细胞爬片免疫组化

细胞爬片免疫组化 固定液配方(细胞免疫组化，用的是4%多聚甲醛固定的): 我们用的4%多聚甲醛是先配制成12.5%的，然后再用0.1m PB稀释的。 1000ml 0.1m PB配方(PH值7.4) 磷酸氢二钠 48.693g 磷酸二氢钠 5.023g 三蒸水 1000ml 12.5%多聚甲醛(PH值7.4)1000ml 多聚甲醛 125g 三蒸水 1000ml 磁力搅拌器加热搅拌，温度控制在60?以下，如仍不溶，加NaOH (三蒸水先放800ml，10小时左右，再补加200ml) 4%多聚甲醛(PH值7.4)1000ml 12.5%多聚甲醛 320ml 0.1m PB 680ml 步骤: 41 将已消毒的20mm盖玻片置于90mm培养皿中，按2*10/ml的细胞密度将细胞接种于培养 皿中进行细胞爬片，5天后进行免疫细胞组织化学染色鉴定。 2 PBS清洗标本 3次 各 1 min。 3 冰丙酮固定 15 min。 4 空气干燥 5min。 5 PBS清洗标本 3次 各 2 min。 6 0.5%Triton X-100( DPBS配 ) 孵育 1次 20 min。 7 PBS清洗标本 3次 各 2 min。 8 3%H2O2孵育 15 min。 9 DPBS清洗标本 3次 各 2 min。 10 封闭血清孵育(5%正常二抗血清DPBS液) 20min。 11 一抗孵育(PBS配，滴度1:200，湿盒)4OC 过夜或37OC 60 min。阴性对照最好用一抗来源血清，否则用PBS液 12 PBS清洗标本 3次 各 5 min。 13 二抗工作液孵育(湿盒) 37OC 30 min。 各 5 min。 14 PBS清洗标本 3次 O 15 C液(湿盒) 37C30 min。 16PBS清洗标本 3次 各 5 min。 17DAB显色(避光，镜下观察至棕色 ) 约3~10min。 18蒸馏水洗 2次 1 min。 19苏木素复染 0.5~1min。 20自来水洗 30min。 21树胶封片。 注意事项: 1、良好的细胞爬片是进行免疫组织细胞的基础，要获得良好细胞爬片须注意以下: (1) 对于粘附分子较少的细胞爬片时间要达5天以上，这样细胞爬片才较牢固，冲洗时不易脱片; 4(2) 接种的细胞密度适中，以2*10/ml为宜，若细胞密度太高，5天后细胞连接成片冲洗时易脱片; O2、冰丙酮固定后玻片可密闭保存于4C冰箱，冰丙酮固定时会使细胞收缩，可用80%冰丙酮或2%多聚甲醛固定。 3、冲洗时只须轻轻振荡培养皿，(不可用吸管太用力吹，易脱片) 4、加一抗、二抗后冲洗时第一次须将玻片倾斜 5、Triton X-100(屈立通)面活性剂，脱去细胞膜中最主要的成分脂质，对于抗原表达在胞浆或胞核者方使用，对于抗原表达在胞浆者时间要控制好，使其破坏细胞膜而核膜破坏较少。