染色试剂盒，南京建成生物研 39 烟台大学硕士学位论文 究所; 实验试剂 5.2.2 表 5-1 实验试剂 Tab.5-1 Reagents used in experiment 试剂名称 纯度 生产厂家 标准胎牛血清白蛋白 A.R. Amresco 天津市广成化学试剂有限公司 95%乙醇 A.R. 天津市广成化学试剂有限公司 85%浓磷酸 A.R. 考马斯亮蓝 G-250 A.R. Sigma 胎牛血清 杭州四季青 A.R. 胰蛋白酶 A.R. Sigma ?型胶原酶 A.R. Sigma 青霉素(10000IU/ml) 美国 Gibco 公司 A.R. 链霉素(10000μg/ml) 美国 Gibco 公司 A.R. α-MEM培养液 A.R. Hyclone 噻唑蓝(MTT) 美国 Gibco 公司 A.R. PBS 缓冲液(不含钙、镁离子， A.R. 美国 Gibco 公司 pH7.2) 无水乙醇 天津市广成化学试剂有限公司 A.R. 苏木精 A.R. 美国 Gibco 公司 天津市广成化学试剂有限公司 冰醋酸 A.R. 天津市广成化学试剂有限公司 硫酸铝钾 A.R. 天津市广成化学试剂有限公司 碘酸钠 A.R. 天津市广成化学试剂有限公司 甘油磷酸钠 A.R. 巴比妥钠 美国 Gibco 公司 A.R. 天津市大茂化学试剂厂 氯化钙 A.R. 天津市大茂化学试剂厂 硝酸钴 A.R. 天津市大茂化学试剂厂 硫化铵 A.R. 天津市广成化学试剂有限公司 硫酸镁 A.R. 伊红 美国 Gibco 公司 A.R. 天津市大茂化学试剂厂丙酮 A.R 40 烟台大学硕士学位论文 天津市广成化学试剂有限公司 二甲苯 A.R. 5.2.3 实验仪器及设备 表 5-2 实验仪器及设备 Tab.5-2 Instruments used in experiment 仪器名称 产地 OLYMPUS 倒置式生物显微镜 NIKON YC-1 型层析试验柜 北京博医康实验仪器有限公司 TGL-16LG 型离心机 湖南星科科学仪器有限公司 LDZX-40CI 型立式自动电热压力灭菌锅 上海申安医疗器械厂 RLPHR1-4 型 冻干机 德国 Marin Christ 公司 DHG-9245A 型电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科技有限公司 GL-10LM型离心机 星科离心机有限公司 无菌操作台 苏州净化设备有限公司 202-3A型电热恒温干燥箱 上海新诺仪器设备有限公司 DK-S26 电热恒温水浴锅 上海精密实验设备有限公司 DHP-9272 型电热恒温培养箱 上海一恒科技有限公司 YS100 型显微镜 Nikon UV-5100 型分光光度计 上海元析仪器有限公司 MILLIQ-A MILLIPORE超纯水纯化系统 密理博中国有限公司 BS124S 型电子天平 梅特勒,托利多公司 550 型 酶标仪 美国 BIO-TEK公司 实验方法 5.2.4 5.2.4.1 小鼠成骨细胞的分离培养及鉴定 胎牛血清 56?灭活 30min，在无菌操作台中分装成 5ml/管，用封口膜密封，于-20?保 存。胰蛋白酶在无菌操作台中分装为 2ml/管，密封后-20?保存。取 90mlα-MEM 与 10ml 胎 41 烟台大学硕士学位论文 牛血清混合于螺口瓶中，加入 1ml 双抗，备用。用 PBS 缓冲液溶解?型胶原酶，在 100ml 容量瓶中定容后在无菌操作台中用 0.22 微孔滤膜除菌,分装成 5ml/管，-20?保存。选取新生 2d 龄(72 小时以内)Wister 大鼠，引颈处死，置于 75%酒精中浸泡 10min，取出后置于盛 有 PBS 的平板中，剪开头顶皮肤取出颅盖骨，放入新鲜 PBS 中去除骨膜及周围结缔组织， 剪成 0.1mm3 大小的骨片，移入离心管中加入 2ml 0.25%胰蛋白酶 37?消化 30min，去除掉 骨片上残余的结缔组织，1000r/min 离心 5min 除酶，然后将骨片移入?型胶原酶中震荡消化 90min，弃去骨头，将细胞上清液 1000r/min 离心 10min，此时成骨细胞已沉降在离心管底部， 加入 3mlα-MEM 培养液，用移液枪反复吸吹数次，确保沉淀的细胞都已悬浮于培养液中， 将此带有细胞的培养液全部转入培养瓶中，于显微镜下观察是否有细胞，确认细胞已成功转 入培养瓶后，瓶口旋松一环放入 37?