基因芯片技术及其应用.doc

勤读力耕 立己达人 1 基因芯片技术及其应用 摘要: DNA芯片技术是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸，或者直接将大量的DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析，即可获得样品的遗传信息。由于常用计算机硅芯片作为固相支持物，所以称为DNA芯片。 关键词 DNA芯片 制备 检测 应用 随着人类基因组的逐步实施以及分子生物学相关学科的迅猛发展，越来越多的动植物、微生物基因组测序得以测定，基因序列数据正在以前所未有的速度迅速增长。DNA芯片的出现是科学发展的必然产物。本文就DNA芯片的制备及其在医学领域的应用予以阐述。 1 基因芯片的制备及检测技术[1-4] 1.1 基因芯片的制备方法 1.1.1 原位合成法 其中最具代表的是原位光刻合成法。该法是利用分子生物学、微电光刻技术及计算机技术等直接在基片上合成所需的DNA探针。除原位光刻合成法外，原位合成法还包括原位喷印合成和分子印章在片合成法。 1.1.2 直接点样法 该法是将制备好的DNA(cDNA)片段直接点在芯片上。近来有人提出用电定位捕获法和选择性沉淀法制备芯片。 1.1.3 电定位捕获法 是将生物素标记的探针在电场的作用下快速地固定在含有链霉素亲和素的琼脂糖凝胶膜上。由于生物素与链霉素亲和素的强亲合力，使得探针的固定更加容易和牢固。在电场的作用下，靶基因能快速地在杂交部位积聚，大大缩短了杂交时间，提高了杂交的效率，且改变电场电极的方向可以除去未杂交或低效率杂交的靶基因。 1.1.4 选择性沉淀法 该技术是用金属纳米粒标记探针的方法来制备微阵列，靶基因在芯片上与探针杂交后发生选择性沉淀，通过检测沉淀物的电化学值等来获取相应的生物信息。 勤读力耕 立己达人 2 1.2 样品的标记 标记的方法有同位素标记、生物素标记、荧光标记等，目前普遍采用的是荧光标记法。随着纳米技术的发展，用纳米金标记探针，显示了比荧光标记更加灵敏的优势。 1.3 基因芯片的杂交 芯片杂交条件的优化主要根据探针的类型、长度以及研究目的来确定。如用于基因表达检测时，杂交条件选择为高样品浓度、低盐、低温和长时间，严谨性要求较低;若用于基因突变检测，则杂交时间需短时、高盐和高温条件下高严谨性杂交。为克服影响杂交的诸多不利因素，有人利用肽核酸(PNA)制备基因芯片。PNA是一类以中性酰胺为骨架的DNA类似物，与DNA亲合力强，形成的PNA,DNA对盐离子浓度和温度的依赖性降低，提高了检测的特异性和灵敏度。 1.4 信号的检测 当芯片杂交完毕之后，需要对信号进行收集和分析。使用的标记物不同，相应的检测方法也各异。由于普遍使用荧光物标记，故荧光芯片扫描仪种类也就最多，主要包括激光扫描荧光显微镜，激光共聚焦扫描显微镜，CCD相机改进的荧光显微镜，DNA芯片直接制作在光纤维束切面上并结合荧光显微镜的光纤传感器。 2 基因芯片的应用[1-6] 2.1 基因表达的分析 [1]自Stanford大学的Schena M等首次发表了用DNA微阵列研究基因表达的论文后，基因芯片用于研究基因表达成为近年来研究的热门课题。Watarus G等利用cDNA芯片比较了胚滋养细胞与非滋养细胞中转录调控因子的表达差异，揭示了转录调控因子在胚胎发生过程中不同时期的表达及在胚滋养细胞中的多种 勤读力耕 立己达人 3 功能;Keith M S等用含40 000条基因及ESTs的cDNA芯片研究了巨细胞瘤形成的基因表达，确定了OPGL(Osteoprotegrin Ligand)在巨细胞瘤形成中所起的重要作用，为研究巨细胞瘤形成及确定抗瘤药靶提供了依据。 2.2 基因多态性(SNPs)分析及突变检测 近年来利用芯片检测SNPs及突变的报道层出不穷，Chee M等用含有135 000条探针的基因芯片检测了16.6 kb的人类线粒体基因组，在所分析的10个样品中检出了505个SNPs，对每个样品的检测可在12 min内完成，正确率达99%; [2]宋沁馨等采用芯片电泳技术检测了人抑癌基因P53外显子8上的突变，测定了不同比例突变率的混合样本，所有样本可在100 内被检出。 2.3 菌种类鉴定及耐药性监测 核糖体基因(rDNA)在细菌进化过程中保持相对的保守性，被誉为分子分类学上的“金指标”，制备种类鉴定芯片时常选rDNA为探针制作的依据。Anthony R M等用PCR扩增细菌23S rDNA，与芯片杂交后在4 h内快速诊断菌血症，与常规 [3]培养检测法相比，准确率达77.8%;翟俊辉等制备了包括大肠杆菌、伤寒沙门氏菌等20种细菌的16 S rDNA芯片，用于检测临床常见感染性细菌。 芯片除了可用于细菌种类鉴定外，在耐药性检测方面也显示出潜力。Troesh [4]A等用含结核分支杆菌16 S rDNA和rpoB的芯片，同时进行了分支杆菌种类鉴别和对利福平耐药性的检测;Lorelei W等在同一张基因芯片上原位扩增和检测了能代表细菌种类特异性的基因，大肠杆菌gyrA、沙门氏菌gyrA、弯曲杆菌gyrA、葡萄球菌mecA和衣原体隐蔽性质粒。该芯片不仅可以鉴定细菌种类而且 [5]可以检测耐FQNS细菌gyrA的突变;Douglas R C等用17种tet基因，内酰胺酶bla-TEM-1，16 S rDNA片段制备的DNA探针芯片，正确地检测了39株耐四环素细菌的tet基因; Zhou W等报道了用基因芯片检测奈瑟氏球菌gyrA和ParC基因的突变，该芯片可同时检测耐药菌gyrA在Ser 91，Asp95位发生的双突变，以及在gyrA双突变基础上ParC Glu91，Ser97这两个位点也同时发生突变的情 勤读力耕 立己达人 4 况;蒋红霞等报道用寡核苷酸芯片检测了大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及鸡毒支原体等3种病原菌gyrA基因83位和87位发生的突变。 2.4 药理学及毒理学研究 基因芯片技术一个重要且具有很高应用价值的发展，就是为新药筛选、毒理 [6]学研究提供了一个新的技术平台。Heller R A等首次用cDNA芯片检测了炎症发生时基因的表达情况，观察了在抗炎药作用下基因的表达差异;Makajima T等报道用基因芯片来研究受体和离子通道，在20 000个转录子中，筛选出51个用于合成受体和离子通道的粒细胞亚型——选择性转录子，其中6个是属于碱性粒细胞选择的和/或酸性粒细胞选择的，且指出这6个转录子对应的受体或离子通道可能是抗过敏药物在体内的潜在性药靶;Kume E 等用毒理芯片观察了链唑霉素(SZ)对肝的毒性作用，结果表明所涉及的上调基因是与细胞分裂/凋亡，免疫/过敏反应，压力反应/异源物质代谢等功能相关的，下调基因与糖、脂肪、蛋白质代谢相关;Reghavendra P H S等用毒理芯片观察了暴露在河豚毒素下的神经胶质细胞中与神经退行性变化相关的基因表达情况，指出河豚毒素可能通过其中一些基因表达的改变而发挥毒性作用。 2.5 在白血病研究中的应用 Golub等认为应用基因芯片技术进行白血病分型具有简便、准确、特异性高等优点。1999年他们设计了一种含6817个人类基因的芯片，用来自38份急性白血病患者的骨髓样本，分别测其基因表达谱和AML、ALL的相关性，测定后得到大量相关数据，包括形态学、免疫学、细胞遗传学等各种指标，从而建立一个基因表达谱与AML和ALL的数据库。又从这1100个基因中选择了50个与AML、ALL相关度更高的基因，与38份病例样本杂交，36例分型诊断与临床诊断完全一致，其余2例不能明确分型。另外又对34例初治白血病患者进行了分型诊断，29例诊断正确。 用于检测白血病亚型的DNA芯片的问世给临床带来极大方便，是对MIC分型的补充和发展。有一例患者有典型的白血病症状，但是形态学检查不典型，据 勤读力耕 立己达人 5 相关实验检测诊断为急性髓系白血病(AML)。