培养箱中培养，即获得原代细胞。接种 24h 后弃去悬 浮细胞，每隔 2-3d 更换培养液 1 次。逐日用倒置相差显微镜观察细胞形态及生长状况，当 细胞融合成单层，即进行传代。 传代方法如下[70]:吸去培养液，用 PBS 溶液清洗 1 次，加 0.25%胰蛋白酶 1ml，镜下观 察 2-3min 后见细胞皱缩，间距加大，分离为单个小圆细胞时，立即吸出酶液，加 2ml含 10% 胎牛血清的 a-MEM 培养液，然后吹打、悬浮细胞，将细胞悬液吸出分装至 2 个培养瓶中， 每瓶 1ml上述细胞悬液，每培养瓶再加入含 10%胎牛血清的 a-MEM 培养液 3ml混匀，将培 养瓶置于细胞培养箱中培养进行 HE 染色 [71]。HE 染色即为苏木精 — 伊红染色法 ( hematoxylin-eosin staining ) ，简称 HE 染色法，染色方法如下:取出在 6 孔板中预先置入的 已生有成骨细胞的载玻片中，用 PBS 液洗 3 次，每次 1~2 min;将载玻片浸入 10%中性福尔 马林溶液固定 15~20 min;PBS 液洗 2 次，每次 1 min;入苏木精染色液，染色 5-10 min;再 经自来水浸洗数秒后浸入 1%稀盐酸酒精溶液进行分色，数秒即可(稀盐酸酒精溶液:用 75% 酒精配制 1%的盐酸);重复用自来水浸洗数秒，进行伊红染色 5~l0 min;用自来水浸洗载玻 片上的浮色;95%酒精 2 次和 100%酒精 3次逐级脱水，每次 l min;浸入二甲苯 2 次，每次 1min;滴上中性树胶，将有细胞的一面向下固定于在载玻片上，镜下观察照相。 5.2.4.2 成骨细胞的鉴定 碱性磷酸酶(ALP)染色法[72]。本实验采用钙钴法，其原理为，磷酸酯酶能够分解磷酸 酯，用磷酸酯为底物，其相应磷酸酯释放出磷酸基，在碱性条件下，磷酸基和钙盐发生反应， 形成磷酸钙。因为磷酸钙无色，所以必须使其变成磷酸钴，再和黄色硫化铵作用生成硫化钴 的黑色沉淀。具体操作方法为:取第三代的细胞为材料，步骤如下:首先将无菌盖玻片放入 42 烟台大学硕士学位论文 6 孔板中，待细胞生长过半时汇合状态取出;将取出的细胞用 PBS 缓冲液冲洗后用冷丙酮固 定 10min，蒸馏水冲洗数次。放入孵育液，37?孵育 4-6h，取出后用蒸馏水冲洗数次。最后 用 2%硝酸钴染色 3-5min，蒸馏水中洗数次后放入 1%新配硫化铵中 2min，蒸馏水冲洗，自 然干燥，封固。在镜下观察。 5.2.4.3 MTT 法检测成骨细胞增殖活性[73] 本实验采用 MTT 法，步骤如下: 在第二代成骨细胞长满培养瓶壁后，用 0.25%胰酶消化约 2min，用含 10%胎牛血清 α-MEM 培养液配制成单细胞悬液，以每孔 5×104个细胞接种于 96 孔培养板，共 2 块 96 孔 板。每孔含细胞悬液 100μl，置于含 5% CO2的 37?细胞培养箱中培养。培养 24h 后成骨细 胞贴壁。细胞分为以下 6 组，记为不加热,60?,65?,70?,80?,90?。每组 6 复孔，每孔加 入三种不同结合态的乳铁蛋白浓度溶液 5μl。加蛋白后开始计时。 乳铁蛋白样品溶液是用 0.01mol/L PBS 配制，并经 0.22μm膜过滤除菌，0 组加入细胞培 养液。两块板分别在反应的第 44h(第 48h 时测定吸光值，MTT 在测定前 4h 加入)时加入 MTT，每孔加 0.5mg/ml MTT 10ul，100μl乳铁蛋白浓度为 100μg/L，37?继续培养 4h，4h 后终止培养后，小心的吸去培养液，每孔加入 DMSO 150μl，振荡 10min，使结晶物溶解。 用 550 型酶标仪在 490nm波长下检测，测定各孔的光吸收值，记录结果。 43 烟台大学硕士学位论文 5.3结果与分析 成骨细胞的分离培养 5.3.1 图 5-1 倒置显微镜 250×下观察细胞形态 Fig.5-1 Cell morphology was observed under the inverted microscope 250 × 倒置显微镜下观察可知，细胞形态不规则，多层三角形、多角形，有较多突起，胞质丰 富、清晰。生长期细胞突起互相连接，汇合时细胞层铺石状(图 5-1)。 传代后经胰蛋白酶作用细胞倒置显微镜观察如图 5-2 44 烟台大学硕士学位论文 图 5-2 经过胰蛋白酶消化后细胞 Fig.5-2 After trypsin digestion of cell 由图 5-2可知，经过胰蛋白酶消化细胞后，细胞皱缩变圆 图 5-3 经 HE 染色后细胞形态图，显微镜下 100× Fig.5-3 Cell morphology diagram by HE stained, under the microscope 100× 45 烟台大学硕士学位论文 图 5-4 经 HE 染色后细胞形态图，显微镜下 400× Fig.5-4 Cell morphology diagram by HE stained, under the microscope 400× 由图 5-3 和 5-4所示，细胞密集区，细胞呈三角形，有较长的细胞间胞突，细胞之间通 过胞突相连接，细胞质呈红色，胞核呈圆形或椭圆形，且染色呈紫色较深，细胞核中含 1-3 个核仁。 46 烟台大学硕士学位论文 成骨细胞的鉴定 5.3.2 图 5-5 成骨细胞的鉴定，倒置显微镜下 250× Fig.5-5 Identification of Osteoblasts, under the inverted microscope 250× 图 5-6 成骨细胞的鉴定，偏振光显微镜下 100× Fig.5-6 Identification of Osteoblasts, under the polarizing microscope 100× 通过图 5-5和 5-6 可以看出，成骨细胞具有分泌碱性磷酸酶功能，功能活跃的成骨细胞 47 烟台大学硕士学位论文 碱性磷酸酶组织化学染色呈阳性反应。由上图中可以看出自制的成骨细胞表现出较强的阳性 反应，镜下观察胞浆中有黑色颗粒或块状沉淀，多密集排列，细胞着色程度深浅不一，黑色 为强阳反应。 四唑盐比色法(MTT)检测促成骨细胞增殖活性 5.3.3 表 5-3 不同饱和度乳铁蛋白与成骨细胞作用后吸光度值 Tab.5-3 Absorbance values of different saturation of Lactoferrin role with Osteoblasts 对照 未加热 60? 65? 70? 80? 90? 0.164 0.321 0.265 0.239 0.201 0.197 0.117 0.171 0.306 0.283 0.228 0.167 0.187 0.137 0.153 0.334 0.253 0.242 0.225 0.222 0.142 N-Lf 0.165 0.323 0.247 0.229 0.153 0.201 0.122 0.163 0.337 0.282 0.214 0.179 0.199 0.141 0.187 0.308 0.277 0.264 0.183 0.225 0.135 0.324 0.22 0.325 0.319 0.315 0.246 0.149 0.314 0.222 0.332 0.311 0.309 0.256 0.176 0.212 0.336 0.315 0.313 0.314 0.19 0.167 0.227 0.324 0.316 0.316 0.316 0.248 0.153 H-Lf 0.313 0.313 0.313 0.257 0.213 0.336 0.179 0.317 0.317 0.317 0.19 0.13 0.224 0.327 0.236 0.275 0.275 0.239 0.187 0.081 0.249 0.239 0.298 0.261 0.228 0.199 0.084 0.246 0.293 0.245 0.234 0.242 0.19 0.084 0.25 0.274 0.286 0.25 0.229 0.198 0.08 0.254 A-Lf 0.237 0.248 0.251 0.214 0.196 0.083 0.25 0.276 0.248 0.254 0.264 0.195 0.084 0.296 本实验检测不同饱和度乳铁蛋白促成骨细胞增殖活性的研究时，选用已经优化的条件， 即为乳铁蛋白浓度为 100μg/ml，在反应的第 44h 加入 MTT，反应的第 48h 时用酶标仪测定 吸光度值。