治疗几个月后，未见好转，怀疑诊断有误，应用此种芯片与患者骨髓细胞 cDNA进行杂交反应，结果显示AML及ALL相关基因表达均较低，排除了患AML的可能性，而在数据分析中发现其基因表达图谱与腺泡样横纹肌肉瘤相关基因有极高的相关性，从而确诊为平滑肌肉瘤，治疗方案改变后病情很快缓解。 2.6 在恶性淋巴瘤研究中的应用 弥漫性大B细胞性淋巴瘤(DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤中最常见的一种亚型，在临床上有明显的异质性，其中只有40%患者化疗效果好且无病生存期长，而其 [7]余预后较差。Alizadeh等认为上述情况反映了DLBCL的异质性，即基因表达图谱的差异。他们用含17865个基因的DNA芯片对DLBCL、滤泡性淋巴瘤(FL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、正常人的外周血、淋巴结、扁桃体等的T、B淋巴细胞相关基因表达图谱进行研究。将DLBCL分为两类，一类为原始中心B细胞样DLBCL(GCB-like DLBCL)，另一类为激活的B细胞样DLBCL (Activated B-like DLBCL)，它们有不同的基因表达谱，反映不同的细胞发育阶段。根据上述发现分析了42例DLBCL疗效及预后情况，所有患者均采用具有可比性的标准多药联合化疗方案治疗，两者总生存期和无病生存期均有显著差异(p<0.01)，GCB-like DLBCL的5年生存率为76%，而Activated B-like DLBCL仅为16%。因此利用基因谱分型对判断临床疗效和预后及发现新的肿瘤亚型有重要意义。 3.结语 尽管基因芯片技术在生命科学领域越来越受到广泛的关注和重视，但还有许多问题亟待解决，如降低芯片的制作成本，简化样品制备过程，提高检测过程的智能化，提高芯片灵敏度及特异性，以及方法的标准化等方面，还需不懈的努力和探索。相信随着技术的不断创新和日益成熟，基因芯片技术会像微电子产品一样对人类社会产生重大而深远的影响。 勤读力耕 立己达人 6 1.Schena M, Shalon D, Dais RW, et al. Quantitative monitoring of gene expression with a complementary DNA microarray[J]. Science, 1995, 270 (2):467-470. 2. 翟俊辉，杨瑞馥，宋亚军，等(一种用于临床细菌检测的生物芯片:中国，03100675.2.2004 8 11. 3. .SNP 测定结合芯片电泳法快速鉴别人参和西洋参(宋沁馨等)《药物分析杂志》CD69 的 表达在小鼠嗜酸细胞的活化与凋亡中的作用 4. TROESH A , NGU YEN H , MIYADA G C. Mycobacterium spe2cies identification andrifampin resistance testing with high2density DNA prod arrays[J ] . J Clin Microbiol , 1999 , 37 (1) : 49 - 55. 5.Douglas R C, Darrell P C, Fred B. Fabrication of DNA microarray using unmodified oligonucleot ide probes. Bio Techniques, 2001, 30( 2) : 368~ 379 6. Heller RA,Sehena M,Chai A,et al. Proceedings of the National Academy of Science USA, 1991,94:2150~2155 7.Alizadeh AA，Eisen MB，Davis RE，et al.Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling[J].Nature, 2000,403:503-511.