由吸光度值的变化可以大致看出在未加热条件下，常态乳铁蛋白和铁饱和型乳铁 蛋白的促成骨细胞活性都很强，而缺铁型乳铁蛋白则相对较弱。随着加热温度的逐渐升高， 常态牛乳铁蛋白的活性减弱，铁饱和型乳铁蛋白在加热温度为 80?~90?时才出现活性减低 的情况。缺铁型乳铁蛋白在加热温度为 70?时活性显著降低，但加热温度为 90?时，活性 回升，据分析，可能与缺铁型乳铁蛋白水解的小分子蛋白片段具有促成骨细胞增殖活性有关， 48 烟台大学硕士学位论文 具体原因有待下一步分析。 图 5-7 常态乳铁蛋白吸光度值比较 Fig.5-7 Compare the absorbance values ofNative-Lf 图 5-8 铁饱和型如铁蛋白吸光度值比较 Fig.5-8 Compare the absorbance values of Holo-Lf 49 烟台大学硕士学位论文 图 5-9 缺铁型乳铁蛋白吸光度值比较 Fig.5-9 Compare the absorbance values ofApo-Lf 通过 SPSS 18.00 统计软件进行统计学分析，对各组数据进行单因素方差分析，分析差异 显著性。由图 5-7 分析结果显示，常态乳铁蛋白在加热温度为 70?时与对照组有极显著差异 (P<0.01)，在加热温度为 90?时有显著差异(P<0.05)，其他组之间无显著差异(P>0.05)。 通过分析可以得出图 5-8 中，加热温度为 90?时的铁饱和型乳铁蛋白与对照组和其他组间有 极显著差异(P<0.01)，加热温度为 80?条件下的乳铁蛋白与对照组有显著差异(P<0.05)。 其他组别之间无显著差异(P>0.05)。图 5-9 分析结果显示，缺铁型乳铁蛋白在加热温度为 80?条件下与对照组有显著差异(P<0.05)，其他组之前无显著差异(P>0.05)。 MTT 法检测成骨细胞增殖情况结果显示，三种不同铁结合度的乳铁蛋白对成骨细胞均 有增殖活性。常态乳铁蛋白在加热温度为 70?时，活性开始降低，90?时活性最低。铁饱 和型乳铁蛋白在加热温度为 80?时活性开始降低，加热温度为 90?时达到最低值。缺铁型 乳铁蛋白在加热温度为 70?时促成骨细胞增殖活性开始降低，80?时活性最低，但加热温 度上升为 90?时，活性与未加热状态相当。 50 烟台大学硕士学位论文 5.4本章小结 三种乳铁蛋白均对成骨细胞有增殖活性，但活性并不相同，通过分析，常态乳铁蛋 白加热到 70?时活性下降，铁饱和型乳铁蛋白加热温度为 80?时活性开始下降。缺铁型乳 铁蛋白在加热温度为 70?时活性显著下降，但加热温度为 90?时，活性恢复，这可能与缺 铁型乳铁蛋白水解有关。 51 6 总结及展望 6.1 主要结论 本研究成功分离纯化了乳铁蛋白粗品，纯化后乳铁蛋白纯度与 Sigma 公司生产的 90% 纯度标品相当。通过已提纯的常态乳铁蛋白成功制备了铁饱和型乳铁蛋白(Holo-Lf)和缺 铁型乳铁蛋白(Apo-Lf)。运用示差扫描量热仪(DSC)检测这三种乳铁蛋白在未加热情况 下的热诱变峰值。通过 DSC 图谱检测发现，铁饱和型乳铁蛋白的稳定性最好，热诱变峰值 达 70.18?。常态乳铁蛋白稳定性较铁饱和型偏低，并且有两个热诱变峰值，分别为 62.66? 和 69.83?，缺铁型乳铁蛋白的热稳定性最差，热诱变峰值为 62.10?。以 DSC 检测结果为 依据，通过考察这三种乳铁蛋白热变性温度值的不同，对这三种类型的蛋白进行统一时间梯 65?，70?，80?，90?各热处理 5min。对加热后的乳铁蛋白进 度的加热，分别为 60?， 行四方面的检测，铁饱和度，热聚合物，蛋白浓度，和促成骨细胞增殖活性。对加热后的样 品进行吸光度的测定，结果显示，常态乳铁蛋白在 pH=7.2 条件下加热温度为 70?时，吸光 度值明显减少，说明在 70?条件下加热 5min，铁饱和度为 15.32%的常态乳铁蛋白会迅速失 铁，铁结合能力明显下降，铁饱和度降低，但是，直到加热到 90?时，常态乳铁蛋白的铁 饱和度下降约 1%，铁饱和度也未达到缺铁型乳铁蛋白的制作要求。铁饱和型乳铁蛋白随着 加热温度的升高，铁饱和度稍有降低，但变化幅度较小，铁饱和度仍然很高。缺铁型乳铁蛋 白在 80?左右加热 5min，热稳定性下降，铁饱和度明显降低，铁离子的损失较大。将加热 后的样品按照 Bio-Rad 公司的 SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳手册的方法进行电泳操作。 SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示，常态乳铁蛋白在加热温度为 70?时开始发生热 聚集现象，并且蛋白含量开始降低。铁饱和型乳铁蛋白在加热温度为 90?时发生轻微热聚 集现象。缺铁型乳铁蛋白在加热温度为 70?时发生热聚集现象，且比常态乳铁蛋白现象明 显，蛋白含量也最低。由此可以推断出，缺铁型乳铁蛋白极易发生热聚集现象，加热后蛋白 浓度降低，其次为常态乳铁蛋白，铁饱和型乳铁蛋白只在 90?时发生热聚集，蛋白含量稍 有降低。蛋白浓度测定显示，常态乳铁蛋白在 70?时开始不稳定，发生蛋白质水解现象， 但随着温度的升高，水解的小分子蛋白又重新聚集，最终蛋白浓度基本无变化。铁饱和型乳 铁蛋白在加热温度为 60?时就发生蛋白分子热聚集现象，加热温度升高后，已经聚集的大 分子蛋白发生水解，总体蛋白浓度无变化。缺铁型乳铁蛋白在加热温度为 60?时就发生蛋 52 烟台大学硕士学位论文 白水解现象，加热温度升高后，缓慢发生热聚集现象，加热温度为 90?时，蛋白浓度为最 低，热聚集现象最明显。将 SDS-PAGE 凝胶电泳分析结果和蛋白浓度测定值相结合发现， 常态乳铁蛋白较稳定，蛋白变性温度为 70?左右，铁饱和型乳铁蛋白的热稳定性最强，90? 时蛋白稍有变性，缺铁型乳铁蛋白对热最为敏感，加热温度为 60?处理 5min 条件下即发生 蛋白水解现象。 最终结果显示，常态乳铁蛋白在 70?时热稳定性开始降低，铁结合能力下降，发生热 聚集现象，促成骨细胞增殖活性也开始降低。铁饱和型乳铁蛋白最为稳定，在加热温度为 80?~90?之间，铁结合能力稍有所下降，发生轻微水解，加热到 90?是蛋白含量无明显变 化，促成骨细胞增殖活性有所下降。缺铁型乳铁蛋白热稳定性最低，在加热温度为 70?时 铁饱和度下降明显，热聚集现象明显，随后又发生蛋白质水解现象，但其促成骨细胞增殖活 性变化相对较小。 6.2创新点 (1)牛乳是目前婴儿配方奶粉的主要原料，其中乳铁蛋白(Lactoferrin, LF)在婴幼儿 的生长发育过程中发挥着重要作用。然而在目前的婴幼儿配方粉生产中，热处理工艺是必不 可少的。因此，乳铁蛋白活性不同程度的损失，这也是婴幼儿配方粉的产品质量与母乳相差 甚远的重要原因之一。然而，这方面的研究并不系统，缺乏有力的理论数据指导生产实践。 本研究将从机制上阐明热处理的温度和时间效应对乳铁蛋白活性的影响，对于产品开发中选 择恰当的工艺，或有针对性地进行活性保护，提高产品质量，都具有重要的意义和作用。 (2)在牛乳受热的过程中，乳铁蛋白的活性变化受到多种因素的影响，主要体现在体 系的离子强度、乳铁蛋白自身的凝聚以及与其它组分的相互作用等。迄今为止，不但这些方 面的研究缺乏系统性，而且在热处理对乳铁蛋白促进成骨细胞增殖活性影响的研究方面未见 报导。本文自制了不同铁饱和度的乳铁蛋白，考察样品在 pH=7.2 条件下热处理后促成骨细 胞增殖情况，为后续乳铁蛋白的研究提供依据。 6.3展望 我国在乳品成分的功效研究一般都是围绕酪蛋白、 乳脂肪、 乳糖等常规成分，基本没 有开展乳铁蛋白这类非常规成分的研究，目前的零星相关研究报道都缺乏系统性、整体性和 53 烟台大学硕士学位论文 规律性。因此，国家相关政府部门在调查处理蒙牛特仑苏事件、圣元激素风波等事件基本都 是参考国外的相关研究结果和标准，主要原因就是在此研究领域缺少具有我国自主知识产权 的成果和技术。乳铁蛋白的深入研究旨在为我国自主研发以人母乳为参照的婴儿配方奶粉开 发奠定理论基础。 54 参考文献 [1] B. 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